109 年 國立中正大學生物醫學科學系分子生物碩士班《分子生物學》

此題考查蛋白質基本構成單位的胺基酸結構。胺基酸的側鏈（R group）決定了其化學性質。硫原子（Sulfur, S）主要存在於兩個胺基酸的側鏈中：半胱胺酸（Cysteine）和甲硫胺酸（Methionine）。題目中提供的選項，只有半胱胺酸含有硫。

此題考查 DNA 複製的機制，特別是雙股 DNA 在複製時，由於 DNA 聚合酶只能朝 5' 端合成新股，而兩股模板鏈是反向平行的，因此會產生連續與不連續的合成。
DNA 聚合酶（DNA polymerase）合成新 DNA 鏈的方向永遠是 5' $\to$ 3'。在複製叉（replication fork）處，兩條親代 DNA 模板鏈的方向是相反的。
一條模板鏈（3' $\to$ 5' 方向）可以讓新的 DNA 鏈以連續的方式（5' $\to$ 3' 方向）合成，這條新合成的鏈稱為前導鏈（Leading strand）。
另一條模板鏈（5' $\to$ 3' 方向）則必須以不連續的方式合成。

此題考查 DNA 複製的模式。DNA 複製的模式有幾種假說，但實驗證明 DNA 複製是半保留（semi-conservative）的。
(A) Continuous replication：意指新合成的 DNA 鏈是連續的，這與 DNA 複製實際情況不符，因為延遲鏈（lagging strand）的合成是不連續的。

此題考查 DNA 與 RNA 的結構差異。
(A) 這是正確的敘述。DNA 的鹼基包含腺嘌呤 (A)、鳥糞嘌呤 (G)、胞嘧啶 (C) 和胸腺嘧啶 (T)。RNA 的鹼基也包含 A、G、C，但 T 被尿嘧啶 (U) 取代。
(B) 這是錯誤的敘述。DNA 通常是雙股螺旋結構，而 RNA 通常是單股分子，儘管 RNA 單股分子可以形成局部雙股結構（如莖環結構）。
(C) 這是錯誤的敘述。

此題考查 E. coli DNA 複製中，負責合成 RNA 引子（primer）的蛋白質。
DNA 複製需要一個起始點，而 DNA 聚合酶無法從頭開始合成 DNA 鏈，它只能在現有的 3'-OH 末端添加核苷酸。因此，在 DNA 複製開始時，需要一個 RNA 引子來提供一個 3'-OH 末端。
在 E. coli 中，負責合成 RNA 引子的酶是 Primase，其基因名稱為 dnaG。

此題考查 DNA 聚合酶 I（DNA polymerase I）的催化活性，以及「校對」功能的性質。
DNA 聚合酶 I 在 DNA 複製和修復中扮演重要角色，它具有三種主要的活性：

1. 5' $\to$ 3' polymerase activity: 這是主要的合成活性，負責將核苷酸添加到新合成 DNA 鏈的 3' 端。

此題考查 E. coli DNA 聚合酶 III（DNA polymerase III holoenzyme）的結構與功能，特別是哪個亞基（subunit）負責增加其加工性（processivity）。
DNA 聚合酶 III 是 E. coli 中主要的 DNA 複製酶，它是一個複雜的多亞基蛋白質。其加工性是指酶在不脫離模板的情況下能持續合成 DNA 的能力。

此題考查 DNA 聚合酶的普遍特性。題目中沒有明確指出是哪種 DNA 聚合酶（例如 Pol I, Pol III, Pol II, Pol IV, Pol V），但一般討論 DNA 聚合酶時，常指 E. coli 中的主要複製酶 Pol III，或是具有代表性的 Pol I。
(A) Processive enzyme：大多數 DNA 聚合酶（尤其是 Pol III）都是高度加工性的，能夠長時間附著在 DNA 上合成長鏈。

此題考查核小體（nucleosome）的結構。核小體是染色質的基本結構單位，由 DNA 纏繞著蛋白質核心組成。
核小體的核心由八個組蛋白（histone）分子組成，稱為組蛋白八聚體（histone octamer），包括：

• 兩個 H2A 分子
• 兩個 H2B 分子
• 兩個 H3 分子
• 兩個 H4 分子

此題考查 E. coli DNA 複製過程中所需的蛋白質。
DNA 複製是一個複雜的過程，需要多種蛋白質協同作用。
(A) DNA helicase：例如 DnaB，負責解開 DNA 雙螺旋，為複製提供單股模板。這是必需的。
(B) Primase：例如 DnaG，負責合成 RNA 引子，為 DNA 聚合酶提供起始點。這是必需的。

此題考查 E. coli 中錯配修復（Mismatch Repair, MMR）系統中的蛋白質。錯配修復系統負責識別並修復 DNA 複製過程中由於鹼基錯誤配對而產生的錯誤。
MMR 系統中的關鍵蛋白質包括 MutS、MutL 和 MutH。

