113 年 國立中山大學生物科學系碩士班《生物化學及分子生物學》

本題主要在考察學生對於 CRISPR/Cas9 基因編輯系統的理解，包括其基本組成、作用機制以及如何誘導基因突變。

CRISPR/Cas9 系統簡介
CRISPR/Cas9 是一種源自細菌的適應性免疫系統，已被改造為強大的基因編輯工具。它主要由兩個關鍵組件構成：

1. Cas9 蛋白質 (Cas9 protein)：這是一種核酸酶 (nuclease)，能夠切割雙股 DNA (dsDNA)。
2. 單股導引 RNA (single guide RNA, sgRNA)：這是一個人工設計的 RNA 分子，包含兩個部分：
   • CRISPR RNA (crRNA) 部分：約 20 個核苷酸，具有與目標 DNA 序列互補的序列，負責將 Cas9 蛋白質引導至特定的 DNA 位點。
   • 反式激活 CRISPR 轉錄因子 RNA (tracrRNA) 部分：負責與 Cas9 蛋白質結合，使其保持穩定並進入切割活性狀態。

CRISPR/Cas9 如何作用
CRISPR/Cas9 系統的作用機制如下：

1. 目標識別：sgRNA 中的 crRNA 部分會尋找並與細胞內目標 DNA 序列中與其互補的區域進行鹼基配對。
2. PAM 序列識別：Cas9 蛋白質在切割 DNA 前，還需要識別一個短的 DNA 序列，稱為鄰近基序 (Protospacer Adjacent Motif, PAM)。PAM 序列通常是 5'-NGG-3' (N 代表任何鹼基)，位於目標 DNA 序列的下游。PAM 序列是 Cas9 能夠結合並切割 DNA 的必要條件。
3. DNA 切割：一旦 Cas9 蛋白質被 sgRNA 引導至正確的 DNA 位點，並且 PAM 序列也被識別，Cas9 蛋白質就會在目標位點的上下游切割雙股 DNA，產生雙股斷裂 (Double-Strand Break, DSB)。

CRISPR/Cas9 如何引起突變
CRISPR/Cas9 系統誘導突變的主要方式是利用細胞自身的 DNA 修復機制來處理 Cas9 產生的雙股斷裂 (DSB)。細胞有兩種主要的 DNA 修復途徑：

1. 非同源末端連接 (Non-Homologous End Joining, NHEJ)：

本題旨在評估學生對於基因定位、克隆以及基因功能驗證的策略性思考能力，特別是針對一個特定表型的研究。

研究策略：基因定位與克隆
當我們發現一個具有特定表型（例如短尾）的突變體時，我們的目標是找到導致此表型的基因。這通常涉及以下幾個步驟：

第一階段：基因定位 (Gene Mapping)

1. 建立突變體株系並進行回交 (Backcrossing)：

   • 首先，需要建立一個穩定的突變體株系。
   • 為了進行遺傳定位，通常需要將突變體與野生型小鼠進行回交。例如，將突變體小鼠與野生型小鼠雜交，得到 F1 代。
   • 然後，將 F1 代小鼠與突變體小鼠進行回交（或與另一近交系進行回交），得到回交世代 (N2 或 BC1)。在這個世代中，突變基因會與野生型等位基因分離，同時，來自兩個親本的非目標基因組區域也會發生重組。
   • 這樣做的目的是在一個穩定的遺傳背景下，將目標突變基因與其他基因組區域解離。

2. 分子標記分析 (Molecular Marker Analysis)：

   • 分析回交世代中的個體，篩選出同時表現短尾表型（攜帶突變基因）和特定基因型（例如，攜帶來自野生型親本的某個 DNA 片段）的個體。
   • 使用微衛星標記 (microsatellite markers)、單核苷酸多態性 (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 或其他分子標記，覆蓋整個基因組。
   • 透過連鎖分析 (linkage analysis)，找出哪些分子標記與短尾表型緊密連鎖（即在表現短尾的個體中，這些標記的基因型始終一致）。
   • 連鎖程度越緊密，表示該標記越接近我們尋找的突變基因。通過在基因組上繪製標記圖譜，可以將突變基因定位到一個較小的區域（稱為「定位區域」或「候選區域」）。

第二階段：候選基因篩選與克隆 (Candidate Gene Screening and Cloning)

