114 年 國立臺灣大學食品科技研究所甲組《食品微生物學》

此題主要在考察學生對於清酒發酵過程中，關鍵微生物（酵母菌和麴菌）的角色及其相互作用的理解。

解題要點：
清酒的釀造是一個複雜的發酵過程，主要由兩種微生物協同作用完成：麴菌（Aspergillus oryzae）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。

1. 麴菌 (Aspergillus oryzae)：

   • 角色：麴菌是清酒發酵的第一階段（製麴）的主要功臣。其主要功能是將米粒中的澱粉分解成可發酵的糖類（主要是葡萄糖），並將蛋白質分解成胜肽和胺基酸。
   • 作用機制：麴菌會分泌大量的酵素，最重要的是澱粉酶（如 α-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶）和蛋白質酶（如蛋白酶）。
     • 澱粉酶將米粒中的澱粉（多醣）分解成糊精，進一步分解成葡萄糖、麥芽糖等小分子糖。
     • 蛋白質酶將米粒中的蛋白質分解成胜肽和胺基酸。這些胺基酸不僅是酵母菌生長的營養來源，也是影響清酒風味（如鮮味）的重要成分。
   • 對酵母菌的影響：麴菌產生的糖是酵母菌進行酒精發酵的底物。同時，麴菌分解產生的胺基酸和胜肽也為酵母菌提供了必需的氮源和生長因子。

2. 酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)：

   • 角色：酵母菌是清酒發酵的第二階段（醪發酵）的主角，負責將麴菌產生的糖類轉化為酒精（乙醇）和二氧化碳，同時也產生許多影響清酒風味的副產物。
   • 作用機制：酵母菌進行無氧或微好氧的酒精發酵，將葡萄糖等糖類轉化為乙醇和二氧化碳。
     • $C_6H_{12}O_6 \rightarrow 2 C_2H_5OH + 2 CO_2$

此題考察學生對格蘭氏陽性菌與格蘭氏陰性菌細胞結構差異，以及這些差異如何影響它們對熱和低溫環境的抵抗力。

解題要點：
高溫處理（如巴氏殺菌）和低溫儲存（冷藏）是食品保鮮的常見方法，它們對不同類型細菌的影響存在差異，這主要與細菌的細胞結構有關。

1. 高溫處理對格蘭氏陽性菌效果顯著：
   • 細胞結構差異：格蘭氏陽性菌（Gram-positive bacteria）和格蘭氏陰性菌（Gram-negative bacteria）最主要的結構差異在於細胞壁。
     • 格蘭氏陽性菌：具有較厚的多層肽聚醣（peptidoglycan）層，且肽聚醣層位於細胞膜（cytoplasmic membrane）外側，沒有外膜（outer membrane）。
     • 格蘭氏陰性菌：具有較薄的單層肽聚醣層，且該層夾在細胞膜和外膜之間。外膜是格蘭氏陰性菌特有的結構，由脂多醣（Lipopolysaccharide, LPS）、脂蛋白（lipoprotein）和孔蛋白（porin）組成。
   • 高溫的影響：高溫（如 60-70°C）主要通過破壞蛋白質結構、使細胞膜通透性改變、以及加速細胞內化學反應導致損傷來殺滅微生物。
     • 對格蘭氏陽性菌：較厚、無外膜保護的肽聚醣層，以及相對暴露的細胞膜，使得高溫更容易直接作用於細胞膜的脂質雙層結構，破壞其完整性和功能，導致內容物外洩和細胞死亡。同時，高溫也更容易使細胞內的蛋白質變性失活。
     • 對格蘭氏陰性菌：外膜的存在提供了一層額外的屏障。這層外膜，特別是脂多醣層，可以阻擋或減緩熱量進入細胞內部，並且其結構本身對高溫的敏感性可能相對較低（相對於細胞膜）。

此題考察學生對於「預測微生物學」（Predictive Microbiology）的定義、目標，及其在「食品安全風險評估」（Food Safety Risk Assessment）中的應用和重要性。