• MutS：是錯配識別蛋白。它能識別 DNA 鏈上的鹼基錯配或小插入/缺失（indels），並與之結合。
• MutL：作為一個連接器，它與 MutS 結合後，能進一步識別並結合到錯配位點附近的 DNA 上，並啟動下游的修復過程。

此題考查逆轉錄轉座子（Retrotransposons）的特徵性酶。逆轉錄轉座子是一類能夠通過 RNA 中間體進行複製和轉位的轉座子。
它們的複製過程涉及逆轉錄（reverse transcription），即將 RNA 序列逆轉錄回 DNA 序列。這個過程需要 Reverse Transcriptase（逆轉錄酶）來催化。

此題考查用於放大（amplifying）DNA 的分子生物學技術。
(A) PCR (Polymerase Chain Reaction)：聚合酶鏈式反應是一種體外擴增特定 DNA 片段的技術。它利用 DNA 聚合酶、引子和熱循環來指數級地增加目標 DNA 序列的拷貝數。這是用於放大 DNA 的標準技術。
(B) Western blotting：用於檢測和定量特定蛋白質的技術，通過抗體與蛋白質結合來識別。

此題考查 Chargaff's rules（查加夫法則）在 DNA 中的應用。查加夫法則指出，在雙股 DNA 中，腺嘌呤 (A) 的含量總是等於胸腺嘧啶 (T) 的含量，鳥糞嘌呤 (G) 的含量總是等於胞嘧啶 (C) 的含量。同時，(A+G) 的總含量約等於 (T+C) 的總含量，即嘌呤與嘧啶的比例約為 1:1。

此題考查同源重組（Homologous Recombination, HR）過程中涉及的蛋白質。同源重組是通過尋找與斷裂 DNA 序列相似的模板進行 DNA 修復或遺傳物質重組的過程。
(A) RecBCD：在 E. coli 中，RecBCD 複合體是處理 DNA 雙股斷裂（DSB）和單股末端的重要蛋白質。它能夠掃描 DNA 末端，並在特定位點（chi 位點）進行切割，然後載入 RecA 蛋白，啟動同源重組。

此題考查原核生物（prokaryote）RNA 聚合酶與啟動子（promoter）的結合。
原核生物的 RNA 聚合酶核心酶（core enzyme）由 $\alpha$、$\beta$、$\beta'$ 和 $\omega$ 亞基組成。而全酶（holoenzyme）則是在核心酶的基礎上結合了 $\sigma$ 因子（sigma factor）。
$\sigma$ 因子是原核生物 RNA 聚合酶識別啟動子區域的關鍵組分。它能識別啟動子中的特定 DNA 序列，例如 -10 區域（Pribnow box，常含有 TATAAT 序列）和 -35 區域（TTGACA 序列）。

此題考查 TBP（TATA box binding protein，TATA 盒結合蛋白）與 DNA 的結合方式。TBP 是真核生物轉錄起始複合物（transcription initiation complex）中的重要組分，它專一性地識別並結合啟動子區域的 TATA 盒。
TBP 與 TATA 盒的結合方式是通過與 DNA 的 小溝（minor groove） 相互作用，並引起 TATA 盒 DNA 結構的彎曲。

此題考查真核生物中不同類型 rRNA 的轉錄機制。真核生物有三種主要的 RNA 聚合酶，它們分別負責轉錄不同類型的 RNA：

• RNA polymerase I (Pol I)：主要轉錄核糖體 RNA (rRNA) 中的大部分組分，包括 18S, 5.8S, 和 28S rRNA（在哺乳動物中）。
• RNA polymerase II (Pol II)：主要轉錄信使 RNA (mRNA) 和一些小核 RNA (snRNA)，以及 microRNA (miRNA)。

此題考查 DNA 結合蛋白中常見的 DNA 結合結構域（DNA-binding motifs）。這些結構域能讓蛋白質與 DNA 序列進行特異性或非特異性結合。
(A) Zinc finger：鋅指結構是許多轉錄因子中常見的 DNA 結合結構域，它通過與鋅離子配位來穩定結構，並能在 DNA 的大溝中識別序列。

此題考查真核生物轉錄過程中，RNA 聚合酶 II 的 C 端結構域（CTD）的磷酸化。CTD 的磷酸化是啟動和延伸轉錄的關鍵調控事件。

• 轉錄起始（Initiation）階段：在起始階段，RNA 聚合酶 II 的 CTD 通常是未磷酸化或低磷酸化的。在啟動複合物形成後，TFIIH（ a general transcription factor）中的一個亞基（Kinase subunit, 稱為 CDK7）會磷酸化 CTD 的絲胺酸 5（Serine 5）。這個磷酸化標誌著從起始到延伸的轉變。
• 轉錄延伸（Elongation）階段：在延伸階段，CTD 的 Serine 5 磷酸化狀態會被移除，而 Serine 2（Serine 2）會被進一步磷酸化。

