111 年 國立中正大學生物醫學科學系分子生物碩士班《分子生物學》

此題考查遺傳密碼中終止密碼子的辨識。遺傳密碼共有64種密碼子，其中有61種編碼胺基酸，3種為終止密碼子（Stop codon），負責終止蛋白質的轉譯。終止密碼子分別為UAA (ochre), UAG (amber), 和 UGA (opal)。

此題考查真核生物細胞週期中 DNA 複製發生的時機。細胞週期分為四個主要時期：G1 (Gap 1)、S (Synthesis)、G2 (Gap 2) 和 M (Mitosis)。DNA 複製是細胞分裂前最重要的準備工作之一，確保每個子細胞都能獲得一套完整的遺傳物質。

此題考查 DNA 聚合酶 I (DNA polymerase I) 的催化活性，特別是其「校對」(proofreading) 功能。DNA 聚合酶通常具有多種酶活性。

DNA 聚合酶 I 的主要功能是移除 RNA 引子並填補 DNA 空隙，以及參與 DNA 修復。它具有以下三種活性：

1. 5' to 3' polymerase activity: 在 DNA 鏈的 3' 端添加新的去氧核苷酸，進行 DNA 合成。

此題考查大腸桿菌 DNA 聚合酶 III (DNA polymerase III) 的結構及其功能，特別是哪個次單元 (subunit) 負責增加其 processivity（延續性或連續合成能力）。

DNA 聚合酶 III 是大腸桿菌中主要的 DNA 複製酶，它是一個複雜的多單元蛋白質。其主要次單元包括：

• α (alpha) subunit: 具有 5' to 3' polymerase activity，是催化合成 DNA 的核心。
• ε (epsilon) subunit: 具有 3' to 5' exonuclease activity，負責校對 (proofreading)。
• θ (theta) subunit: 輔助 ε subunit 的校對功能。

此題考查大腸桿菌 (E. coli) DNA 複製過程中所需的蛋白質。DNA 複製是一個複雜的過程，需要多種蛋白質協同作用。

(A) DNA helicase：解旋酶，負責解開 DNA 雙螺旋，形成複製叉 (replication fork)。這是 DNA 複製的起始步驟，必需的。
(B) Primase：引子酶，合成 RNA 引子 (RNA primer)，DNA 聚合酶需要引子才能開始合成 DNA。這是必需的。

此題考查 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 的一般特性。DNA 聚合酶是催化 DNA 合成的關鍵酶。

(A) Processive enzyme：許多 DNA 聚合酶，特別是參與複製的酶（如 DNA polymerase III），是高度 processive 的，這意味著它們能在不脫離 DNA 模板的情況下連續合成較長的 DNA 片段。

此題考查分子生物學中用於檢測不同生物分子水平的技術。

(A) Northern blotting：用於檢測細胞或組織中的特定 RNA 分子（通常是 mRNA）的豐度。將 RNA 分子分離、轉移到膜上，然後用帶有互補序列的探針 (probe) 進行雜交。

此題考查轉位子 (transposable element) 的移動機制，特別是哪些類型不經過 RNA 中間體。轉位子是能夠在基因組內移動的 DNA 片段。

轉位子主要分為兩大類：

1. Class I: Retrotransposons (反轉錄轉位子)：這類轉位子通過一個 RNA 中間體進行轉移。它們先被轉錄成 RNA，然後利用反轉錄酶 (reverse transcriptase) 將 RNA 反轉錄成 DNA，再將這個 DNA 插入到基因組的新位置。
   • Viral-like retrotransposons (例如 Ty elements in yeast)

此題考查 DNA 複製過程中負責解開 DNA 雙螺旋的酶。

(A) Helicase (解旋酶)：在 DNA 複製過程中，解旋酶利用 ATP 水解的能量，破壞 DNA 雙螺旋中的氫鍵，使兩條 DNA 鏈分離，形成複製叉。這是 DNA 複製起始和進行所必需的。

此題考查核苷酸切除修復 (Nucleotide Excision Repair, NER) 途徑中涉及的分子。NER 是一種重要的 DNA 修復機制，用於修復由紫外線輻射（如嘧啶二聚體）或某些化學物質引起的較大 DNA 損傷。

(A) RecBCD：在大腸桿菌中，RecBCD 是一種核酸外切酶，參與 DNA 重組和修復，特別是 RecBCD-dependent pathway，但主要與 DNA 斷裂的處理和重組有關，不是 NER 的核心酶。

此題考查聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 所需的組分。PCR 是一種體外擴增特定 DNA 片段的技術。

PCR 的基本組分包括：

• Template DNA：含有目標 DNA 序列的樣本。
• Oligonucleotide Primers：短的單鏈 DNA 分子（引子），與目標 DNA 序列的兩端互補配對，提供 DNA 聚合酶合成的起始點。通常需要正向引子和反向引子。
• DNA Polymerase：一種耐高溫的 DNA 聚合酶（如 Taq polymerase），負責沿著模板 DNA 合成新的 DNA 鏈。

此題考查真核生物 DNA 複製過程中，起始複合物 (pre-replicative complex, pre-RC) 的活化機制。pre-RC 在 DNA 複製的起始階段起關鍵作用，確保 DNA 在細胞週期的 S 期只複製一次。

pre-RC 的組裝和活化是一個受嚴格調控的過程：

• Origin Recognition Complex (ORC)：在 G1 期識別並結合到 DNA 複製起點 (origin of replication) 上。
• Cdc6 和 Cdt1：招募和載入 minichromosome maintenance (MCM) 複合物（一種 DNA 解旋酶）到複製起點，與 ORC 一起形成 pre-RC。