1. 精細定位 (Fine Mapping)：
   • 在定位區域內，使用密度更高的標記，進一步縮小突變基因所在的範圍。這可能需要產生更多的回交世代個體或使用其他策略（如重組個體分析）。
   • 一旦將基因定位到一個非常小的區域（可能包含幾個基因），就可以開始篩選該區域內的候選基因。

本題考察學生對脂蛋白在血液脂質代謝中的作用、分類及其功能機制的理解。

脂蛋白在血液脂質代謝中的作用
脂質（如膽固醇、三酸甘油酯）在水中溶解度很低，無法直接在血液（水性環境）中運輸。脂蛋白 (lipoproteins) 是一種複雜的顆粒，由脂質核心（三酸甘油酯和膽固醇酯）和外層的兩性分子（磷脂、游離膽固醇和蛋白質，即載脂蛋白 apolipoproteins）組成。它們的作用是將親脂性的脂質從吸收或合成的部位運輸到身體各組織細胞，並將多餘的脂質運回肝臟代謝。因此，脂蛋白是血液脂質運輸的關鍵載體。

脂蛋白的分類
脂蛋白根據其密度（與脂質和蛋白質的比例有關）和大小進行分類。密度越低，脂質含量越高，蛋白質含量越低。主要的脂蛋白類別包括：

1. 乳糜微粒 (Chylomicrons)：

   • 密度最低，體積最大。
   • 主要由飲食攝取的脂質（三酸甘油酯和膽固醇）組成。
   • 在小腸吸收脂質後合成，主要負責將外源性（來自食物）的三酸甘油酯運輸到全身的脂肪組織和肌肉。

2. 極低密度脂蛋白 (Very-low-density lipoproteins, VLDL)：

   • 密度較低，體積較小。
   • 主要由肝臟合成，負責將肝臟內合成的三酸甘油酯運輸到全身組織。
   • 在血液中，VLDL 會逐漸失去三酸甘油酯，轉變為中間密度脂蛋白 (IDL) 和低密度脂蛋白 (LDL)。

3. 中間密度脂蛋白 (Intermediate-density lipoproteins, IDL)：

   • VLDL 失去部分三酸甘油酯後形成，是 VLDL 和 LDL 之間的過渡形式。
   • 部分 IDL 會被肝臟攝取，部分則進一步轉變為 LDL。

4. 低密度脂蛋白 (Low-density lipoproteins, LDL)：

   • 密度較高，體積較小。
   • 主要由肝臟合成，是 VLDL 轉變而來的終產物。
   • LDL 是將膽固醇（主要是膽固醇酯）從肝臟運輸到全身細胞的主要載體。因此，LDL 常被稱為「壞膽固醇」，因為過高的 LDL 水平與動脈粥樣硬化有關。

5. 高密度脂蛋白 (High-density lipoproteins, HDL)：

   • 密度最高，體積最小。
   • 主要由肝臟和腸道合成，並在血液中合成。
   • HDL 的主要功能是逆向膽固醇運輸 (Reverse Cholesterol Transport, RCT)，即從外周組織（如動脈壁）將多餘的膽固醇運回肝臟進行代謝或排出。因此，HDL 常被稱為「好膽固醇」。

脂蛋白運送脂質的功能機制
脂蛋白的運送功能主要依賴於其表面的載脂蛋白 (apolipoproteins)。載脂蛋白有多種功能：

• 結構維持：提供脂蛋白顆粒的結構穩定性。
• 受體結合：作為配體，與細胞表面的特定脂蛋白受體結合，從而將脂蛋白靶向特定的組織或細胞。

本題旨在考察學生對粒線體內膜結構與功能，以及氧化磷酸化過程中 ATP 生成機制和關鍵酶複合物的理解。

粒線體內膜結構與 ATP 生成的關係
粒線體內膜 (inner mitochondrial membrane) 的結構對於 ATP 的生成至關重要，主要體現在以下幾個方面：