此題考查 Kozak 序列及其對真核生物翻譯效率的影響。Kozak 序列是真核生物 mRNA 上位於起始密碼子（AUG）周圍的一個核苷酸序列，它能增強翻譯起始的效率。
Kozak 序列的通用結構為：5'- (G/A)CC-AUG-G- (G/A) -3'。
其中，AUG 是起始密碼子，被定義為 +1 位點。

• AUG 前面的序列：最重要的是 -3 位點的鹼基，通常是 G 或 A；以及 -1 位點（緊鄰 AUG 前）的 C。
• AUG 後面的序列：最重要的是 +4 位點的鹼基，通常是 G。

此題考查 Group I 自催化剪接（Group I self-splicing）過程中釋放的內含子（intron）的形態。
Group I 自催化剪接是一種 RNA 分子自身的剪接機制，它不需要蛋白質輔助。在這個過程中，一個鳥苷（Guanosine）的 3'-OH 基團或 RNA 分子內部的 3'-OH 基團攻擊內含子-外顯子連接處的磷酸二酯鍵。
最終，內含子被釋放出來，其結構通常是一個 線性 的分子，其兩端有特殊的結構，但它不是一個環狀（circular）或 Lariat（套索狀）結構。

此題考查成熟的轉運 RNA（tRNA）的 3' 末端結構。所有成熟的 tRNA 分子，無論其對應的胺基酸是什麼，其 3' 末端都有一個共同的序列：CCA。
這個 CCA 序列是由一個特殊的酶（CCA-adding enzyme）在 tRNA 合成後添加的，它提供了胺基酸能夠連接的 3'-OH 末端。

此題考查真核生物 mRNA 前體剪接（splicing）過程中，小核 RNA（snRNA）之間的相互作用，特別是 U6 snRNA 的配對情況。
mRNA 剪接主要由剪接體（spliceosome）完成，剪接體是由多種小核核糖核蛋白（snRNPs）和蛋白質組成的複雜結構。主要的 snRNPs 包括 U1, U2, U4, U5, U6。

此題考查 $\lambda$ 噬菌體（$\lambda$ phage）的 cI 蛋白（lambda repressor）與其調節位點的結合能力。$\lambda$ 噬菌體的生命週期由其阻抑蛋白 cI 的作用來調控，cI 蛋白能結合到噬菌體基因組上的兩個操作子（operator）區域：OR（Operator Right）和 OL（Operator Left）。

• OR 區域 包含三個重複序列：OR1, OR2, OR3。cI 蛋白對這些位點的結合親和力不同。cI 蛋白最喜歡結合到 OR1，其次是 OR2，最不喜歡結合的是 OR3。這種差異性的結合能力是調控噬菌體進入裂解週期（lytic cycle）或潛伏週期（lysogenic cycle）的關鍵。

此題考查原核生物翻譯起始過程中，mRNA 的 Shine-Dalgarno 序列與核糖體 RNA（rRNA）的相互作用。
在原核生物中，mRNA 的 Shine-Dalgarno 序列（通常位於起始密碼子 AUG 上游約 6-8 個核苷酸處）與核糖體小亞基（30S）中的 16S rRNA 的 3' 末端序列（通常為 AGGAGG）發生鹼基互補配對。這種配對將 mRNA 正確定位在核糖體上，確保翻譯從正確的起始密碼子開始。

此題考查 microRNA (miRNA) 的生物合成途徑，特別是前體 miRNA (pre-miRNA) 到成熟 miRNA 的轉化過程。
miRNA 的合成是一個多步驟的過程：

1. 轉錄：從基因轉錄出初級轉錄本（pri-miRNA）。
2. 加工 pri-miRNA：在細胞核內，pri-miRNA 被一個蛋白質複合體（稱為 Microprocessor complex）加工。這個複合體包含 DGCR8（也稱為 Pasha）和 Drosha（一種 RNase III 型核酸酶）。Drosha 負責將 pri-miRNA 剪切成約 70 nt 的前體 miRNA（pre-miRNA），該結構具有一個莖環（stem-loop）結構。
3. 輸出到細胞質：pre-miRNA 被輸出到細胞質。

此題考查抗生素嘌呤黴素（puromycin）的抗翻譯機制。嘌呤黴素是一種結構類似於胺醯-tRNA（aminoacyl-tRNA）的抗生素。
它模仿了胺醯-tRNA 的 3' 末端結構，特別是胺基酸連接的部位。當嘌呤黴素進入核糖體 A 位點時，它會被核糖體肽酰轉移酶（peptidyl transferase activity，由 23S rRNA 催化）識別，並與核糖體 P 位點上的肽鏈形成肽鍵。然而，嘌呤黴素本身不含能繼續延伸肽鏈的部位，因此它會導致肽鏈提前終止合成，並從核糖體上脫落。