解題要點：

1. 預測微生物學 (Predictive Microbiology)：

   • 定義：預測微生物學是一門利用數學模型來預測食品中微生物（包括致病菌、腐敗菌、產毒菌等）的生長、存活或失活的學科。
   • 目標：
     • 預測微生物在特定食品基質（如pH、水分活度aw、成分）和儲存條件（如溫度、氣體成分）下的行為。
     • 評估不同食品加工和儲存條件對微生物的影響。
     • 幫助食品工業做出更明智的決策，以確保食品安全和品質。
   • 模型類型：
     • 基於環境因素的模型 (Primary models)：描述微生物生長速率（如最大生長速率 $\mu_{max}$）或遲滯期（lag phase, $\lambda$）如何隨單一環境參數（如溫度）變化。
     • 基於食品基質的模型 (Secondary models)：描述微生物生長速率或遲滯期如何隨多個環境參數（如溫度、pH、aw）的組合變化。
     • 基於食品的因子模型 (Tertiary models)：將次級模型整合到一個軟體系統中，用於模擬和預測微生物在實際食品中的行為。

2. 食品安全風險評估 (Food Safety Risk Assessment)：

   • 定義：食品安全風險評估是一個系統性的過程，用於識別、評估和管理與食品中微生物、化學或物理危害相關的風險。
   • 四個步驟：
     • 危害識別 (Hazard Identification)：確定食品中存在的潛在危害（如沙門氏菌、李斯特菌）。
     • 危害特徵描述 (Hazard Characterization)：評估危害對人類健康的潛在影響，包括劑量-反應關係（dose-response relationship）。

此題主要考察學生對細菌和病毒在生物學特性上的基本差異，特別是它們的增殖（複製）方式，以及病毒如何依賴宿主細胞完成其生命週期。

解題要點：

1. 細菌 (Bacteria) 的增殖方式：

   • 獨立繁殖：細菌是單細胞的原核生物，具有完整的細胞結構（細胞壁、細胞膜、細胞質、核糖體、遺傳物質DNA等），能夠獨立進行新陳代謝和繁殖。
   • 二分裂法 (Binary Fission)：這是細菌最主要的無性繁殖方式。
     • 過程：
       1. DNA複製：細菌的環狀DNA複製，形成兩個相同的DNA分子。
       2. 細胞伸長：細胞開始伸長，兩個DNA分子分別移動到細胞的兩端。
       3. 隔膜形成：細胞中間開始形成隔膜（septum），將細胞質分隔開。
       4. 細胞分裂：隔膜完全形成後，一個母細胞分裂成兩個大小相似的子細胞，每個子細胞都含有一個完整的DNA分子和細胞器。
     • 速度：在適宜的環境條件下，細菌的二分裂速度非常快，有些種類可以在20分鐘內完成一次分裂。
   • 其他繁殖方式（較少見）：某些細菌還可能通過出芽生殖（budding）或形成孢子（spore formation，主要是休眠結構，非繁殖方式，但用於抵抗惡劣環境）。

2. 病毒 (Virus) 的增殖方式：

   • 非細胞結構：病毒不是細胞，它們沒有細胞器，沒有獨立的新陳代謝能力，無法自行合成蛋白質或產生能量。它們本質上是寄生的遺傳物質（DNA或RNA）被蛋白質外殼（capsid）包裹的結構。
   • 絕對細胞內寄生：病毒必須感染活的宿主細胞，並利用宿主細胞的代謝系統來完成其複製。它們不能獨立增殖。
   • 複製週期 (Replication Cycle)：病毒的增殖是一個複雜的過程，通常包括以下幾個階段：
     • 吸附 (Adsorption/Attachment)：病毒顆粒通過其表面結構（如蛋白質、醣蛋白）特異性地結合到宿主細胞表面的特定受體上。
     • 侵入 (Penetration/Entry)：病毒或其遺傳物質進入宿主細胞。進入方式多樣，如直接穿過細胞膜、通過胞吞作用、或病毒外殼與細胞膜融合後釋放遺傳物質。

此題旨在考察學生對食品中細菌抗逆機制，特別是針對氧化壓力（活性氧化物，ROS）和DNA損傷的抵禦能力的理解。需要學生能列舉並解釋這三種機制的具體例子。

解題要點：
食品加工中的殺菌技術（如熱處理、輻射、過氧化物、臭氧等）常常會產生活性氧化物（Reactive Oxygen Species, ROS），這些ROS會對細菌造成氧化壓力，損傷細胞成分，尤其是DNA。細菌為了生存，演化出多種防禦和修復機制。