1. 高度摺疊 (Cristae)：內膜向內形成大量的摺疊結構，稱為嵴 (cristae)。這些摺疊極大地增加了內膜的表面積，從而容納了大量的電子傳遞鏈 (electron transport chain, ETC) 和 ATP 合成酶 (ATP synthase) 複合物。更大的表面積意味著更高的 ATP 生產潛力。
2. 選擇性通透性 (Selectively Permeable)：內膜對大多數離子和極性分子具有高度不通透性，但對某些特定分子（如氧氣）和通過特定轉運蛋白的物質（如 ADP、Pi、ATP）具有通透性。這種選擇性通透性是維持質子梯度 (proton gradient) 的基礎。
3. 質子泵功能 (Proton Pumping)：電子傳遞鏈的幾個複合物（I, III, IV）能夠將電子從高能電子載體（NADH, FADH2）傳遞出去，同時將質子 (H+) 從粒線體基質 (mitochondrial matrix) 泵入膜間隙 (intermembrane space)。
4. 化學滲透偶聯 (Chemiosmotic Coupling)：內膜上整合了電子傳遞鏈和 ATP 合成酶。電子傳遞鏈產生的質子梯度（膜間隙的 H+ 濃度高，pH 低；基質的 H+ 濃度低，pH 高）在內膜上形成電化學勢能。ATP 合成酶利用這個質子梯度驅動質子順濃度梯度流回基質，這個過程稱為化學滲透，其能量被用來合成 ATP。

氧化磷酸化中的主要酶和複合物
氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation) 是粒線體通過氧化呼吸底物（NADH 和 FADH2）的電子來合成 ATP 的過程。它主要包括電子傳遞鏈和 ATP 合成酶。

電子傳遞鏈 (Electron Transport Chain, ETC)
ETC 由一系列蛋白質複合物組成，位於粒線體內膜上，負責將電子從 NADH 和 FADH2 傳遞給最終的電子受體——氧氣 (O2)。電子傳遞過程中釋放的能量被用於將質子從基質泵入膜間隙，建立質子梯度。

1. 複合物 I (NADH 脫氫酶, NADH dehydrogenase)：

   • 接收來自 NADH 的電子，將其傳遞給泛醌 (ubiquinone, Q)。
   • 同時，將 4 個質子從基質泵入膜間隙。
   • 反應：$\text{NADH} + \text{H}^+ + \text{Q} \rightarrow \text{NAD}^+ + \text{QH}_2$

2. 複合物 II (琥珀酸脫氫酶, Succinate dehydrogenase)：

   • 接收來自琥珀酸 (succinate) 的電子，將其傳遞給泛醌 (Q)。琥珀酸脫氫酶也是檸檬酸循環 (citric acid cycle) 的一部分。
   • 不泵送質子。
   • 反應：$\text{Succinate} + \text{Q} \rightarrow \text{Fumarate} + \text{QH}_2$

3. 泛醌 (Ubiquinone, Q)：

   • 是一種脂溶性的電子載體，能夠在內膜中自由移動，將電子從複合物 I 和 II 傳遞給複合物 III。

4. 複合物 III (細胞色素 b-c1 複合物, Cytochrome b-c1 complex)：

   • 接收來自泛醇 (QH2) 的電子，將其傳遞給細胞色素 c (cytochrome c)。
   • 將 4 個質子從基質泵入膜間隙。

本題旨在考察學生對 Warburg 效應的定義及其與癌細胞代謝異常的關聯性的理解。

Warburg 效應的定義
Warburg 效應（Warburg effect），也稱為有氧糖酵解（aerobic glycolysis），是由德國生物化學家 Otto Warburg 在 20 世紀 20-30 年代提出的。它描述了一個觀察結果：與正常細胞相比，癌細胞即使在有氧氣存在的情況下，也傾向於優先利用糖酵解途徑來產生 ATP，而不是通過粒線體進行氧化磷酸化。

正常細胞在有氧條件下，主要通過糖酵解將葡萄糖分解為丙酮酸，然後丙酮酸進入粒線體，通過檸檬酸循環和氧化磷酸化產生大量的 ATP (約 30-32 個 ATP 分子/葡萄糖)。而在無氧條件下，糖酵解才成為主要的 ATP 來源，並產生乳酸。

然而，癌細胞即使在氧氣充足的環境下，也會將大部分的葡萄糖通過糖酵解轉化為乳酸，而不是將丙酮酸送入粒線體。這種現象就是 Warburg 效應。

Warburg 效應與癌細胞代謝的關聯性
Warburg 效應並非單純的 ATP 生成效率低下，而是癌細胞為了適應其快速增殖和惡性生長而演化出的代謝策略。其與癌細胞代謝的關聯性體現在以下幾個方面：