此題考查 RNA 編輯（RNA editing）的相關酶。RNA 編輯是指在轉錄後，通過改變 RNA 分子中的鹼基序列來修飾遺傳信息。
RNA 編輯的機制多樣，可能涉及鹼基的插入、刪除或轉化。
(A) endo-nuclease：內切核酸酶可以切割 RNA 分子內的磷酸二酯鍵，這在某些 RNA 編輯過程中是必需的，例如在編輯位點進行切割。
(B) terminal uridylyl transferase (TUTase)：這類酶將尿嘧啶核苷酸添加到 RNA 分子的 3' 末端。

此題考查檢測蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction, PPI）的技術。
(A) Yeast two-hybrid assay (酵母雙雜交實驗)：這是一種廣泛使用的體內（in vivo）方法，用於檢測 PPI。它基於轉錄因子與 DNA 結合域（DNA-binding domain, DBD）和激活域（activation domain, AD）的分離。

蛋白質的二級結構是指多肽鏈局部空間的規則排列，主要由氫鍵維持。最常見的兩種二級結構是：

1. $\alpha$-helix (α-螺旋)：多肽鏈沿軸向捲曲形成螺旋結構，類似於彈簧。

在 DNA 複製過程中，當解旋酶（helicase）解開雙螺旋時，複製叉前方的 DNA 會因為過度的纏繞而產生超螺旋（supercoiling）。這種超螺旋會阻礙解旋酶的移動，進而影響複製的進行。
負責移除這種過度超螺旋的酶是 DNA gyrase（DNA 促旋酶），它屬於拓撲異構酶 II（Topoisomerase II）的一類。

組蛋白（Histones）是與 DNA 結合形成核小體（nucleosome）的蛋白質，它們的 N 端尾巴（N-terminal tails）可以被多種化學修飾。這些修飾對染色質結構和基因表達的調控至關重要，被稱為組蛋白密碼（histone code）。
兩種最常見的組蛋白修飾類型是：

1. Acetylation (乙醯化)：在組蛋白的賴氨酸（lysine）殘基上添加乙醯基（-COCH₃）。組蛋白乙醯化通常與基因轉錄的激活（euchromatin）相關，因為它會中和賴氨酸的陽電荷，減弱組蛋白與帶負電荷的 DNA 之間的靜電吸引，使染色質結構變得鬆散。

V(D)J 重組是發生在免疫系統中的一種特殊的 DNA 重組機制，它負責生成免疫球蛋白（抗體）和 T 細胞受體（TCR）的多樣性。這個過程涉及蛋白質和 DNA 序列。
參與 V(D)J 重組的關鍵分子包括：

1. RAG1 (Recombination-Activating Gene 1) 和 RAG2 (Recombination-Activating Gene 2)：這兩個蛋白質是 V(D)J 重組的起始酶。RAG1/RAG2 複合體識別並結合到 V(D)J 重組信號序列（RSSs，Recombination Signal Sequences），這些 RSSs 是位於 V、D、J 基因片段旁邊的特定 DNA 序列。RAG1/RAG2 複合體催化 RSSs 的剪切，並在基因片段之間形成一個中間結構。

在酵母（Yeast）中，同源重組（Homologous Recombination, HR）通常由 DNA 雙股斷裂（Double-Strand Break, DSB）啟動。
啟動同源重組並創建 DSB 的主要分子是 SpRad50/Mre11/Xrs2 complex（在釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 中，或稱 MRX complex）。

原核生物的轉錄終止主要有兩種機制：

1. Rho-independent termination (ρ獨立終止)：也稱為內在終止（intrinsic termination）。這種機制依賴於一個特定的 DNA 序列，該序列在轉錄時會形成一個富含 G-C 的髮夾（hairpin）結構，緊隨其後的是一串 U。髮夾結構的形成會導致 RNA 聚合酶暫時停頓，而隨後的 U 序列與 DNA 模板鏈的 A 序列形成較弱的 A-U 鹼基配對。這種不穩定的配對不足以維持 RNA-DNA 雜合體，RNA 聚合酶會從 DNA 上脫落，終止轉錄。

真核生物 mRNA 的剪接（splicing）是一個將內含子（introns）從前體 mRNA 中移除，並將外顯子（exons）連接起來的過程。這個過程需要一個複雜的分子機器，稱為剪接體（spliceosome）。
剪接體主要由五種稱為小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs）的複合物構成，它們包含小核 RNA（small nuclear RNAs, snRNAs）和一系列蛋白質。
參與 mRNA 剪接的關鍵 snRNAs 包括：