1. 活性氧化物 (ROS) 的來源：

   • 內源性：細菌自身代謝過程（如呼吸鏈）的副產物。
   • 外源性：殺菌劑（如過氧化氫 H₂O₂、臭氧 O₃）、高溫、輻射、光化學反應等。
   • ROS的危害：ROS（如超氧陰離子 O₂⁻, 過氧化氫 H₂O₂, 羥基自由基 ·OH）能氧化蛋白質、脂質和核酸，導致細胞功能受損甚至死亡。

2. 細菌的壓力抵禦機制：

   • (1) 酵素型抗氧化機制 (Enzymatic Antioxidant Mechanisms)：

     • 核心概念：細菌利用特定的酶來催化分解或清除過量的ROS，從而減輕氧化損傷。
     • 代表性例子：
       • 過氧化氫酶 (Catalase)：
         • 運作原理：催化過氧化氫（H₂O₂）分解為水（H₂O）和氧氣（O₂）。
         • 反應式：$2 H_2O_2 \rightarrow 2 H_2O + O_2$
         • 功能：這是最重要且高效的清除H₂O₂的酶。當細菌暴露於H₂O₂時，過氧化氫酶能迅速將其分解，防止H₂O₂積累並對細胞造成氧化損傷。這是許多好氧菌和兼性厭氧菌都具備的防禦機制。
       • 過氧化物酶 (Peroxidase)：
         • 運作原理：利用還原劑（如NADH、輔酶A）將H₂O₂還原為水，自身被氧化。
         • 功能：也是清除H₂O₂的機制，但通常在H₂O₂濃度較低時更為重要，或作為過氧化氫酶的補充。
       • 超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase, SOD)：
         • 運作原理：催化超氧陰離子（O₂⁻）歧化反應，生成氧氣（O₂）和過氧化氫（H₂O₂）。
         • 反應式：$2 O_2^- + 2 H^+ \rightarrow H_2O_2 + O_2$
         • 功能：SOD是清除O₂⁻的第一道防線。雖然它產生了H₂O₂，但H₂O₂相對O₂⁻穩定且更容易被後續的過氧化氫酶或過氧化物酶清除。

   • (2) 非酵素型抗氧化機制 (Non-enzymatic Antioxidant Mechanisms)：

     • 核心概念：細菌利用細胞內的小分子抗氧化劑來中和ROS或修復氧化損傷。
     • 代表性例子：
       • 穀胱甘肽 (Glutathione, GSH)：
         • 運作原理：GSH是一種細胞內重要的還原劑，可以通過其巰基（-SH）直接與ROS（如·OH）反應，將其還原，自身被氧化成二硫化穀胱甘肽（GSSG）。GSSG可以通過穀胱甘肽還原酶（glutathione reductase）重新還原為GSH，形成一個循環。
         • 功能：直接清除自由基，保護細胞結構免受氧化。
       • 類胡蘿蔔素 (Carotenoids)：
         • 運作原理：這些色素分子具有共軛雙鍵結構，可以有效捕捉單線態氧（¹O₂）和自由基，起到淬滅（quenching）作用。
         • 功能：保護細胞膜脂質免受過氧化。
       • 維生素E (Tocopherols)：
         • 運作原理：脂溶性抗氧化劑，嵌入細胞膜中，捕捉脂質過氧化產生的自由基，中斷連鎖反應。

此題分為兩部分，第一部分考察學生對傳統醬油釀造過程、原料、風味形成微生物的掌握；第二部分則探討減鹽醬油帶來的潛在食品安全問題。

解題要點：

第一部分：傳統醬油的製程、原料、風味來源及參與微生物 (6%)

1. 原料：

   • 主要原料是大豆（或脫脂大豆）、小麥、食鹽和水。
   • 小麥通常會經過烘烤、粉碎處理。

2. 製程：
   醬油的製程主要分為兩個階段：

   • 製麴 (Koji Making)：
     • 將蒸煮（或浸泡後蒸煮）的大豆與粉碎後的小麥混合，接種特定的麴菌（主要是黃麴菌 Aspergillus oryzae，有時也用 Aspergillus sojae）。
     • 在適宜的溫度（約 30°C）和濕度下培養 3-5 天，使麴菌生長，產生豐富的酵素（澱粉酶、蛋白質酶、脂肪酶）。這個過程產生的產物稱為「醬油麴」。
   • 醬醪發酵 (Moromi Fermentation)：
     • 將醬油麴與高濃度的食鹽水（約 18-20% NaCl）混合，製成「醬醪」。
     • 醬醪在數個月到一年以上的時間內進行發酵。這個階段是風味形成和微生物作用最活躍的時期。
     • 發酵過程中，主要有乳酸菌（如 Pediococcus halophilus, Tetragenococcus halophilus）和酵母菌（如 Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii）的參與。
     • 發酵完成後，經過壓榨、過濾、殺菌、調味（如加糖、味精等）和裝瓶等步驟，製成成品醬油。