1. 提供生物合成前體 (Biosynthetic Precursors)：

   • 癌細胞需要快速分裂和生長，這需要大量的核苷酸、氨基酸、脂質等生物合成前體。
   • Warburg 效應通過增加糖酵解的代謝流量，使得更多的丙酮酸及其下游產物（如檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸等）被分流到細胞質或粒線體中，用於合成這些生物大分子。
   • 例如，糖酵解中間產物 3-磷酸甘油醛 (G3P) 和丙酮酸的代謝產物 α-酮戊二酸，是合成核苷酸和氨基酸的重要前體。
   • 即使 ATP 生成效率不如氧化磷酸化，但 Warburg 效應能更有效地為細胞的增殖提供生長所需的結構單元。

2. 維持氧化還原平衡 (Redox Balance)：

   • 糖酵解產生 NADH，而氧化磷酸化則消耗 NADH。
   • 在 Warburg 效應中，過量的 NADH 需要被氧化才能使糖酵解持續進行。通常，丙酮酸被還原為乳酸，同時將 NADH 氧化為 NAD+，從而再生 NAD+，保證糖酵解的順利進行。
   • 這種乳酸的產生和外排，有助於維持細胞內的氧化還原穩態。

本題主要考察學生對真核生物 mRNA 翻譯起始階段的詳細理解，包括所需的關鍵因子和分子事件。

真核生物 mRNA 翻譯起始 (Initiation of Eukaryotic mRNA Translation)
真核生物的翻譯起始是一個複雜且嚴格調控的過程，涉及多種起始因子 (initiation factors, eIFs) 和核醣體亞基 (ribosomal subunits)。其主要目的是將 40S 核醣體亞基準確地定位到 mRNA 的起始密碼子 (start codon) 上，並組裝成完整的 80S 核醣體起始複合物。

起始步驟詳解：

1. 形成 43S 起始小複合物 (Formation of the 43S Pre-initiation Complex)：

   • 起始 tRNA (initiator tRNA, Met-tRNAiMet)：攜帶第一個甲硫胺酸 (methionine) 的起始 tRNA (tRNAiMet) 是一個特殊的 tRNA，它與起始因子 eIF2 結合。
   • eIF2-GTP 複合物：起始因子 eIF2 在 GTP 的結合下，與 Met-tRNAiMet 形成一個三元複合物 (ternary complex)。GTP 的存在是 eIF2 結合 tRNA 的必要條件。
   • 40S 核醣體亞基：40S 核醣體亞基也與起始因子（如 eIF3）結合。eIF3 是一個大型蛋白質複合物，它能結合到 40S 亞基上，並有助於防止 40S 和 60S 亞基過早結合，同時也參與招募其他起始因子。
   • 43S 複合物的形成：eIF2-GTP-Met-tRNAiMet 三元複合物以及其他一些起始因子（如 eIF1, eIF1A）與 40S 核醣體亞基結合，形成 43S 起始小複合物。

2. mRNA 的結合 (mRNA Binding)：

   • eIF4F 複合物：mRNA 的 5' 端帽 (5' cap) 結構是真核生物翻譯起始的關鍵識別位點。eIF4F 複合物負責識別並結合 5' 帽。eIF4F 由三個主要亞基組成：
     • eIF4E：直接識別並結合 5' 帽結構。
     • eIF4G：是一個支架蛋白，與 eIF4E、eIF4A、PABP (Poly(A)-binding protein) 以及 eIF3 相互作用，將 5' 帽結構與 40S 核醣體亞基連接起來，形成一個環狀結構，有利於 mRNA 的掃描和翻譯的起始。
     • eIF4A：是一個 RNA 解旋酶 (RNA helicase)，負責解開 mRNA 的二級結構，幫助 40S 亞基掃描。
   • 43S 複合物與 mRNA 的結合：在 eIF4F 複合物的幫助下，43S 起始小複合物附著到 mRNA 的 5' 端。

3. 掃描 (Scanning)：

   • 一旦 43S 複合物結合到 mRNA 的 5' 端，它就會利用 eIF4A 的解旋酶活性，以及 eIF1 和 eIF1A 的作用，沿著 mRNA 的 5' 端向 3' 方向移動（掃描）。