• U1 snRNA

mRNA 的三聯體密碼子（codons）中有 64 種。其中 61 種密碼子編碼胺基酸，而另外 3 種則不編碼任何胺基酸，而是作為翻譯終止信號，稱為終止密碼子（stop codons）或無義密碼子（nonsense codons）。
這三個終止密碼子分別是：

eIF4F 是一個真核生物的翻譯起始因子複合物（eukaryotic translation initiation factor 4F complex），它在翻譯起始過程中起著關鍵作用，特別是負責識別 mRNA 的 5' 帽結構（m⁷GTP cap）並將 mRNA 載入核糖體。
eIF4F 複合物由三個主要組分組成：

1. eIF4E：這是複合物的核心，負責特異性識別 mRNA 的 5' 帽結構（m⁷GTP）。

核心觀念

本題在考「RNA 在生醫研究與諾貝爾生理學或醫學獎中的重要性」，重點不是背誦單一獎項，而是理解 RNA 可扮演的多重角色：

1. 作為病毒的遺傳物質。
2. 作為蛋白質合成的中間媒介。
3. 作為催化分子，例如核酶（ribozyme）。
4. 作為基因表現的調控分子，例如 RNA interference（RNAi）。
5. 作為疫苗與治療技術的核心，例如 mRNA vaccine。

本題出自民國 109 年考試，最直接對應的是 2020 年諾貝爾生理學或醫學獎，該獎授予 Harvey J. Alter、Michael Houghton 與 Charles M. Rice，以表彰他們發現 C 型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）。

解題方法

題目要求說明「RNA 與諾貝爾生理學或醫學獎的脈絡」，可依下列三個層次回答：

1. 先指出獲獎研究的疾病與醫學問題。
2. 再說明 RNA 病毒的發現與分子生物學證據。
3. 最後連結該發現對診斷、輸血安全與治療的影響。

2020 年諾貝爾生理學或醫學獎：C 型肝炎病毒的發現

一、研究背景：輸血後肝炎

在 C 型肝炎病毒被發現以前，醫學界已知輸血可能造成肝炎，但許多病例無法由已知的 A 型肝炎病毒或 B 型肝炎病毒解釋，因此稱為：

non-A, non-B hepatitis，非 A 非 B 型肝炎。

這類肝炎通常經由血液傳播，部分患者會轉變為慢性感染，最後造成：

• 肝纖維化與肝硬化；
• 肝功能衰竭；
• 肝細胞癌。

因此，找出造成非 A 非 B 型肝炎的病原體，是重要的公共衛生問題。

二、三位得獎者的主要貢獻

1. Harvey J. Alter：證明存在新的血液傳播病毒

Alter 研究輸血後肝炎患者的血液，發現即使排除 A 型與 B 型肝炎病毒，患者血清仍可使實驗動物或受試系統產生肝炎。

這證明血液中存在另一種尚未被辨識的病毒，後來即稱為 C 型肝炎病毒。

2. Michael Houghton：分離並鑑定 HCV 的遺傳物質

Houghton 與研究團隊利用分子生物學方法，從感染者血清中建立互補 DNA（complementary DNA, cDNA）文庫，最後找出屬於新病毒的核酸序列。

這些序列顯示 HCV 是一種 RNA 病毒，分類上屬於 Flaviviridae，即黃病毒科。

3. Charles M. Rice：證明該 RNA 可造成感染

僅找到一段 RNA 序列，尚不能完全證明它就是致病病毒。Rice 的研究進一步顯示，將具有完整感染能力的 HCV RNA 引入適當系統後，可以產生病毒複製與肝炎相關現象。

這完成了關鍵的因果證據：

HCV 的 RNA 分子生物學

HCV 是具有外套膜的單股正鏈 RNA 病毒（positive-sense single-stranded RNA virus）。

其基因組具有下列特徵：

• 約 $9.6$ kb；
• 單股正鏈 RNA 可直接作為 mRNA 使用；
• 5' 端具有內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site, IRES）；
• 主要編碼一條大型多蛋白（polyprotein）；
• 多蛋白經由病毒與宿主蛋白酶切割，形成結構蛋白與非結構蛋白。

HCV RNA 的基本流程可表示為：

非結構蛋白參與：

• RNA 複製；
• 病毒蛋白加工；
• 病毒顆粒組裝；
• 逃避免疫反應。

由於 RNA 依賴性 RNA 聚合酶缺乏高效率的校對能力，HCV 複製時容易產生突變，形成多樣的病毒變異株。這也是 HCV 容易造成慢性感染、且疫苗開發困難的重要原因之一。

為何 HCV 的發現與 RNA 密切相關

HCV 不是以 DNA 作為遺傳物質，而是以 RNA 儲存遺傳資訊。因此，研究者必須處理：

核心觀念

本題考查 大腸桿菌（E. coli）DNA 複製起始（initiation） 的分子機制，重點包括：

1. 複製起點 oriC 的辨識。
2. DnaA 蛋白造成 DNA 局部解旋。
3. DnaB 解旋酶與 DnaC 裝載蛋白的作用。
4. DnaG 引子酶合成 RNA primer。
5. 複製叉的形成與雙向複製開始。