3. 風味來源：
   醬油的複雜風味來自於多種成分的協同作用，主要包括：

   • 胺基酸：由醬油麴中的蛋白質酶將大豆蛋白質分解產生，提供鮮味（umami）和基礎的鹹味。如麩胺酸。
   • 還原糖：由醬油麴中的澱粉酶將小麥澱粉分解產生，與胺基酸在高溫殺菌過程中發生梅納反應（Maillard reaction），產生豐富的褐色色素和烘烤、焦糖般的香氣。
   • 有機酸：如乳酸（由乳酸菌產生）、醋酸（少量產生）等，提供酸味，平衡風味，並有助於抑制雜菌。
   • 酯類、醇類、醛類等：由酵母菌和乳酸菌的代謝活動產生，貢獻複雜的香氣，如果香、酒香等。
   • 食鹽：提供基礎鹹味，抑制雜菌，並影響風味的感知。

4. 參與微生物：

   • 主發酵菌：
     • 麴菌 (Aspergillus spp.)：初期製麴階段，負責澱粉和蛋白質的水解。
     • 產鹽乳酸菌 (Halophilic Lactic Acid Bacteria)：如 Pediococcus halophilus, Tetragenococcus halophilus。它們能在高鹽環境下生長，將醬醪中的糖發酵產生乳酸，降低pH值，貢獻風味，並抑制雜菌。
     • 耐鹽酵母菌 (Halotolerant Yeasts)：如 Zygosaccharomyces rouxii。它們能在高鹽、高糖環境下進行酒精發酵，產生乙醇、酯類等，豐富醬油的香氣和風味。

此題考察學生對海鮮類食品中常見的食源性病原菌的認知，以及預防海鮮食物中毒的相關措施。

解題要點：

一、海鮮類食品中常見的病原菌種類

海鮮類食品（包括魚類、貝類、甲殼類等）因其生長環境（水體）、處理方式（生食或半生食比例高、加工過程可能受污染）以及營養豐富的特性，容易成為多種病原菌的載體。常見的病原菌包括：

1. 細菌 (Bacteria)：

   • 沙門氏菌 (Salmonella spp.)：常見於受糞便污染的水體，可污染貝類（如牡蠣）和魚類。感染後引起腸胃炎。
   • 李斯特菌 (Listeria monocytogenes)：廣泛存在於環境中，特別是水體和土壤。對冷藏溫度有較強耐受性，易污染即食海鮮產品。對孕婦、免疫低下者尤其危險，可引起敗血症、腦膜炎等。
   • 腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)：天然存在於海水和海產品中，特別是貝類。是引起海鮮食物中毒最常見的細菌之一，引起腹瀉、腹痛、嘔吐等症狀。
   • 創傷弧菌 (Vibrio vulnificus)：同樣存在於海水和海產品（特別是牡蠣）中。感染後除腸胃症狀外，還可引起嚴重的皮膚感染（壞死性筋膜炎）和敗血症，致死率高，尤其對有肝病史者。
   • 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)：通常是由處理海鮮的人員污染引起。其產生的腸毒素（enterotoxin）是引起食物中毒的原因，即使加熱也無法破壞毒素。
   • 產氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens)：常因不當的加熱和保溫（特別是大量烹煮後長時間保溫）引起污染和增殖，其產生的毒素可引起腹瀉和腹痛。
   • 霍亂弧菌 (Vibrio cholerae)：在受糞便污染的水體中存在，主要污染貝類。引起霍亂。

2. 病毒 (Viruses)：

   • 諾羅病毒 (Norovirus)：是引起病毒性腸胃炎的主要原因，也是海鮮（尤其是貝類，如牡蠣、蛤蜊）食物中毒的常見元兇。通常來源於受污染的水體或處理人員的污染。
   • 甲型肝炎病毒 (Hepatitis A Virus, HAV)：同樣來自受污染的水體，主要污染貝類。引起急性肝炎。