本題考察學生在分子生物學和生物化學領域中，設計實驗來探測蛋白質之間相互作用的能力。

研究蛋白質相互作用的實驗設計
當我們對一個目標蛋白質（Protein X）感興趣，並想找出與它相互作用的其他蛋白質時，有幾種經典且常用的實驗方法。這裡介紹兩種主要的實驗策略。

實驗一：酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) 系統

核心原理：Y2H 是一種在酵母細胞內進行的體內 (in vivo) 篩選方法，它利用轉錄因子的激活域 (activation domain, AD) 和 DNA 結合域 (DNA-binding domain, DBD) 的分離來檢測蛋白質-蛋白質相互作用。如果兩個蛋白質（目標蛋白質 X 和潛在的相互作用蛋白質 Y）之間存在相互作用，它們就能將 AD 和 DBD 重新組裝在一起，從而激活一個報告基因（如 LacZ 或 HIS3）的表達，使酵母細胞能夠在特定的培養基上生長或產生可檢測的信號。

實驗步驟與設計：

1. 構建載體：

   • 載體 1 (DBD 載體)：將編碼 Protein X 的基因克隆到一個載體中，使其與 DBD 融合，形成一個 "X-DBD" 融合蛋白。當這個載體被轉入酵母細胞後，X-DBD 融合蛋白會結合到報告基因的啟動子區域（因為啟動子上有 DBD 結合位點），但由於沒有激活域，它無法啟動轉錄。
   • 載體 2 (AD 載體)：構建一個包含一個「潛在相互作用蛋白質庫」(library of potential interacting proteins) 的載體。每個載體都將編碼一個潛在相互作用蛋白質 Y，使其與 AD 融合，形成 "Y-AD" 融合蛋白。

2. 轉入酵母細胞：

   • 將 X-DBD 載體和包含蛋白質庫的 Y-AD 載體同時轉入酵母細胞。
   • 每個酵母細胞會接收到 X-DBD 載體和來自庫中的一個 Y-AD 載體。

3. 篩選：

   • 將轉染後的酵母細胞培養在一個選擇性培養基上。這個培養基設計成只有當報告基因被激活時，酵母細胞才能生長（例如，HIS3 基因表達使細胞能在缺乏組胺酸的培養基上生長；LacZ 基因表達可通過藍白篩選檢測）。
   • 如果 Protein X (通過 X-DBD) 與某個潛在相互作用蛋白質 Y (通過 Y-AD) 發生相互作用，它們的 AD 和 DBD 就能重新組裝，激活報告基因，使酵母細胞能夠在選擇性培養基上生長。

4. 驗證：

   • 從能夠生長的酵母菌落中，提取 Y-AD 載體，通過測序確認其中包含的 Y 基因。
   • 進行進一步的確認實驗，例如將純化的 Protein X 和純化的蛋白質 Y 在體外進行相互作用實驗，或者在哺乳動物細胞中進行共免疫沉澱實驗，以驗證它們的直接相互作用。

優點：高通量篩選，可以尋找未知相互作用蛋白質。
缺點：可能產生假陽性（蛋白質在細胞質或核仁中結合，但在酵母的核中不結合）和假陰性（某些蛋白質可能無法在酵母中正確摺疊或表達，或相互作用需要翻譯後修飾）。

實驗二：免疫沉澱 (Immunoprecipitation, IP) / 共免疫沉澱 (Co-Immunoprecipitation, Co-IP)

核心原理：Co-IP 是一種在細胞或組織裂解物中檢測蛋白質之間相互作用的實驗方法。其原理是利用一種特異性的抗體，將目標蛋白質（Protein X）及其結合的蛋白質從複雜的細胞裂解物中「沉澱」下來。然後通過 SDS-PAGE 和 Western Blotting 來檢測沉澱物中是否存在與 Protein X 結合的其他蛋白質。

實驗步驟與設計：

1. 細胞裂解：

   • 培養人類細胞，並確保 Protein X 正常表達。
   • 將細胞裂解（例如，使用溫和的裂解緩衝液，加入蛋白酶抑制劑），以獲得細胞裂解物。關鍵是要保持蛋白質之間的相互作用結構。

2. 免疫沉澱：

   • 選擇抗體：選擇一種對 Protein X 具有高特異性和親和力的抗體。