大腸桿菌的染色體複製屬於 θ 型（theta replication），從單一複製起點 oriC 開始，形成兩個向相反方向前進的複製叉。

解題方法：依時間順序說明起始過程

1. DnaA 辨識 oriC

oriC 約長 $245$ 個鹼基對，包含多個 DnaA 結合序列：

• DnaA boxes：通常為 $9$ 個鹼基對的保守序列。
• 13-mer AT-rich repeats：富含 A、T 的區域，較容易被拉開。

細胞內具有 ATP 的 DnaA 稱為 DnaA–ATP，其活性高於 DnaA–ADP。當 DnaA–ATP 濃度達到起始門檻時，多個 DnaA 分子依序結合 oriC 的 DnaA boxes，並彼此寡聚化形成核蛋白複合體。

2. oriC 局部解旋

DnaA 複合體在 oriC 造成 DNA 彎曲與扭轉，使鄰近的 AT-rich 13-mer 區域先行解開，形成一小段單股 DNA。

此處的重點是：

• DnaA 負責 辨認複製起點並啟動局部開鏈。
• DnaA 本身不是主要負責延伸解旋的解旋酶。
• 真正持續沿 DNA 前進、擴大單股區域的是 DnaB。

DNA 的超螺旋張力也會影響開鏈，因此 DNA gyrase 等拓撲異構酶可協助消除複製起點附近累積的正超螺旋。

3. DnaC 將 DnaB 解旋酶裝載到 DNA 上

DnaB 是大腸桿菌的主要解旋酶，以六聚體形式存在。DnaB 與 DnaC 結合形成裝載複合體：

DnaC 的功能是將 DnaB 裝載到已經由 DnaA 打開的單股 DNA 上。由於 DNA 複製必須形成兩個相反方向的複製叉，兩個 DnaB 解旋酶會分別被裝載於複製起點兩側。

DnaB 裝載完成後，DnaC 進行 ATP 水解並離開，DnaB 轉變為可持續作用的解旋酶。DnaB 沿模板股以 $5' \to 3'$ 方向移動，將前方雙股 DNA 解開。

4. SSB 穩定單股 DNA

DnaB 解旋後會產生單股 DNA。暴露的單股 DNA 容易重新配對或形成髮夾結構，因此由 SSB（single-strand DNA-binding protein） 結合並穩定單股 DNA。

SSB 的功能包括：

• 防止兩條單股 DNA 重新退火。
• 防止單股 DNA 形成二級結構。
• 保持模板呈現適合 DNA polymerase 使用的狀態。
• 協助後續複製蛋白質組裝。

5. DnaB 招募 DnaG，合成 RNA primer

DnaB 解旋酶會與 DnaG primase（引子酶） 互相作用，形成起始複製所需的 primosome。

DNA polymerase 不能直接從零開始合成 DNA，只能從已有的 $3'$-OH 端延伸，因此必須先由 DnaG 合成短 RNA primer：

RNA primer 提供：

作為 DNA polymerase III 延伸 DNA 的起點。

在複製起始階段：

核心觀念

本題考查 大腸桿菌的鹼基切除修復（base-excision repair, BER）。BER 主要修復單一受損或不正常的鹼基，例如：

• 胞嘧啶自發脫胺形成的尿嘧啶（U）
• 氧化造成的 8-oxoguanine
• 烷基化鹼基
• 錯配中的異常鹼基
• DNA 鹼基失去後形成的 AP site（apurinic/apyrimidinic site）

BER 的核心特色是：先由 DNA glycosylase 移除受損鹼基，但保留糖－磷酸骨架；再切開、移除受損糖－磷酸殘基，最後補入正確核苷酸並封口。

整體反應可概括為：

解題方法

回答此題時，應依照 DNA 損傷被辨識、切除、加工、填補與封口的順序，說明各酵素的作用及產物變化。

1. DNA glycosylase 辨認受損鹼基

BER 的第一步由具有專一性的 DNA glycosylase 辨認受損鹼基。不同損傷由不同 glycosylase 處理，例如：

• Ung（uracil-DNA glycosylase）：移除 DNA 中的尿嘧啶。
• MutY：移除與 8-oxoguanine 錯配的腺嘌呤。
• Fpg（MutM）：主要移除氧化型鳥嘌呤，例如 8-oxoguanine。
• Endonuclease VIII（Nei）：處理部分氧化型嘧啶。
• AlkA：可辨認多種烷基化鹼基。

DNA glycosylase 水解受損鹼基與去氧核糖之間的 β-N-glycosidic bond，但不會立即切斷 DNA 的磷酸二酯骨架，因此產生沒有鹼基的 AP site。