3. 寄生蟲 (Parasites)：

   • 海獸胃線蟲 (Anisakis spp.)：常見於某些魚類（如鮭魚、鱈魚、鯖魚）。生食或未煮熟的魚肉中含有蟲體，可能引起過敏反應或腸胃道症狀。
   • 肝吸蟲 (Clonorchis sinensis)、華枝睾吸蟲 (Opisthorchis spp.)：主要存在於淡水魚，但廣鹽性的種類也可能污染鹹淡水交界處的魚類。生食或未煮熟的淡水魚是感染源，引起肝膽系統疾病。

二、避免海鮮類食物中毒的措施

預防海鮮食物中毒需要從源頭（捕撈、養殖）到餐桌（處理、烹調、儲存）的整個鏈條進行控制。

此題要求學生從微生物學的角度解釋五個不同的名詞。這涵蓋了微生物的相互作用、代謝產物、滅菌概念、培養技術和調控機制。

解題要點：

1. Lactic antagonism (乳酸拮抗)：

   • 微生物學角度解釋：指某些乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）能夠產生抑制或殺滅其他微生物（包括其他細菌、酵母菌、黴菌，甚至某些致病菌）的物質，從而獲得生長優勢或保護其生存環境的現象。
   • 機制：
     • 產酸：乳酸菌將糖類發酵產生乳酸，降低環境pH值。許多微生物（特別是喜好中性pH的致病菌）在酸性環境中難以生長甚至死亡。
     • 產生抑菌物質：除了乳酸，某些乳酸菌還能產生其他抑菌性代謝產物，如過氧化氫（H₂O₂）、細菌素（bacteriocins，如 nisin）、乙醛、雙乙醯等。這些物質對其他微生物具有直接的殺滅或生長抑制作用。
   • 應用：在食品工業中，乳酸菌的拮抗作用被廣泛用於食品的天然防腐（如發酵食品、肉製品），以及作為益生菌的組成部分，以抑制腸道中的有害菌。

2. Postbiotics (後生元)：

   • 微生物學角度解釋：後生元是指益生菌（Probiotics）在發酵過程中，其自身細胞死亡或被裂解後，釋放到發酵基質中的非活體微生物代謝產物、細胞壁組分、細胞碎片或細胞溶解物。
   • 組成：主要包括有機酸（如乳酸、醋酸）、短鏈脂肪酸（SCFAs）、細菌素、多醣、胜肽、酶、維生素、核酸、細胞壁脂多醣（LPS）或肽聚醣等。
   • 功能：後生元被認為具有多種生物活性，可以調節宿主免疫系統、改善腸道屏障功能、抗炎、抗氧化、促進腸道健康，甚至影響代謝。它們的作用機制與益生菌不同，不需要活菌體，因此在某些應用上（如嬰幼兒配方奶粉、特殊醫學用途配方食品）可能比益生菌更安全或更易於穩定。
   • 與益生菌、益生元 (prebiotics) 的區別：益生菌是活的微生物；益生元是不能被人體消化吸收的膳食纖維，能選擇性地促進腸道益生菌的生長和活性；後生元則是益生菌的「代謝產物」或「失活的成分」。

3. 12D concept (12D 概念)：

   • 微生物學角度解釋：12D 概念是食品滅菌學（特別是罐頭食品的熱處理）中的一個重要指標，用於定義達到食品安全所需的最低熱處理參數。它代表一種熱處理條件，能夠將任何特定微生物（通常是指最耐熱的孢子形成菌，如產氣莢膜梭菌 Clostridium perfringens 或肉毒桿菌 Clostridium botulinum）的存活機率降低到百萬分之一（$10^{-6}$）的水平。
   • 定義：D值（Decimal Reduction Time）是指在特定溫度下，將某種微生物的數量減少十分之一（即 $10^1$ 倍）所需的時間。
   • 12D 的含義：12D 指的是經過 12 倍 D 值（$12 \times D$ 值）的熱處理。如果一個罐頭食品中原本含有 $N_0$ 個最耐熱的微生物孢子，經過 $12 \times D$ 時間的熱處理，其存活數 $N$ 將是 $N_0 \times 10^{-12}$。