可表示為：

此時糖－磷酸骨架仍然存在，但該位置的鹼基已經缺失。

部分 DNA glycosylase 同時具有 AP lyase 活性，能進一步切開 AP site 附近的磷酸二酯鍵；其他 glycosylase 則需要後續 AP endonuclease 處理。

2. AP endonuclease 切開 DNA 骨架

在大腸桿菌中，主要的 AP endonuclease 包括：

• Exonuclease III（ExoIII，基因為 xth）
• Endonuclease IV（EndoIV，基因為 nfo）

典型反應中，AP endonuclease 會切開 AP site 的 5′側磷酸二酯鍵，形成一個單股缺口（nick）。切開後產物通常為：

• 上游端：$3′$-OH
• 下游端：$5′$-deoxyribose phosphate（$5′$-dRP）

結構可簡化表示為：

其中 $5′$-dRP 是殘留的去氧核糖－磷酸基團，不能直接作為正常 DNA 合成的模板或末端，因此必須被移除。

若第一步由具有 AP lyase 活性的 glycosylase 直接切開，則可能產生 $3′$-端醛類衍生物；此異常 $3′$ 末端仍須經由其他 DNA 修復酵素加工成可延伸的 $3′$-OH。

3. 移除 $5′$-deoxyribose phosphate

在大腸桿菌的 BER 中，DNA polymerase I（Pol I） 具有重要的 $5′\rightarrow3′$ exonuclease 活性，可移除缺口 $5′$ 端的 $5′$-dRP 或其他受損核苷酸殘基。

這使 Pol I 能夠一邊移除受損末端，一邊以另一股完整 DNA 作為模板進行 DNA 合成。此種「移除前方受損片段、同時由後方補入新核苷酸」的作用，常稱為 nick translation。

4. DNA polymerase I 補入正確核苷酸

Pol I 利用未受損的互補股作為模板，並從缺口的 $3′$-OH 端開始，以 $5′\rightarrow3′$ 方向合成 DNA。

核心觀念

本題考查「無終止密碼子信使 RNA」（non-stop mRNA）的品質管制。Non-stop mRNA 是指 3′端缺乏正常終止密碼子 的 mRNA。核糖體翻譯至 mRNA 末端時，因無法完成正常的終止反應而停滯，必須同時處理：

1. 救援停滯的核糖體。
2. 降解異常 mRNA。
3. 清除尚未正常終止的異常多肽。

原核生物與真核生物採用的核心機制不同：

• 原核生物：以 tmRNA–SmpB 所介導的 trans-translation 為主。
• 真核生物：以 Pelota–Hbs1 等核糖體救援因子 搭配 5′→3′ 與 3′→5′ mRNA 降解途徑為主。

解題方法

作答時依序比較兩類生物的：

1. 停滯原因。
2. 核糖體救援方式。
3. 異常 mRNA 的降解。
4. 異常蛋白質的清除。

這樣即可完整回答「prokaryote and eukaryote, respectively」所要求的差異。

原核生物的 non-stop mRNA 調控

1. 核糖體因缺乏終止密碼子而停滯

正常翻譯在 $UAA$、$UAG$ 或 $UGA$ 終止密碼子處，由釋放因子辨識，促使新生多肽從 tRNA 上釋放。

Non-stop mRNA 沒有終止密碼子，因此核糖體翻譯至 $3′$ 端後，會出現下列狀況：

• A site 沒有終止密碼子可供釋放因子辨識。
• 核糖體停留在 mRNA 末端。
• tRNA 可能卡在 P site。
• 新生多肽無法正常釋放。

2. tmRNA–SmpB 執行 trans-translation

原核生物主要利用 tmRNA（transfer-messenger RNA）與 SmpB 蛋白質救援核糖體。

tmRNA 具有雙重功能：

• 一部分結構類似 tRNA，可進入停滯核糖體的 A site。
• 另一部分含有可被翻譯的短開放閱讀框，功能類似 mRNA。

其作用流程如下：

1. tmRNA 先接受丙胺酸，形成 alanyl-tmRNA。
2. SmpB 與 tmRNA 結合，協助其進入停滯核糖體。
3. tmRNA 取代原本進入 A site 的位置。
4. 核糖體由原本的異常 mRNA 轉而讀取 tmRNA 上的短開放閱讀框。
5. 翻譯出一段特殊的 C 端 peptide tag。
6. 釋放因子辨識 tmRNA 上的終止密碼子，使多肽正常釋放。
7. 核糖體、原本的 non-stop mRNA 與帶有 tag 的異常多肽分離。

此機制稱為 trans-translation，因為翻譯模板由原本的 mRNA 轉換成 tmRNA。

3. 異常多肽與 mRNA 的清除

tmRNA 加上的 peptide tag 通常是細菌蛋白酶的辨識訊號，可促使異常多肽被降解，例如：

• ClpXP
• ClpAP
• FtsH
• Lon protease

原本的 non-stop mRNA 則會受到核糖核酸酶降解，包括：

• RNase R
• RNase II
• RNase E 相關降解系統

因此，原核生物的完整品質管制可概括為：

真核生物的 non-stop mRNA 調控

1. 核糖體在 poly(A) 尾端停滯

真核 non-stop mRNA 通常因轉錄或加工異常而缺乏終止密碼子。核糖體翻譯至 mRNA 末端後，會進入 $3′$ poly(A) 尾端。

由於 poly(A) 尾端含有大量腺嘌呤，核糖體可能持續翻譯出一段由賴胺酸組成的多肽。此時：

• 沒有正常終止密碼子。
• 核糖體停滯於 mRNA $3′$ 端。
• 新生成的多肽帶有異常的 poly-Lys C 端。
• mRNA 與核糖體均需被清除。

2. Pelota–Hbs1 介導核糖體救援

真核生物沒有原核生物的 tmRNA，因此主要由 Pelota 與 Hbs1 參與核糖體救援。

核心觀念

CRISPR 是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 的縮寫，中文稱為「成簇規律間隔短回文重複序列」。它原本是細菌與古菌用來抵抗噬菌體及外來核酸的後天免疫系統，現已被改造成高度精準的基因編輯工具。

CRISPR 系統主要由兩部分組成：

1. CRISPR 重複序列與間隔序列
   細菌基因組中排列著許多短而相似的重複序列，中間夾有來自過去入侵噬菌體或質體的 DNA 片段，稱為 spacer。這些 spacer 相當於外來核酸的「免疫記憶」。

2. Cas 蛋白
   Cas 是 CRISPR-associated protein 的縮寫，其中 Cas9 是最常用的 DNA 切割酵素。Cas9 會依照 RNA 所提供的序列資訊，尋找並切割互補的目標 DNA。

以最常見的 CRISPR-Cas9 為例，人工設計的 guide RNA 會帶領 Cas9 找到特定 DNA 序列。當目標序列旁具有適當的 PAM（protospacer adjacent motif） 時，Cas9 便可在目標位置附近造成雙股 DNA 斷裂。

對於常用的 Streptococcus pyogenes Cas9，PAM 通常為：

其中 $N$ 可為任意核苷酸。PAM 本身通常不屬於 guide RNA 的互補區，但它是 Cas9 辨識與啟動切割所必需的條件。

解題方法

這是一題開放式定義題，作答時應依序掌握「名稱來源、天然功能、分子機制、基因編輯應用」四個層次。

1. 先說明 CRISPR 的本質

CRISPR 不只是單一段 DNA，也不只是 Cas9 酵素，而是由 CRISPR 序列與 Cas 蛋白共同構成的核酸防禦系統。若題目問的是基因編輯，則應進一步說明研究者如何利用 guide RNA 與 Cas 蛋白改造此系統。

2. 說明天然免疫機制

CRISPR-Cas 天然免疫大致可分為三個階段：

（1）適應階段

外來噬菌體或質體入侵後，細菌會擷取一小段外來 DNA，將其插入 CRISPR 陣列中，形成新的 spacer。這使細菌保留對該入侵者的分子記憶。

（2）表達階段

CRISPR 陣列被轉錄成長的前驅 RNA，經加工後形成帶有特定 spacer 序列的 CRISPR RNA，簡稱 crRNA。

在 Cas9 系統中，crRNA 需與 tracrRNA 配合，形成能引導 Cas9 的 RNA 複合體。實驗室通常將兩者融合成一條人工 RNA，稱為 single-guide RNA（sgRNA）。

（3）干擾階段

當相同或相近的外來核酸再次入侵時，crRNA 或 sgRNA 會與其互補配對，Cas 蛋白便在 PAM 存在的條件下切割目標核酸，使入侵核酸失去功能。

3. 說明基因編輯機制

在基因編輯中，研究者設計一段與目標 DNA 互補的 sgRNA，並將 sgRNA 與 Cas9 同時送入細胞。Cas9 依照 sgRNA 的序列辨認目標 DNA，並造成雙股斷裂：

細胞接著利用自身的 DNA 修復機制修補斷裂，主要有兩種途徑：

• 非同源性末端接合（NHEJ）
  修復速度快，但常在接合處產生小型插入或缺失，稱為 indel。若 indel 發生在蛋白質編碼區，可能造成移碼突變與基因失活，因此常用於基因剔除。

• 同源性導向修復（HDR）
  若同時提供帶有目標序列的供體 DNA，細胞可依照供體模板進行較精準的序列置換或插入。此方法通常比 NHEJ 受到更多細胞週期與模板條件限制。

因此，CRISPR-Cas9 的核心邏輯是：