此題考查 DNA 的鹼基組成規則，即 Chargaff's rules。對於雙鏈 DNA：

• 腺嘌呤 (Adenine, A) 的含量等於胸腺嘧啶 (Thymine, T) 的含量 (A=T)。
• 鳥糞嘌呤 (Guanine, G) 的含量等於胞嘧啶 (Cytosine, C) 的含量 (G=C)。
• 總嘌呤 (A+G) 的含量等於總嘧啶 (T+C) 的含量。
• 因此，A+T+G+C = 100%。

此題考查非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 途徑中涉及的分子。NHEJ 是真核生物修復 DNA 雙鏈斷裂 (double-strand breaks, DSBs) 的主要途徑之一，它直接連接斷裂的 DNA 末端，不需要同源模板。

(A) RecBCD：在大腸桿菌中，RecBCD 參與 DNA 斷裂的處理和重組，但 NHEJ 在原核生物中機制不同，且 RecBCD 不是 NHEJ 的核心。

此題考查反轉錄轉位子 (retrotransposons) 的特徵性酶。反轉錄轉位子是一種能夠通過 RNA 中間體進行轉位的 DNA 序列。

反轉錄轉位子能夠在基因組內移動，其機制依賴於一個關鍵的酶：

• Reverse Transcriptase (反轉錄酶)：這是反轉錄轉位子的標誌性酶。它能夠以 RNA 為模板合成 DNA。反轉錄轉位子首先被轉錄成 RNA，然後利用其自身編碼的反轉錄酶將該 RNA 反轉錄成 DNA，這個 DNA 再插入到基因組的新位置。

此題考查原核生物 RNA 聚合酶與啟動子 (promoter) 結合的機制，特別是與 TATA box 的關係。

在原核生物中，RNA 聚合酶（全酶，holoenzyme）負責轉錄。全酶由核心酶 (core enzyme) 和σ因子 (sigma factor) 組成。

• 核心酶 (Core enzyme)：包含 α, β, β', ω 等亞基，具有催化 RNA 合成的活性。
• σ因子 (Sigma factor)：負責識別 DNA 上的啟動子區域，特別是啟動子的核心序列，如 -10 和 -35 區。σ因子與核心酶結合形成全酶，使其能夠準確地結合到啟動子並起始轉錄。

TATA box (或 TATA 序列) 是真核生物基因啟動子中一個常見的 DNA 序列，通常位於轉錄起始點上游約 25-30 個鹼基對處，它是由 TFIID 複合物識別的。

此題考查 U6 snRNA 的轉錄機制。snRNA (small nuclear RNA) 是一類參與 RNA 剪接 (splicing) 的小分子 RNA。

在真核生物中，不同類型的 RNA 由不同的 RNA 聚合酶 (RNA polymerase, Pol) 轉錄：

• RNA polymerase I (Pol I)：負責轉錄大部分核體 rRNA (ribosomal RNA)，如 18S, 5.8S, 28S rRNA。

此題緊接上一題，詢問 hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)，也就是前驅 mRNA (pre-mRNA)，是由哪種 RNA 聚合酶轉錄的。

在真核生物中，mRNA 的合成是通過轉錄基因的 DNA 序列來完成的。這個過程由 RNA polymerase II (Pol II) 負責。 hnRNA 是在細胞核中合成的初級轉錄產物，它包含了內含子 (introns) 和外顯子 (exons)，需要經過剪接 (splicing)、加帽 (capping) 和加尾 (polyadenylation) 等加工修飾後，才能成為成熟的 m

此題考查 DNA 結合結構域 (DNA binding domain, DBD) 的分類。許多蛋白質，尤其是轉錄因子，通過特定的結構域與 DNA 結合，以調控基因表達。

常見的 DNA 結合結構域包括：

• Zinc finger (鋅指結構域)：通過鋅離子穩定結構，通常能與 DNA 的主要溝 (major groove) 結合。
• Leucine zipper (亮氨酸拉鏈結構域)：通常是二聚化結構域，其結構允許蛋白質形成二聚體，然後通過 DNA 結合區域與 DNA 結合。

此題考查真核生物轉錄過程中，RNA 聚合酶 II 的 C-terminal domain (CTD) 的磷酸化。CTD 是 RNA 聚合酶 II 的最大亞基 (RPB1) 的 C 端一個長串的重複序列（在酵母中是 26 個 YSPTSPS 重複單元，在人類中是 52 個），其磷酸化狀態在轉錄的起始、延伸和終止過程中起著關鍵的調控作用。

• 轉錄起始 (Initiation)：在轉錄起始階段，CTD 通常處於未磷酸化或低磷酸化狀態。在起始複合物形成後，TFIIH（ a general transcription factor）中的激酶亞基（如 CDK7）會磷酸化 CTD 的 Ser5 位點。這個磷酸化標誌著從起始向延伸的轉錄過渡。

此題考查 Kozak sequence 的重要性及其對轉譯效率的影響。Kozak sequence 是一個出現在真核生物 mRNA 的翻譯起始密碼子 (AUG) 周圍的保守序列，它能增強翻譯起始的效率。

Kozak sequence 的一般形式是：
5'- (G/A)CC(A/G)CCAUGG -3'
其中，AUG 是起始密碼子，被定義為 +1 位置。

Kozak sequence 的關鍵位置及其重要性：

• +4 位置的 G 鹼基：被認為對翻譯起始效率有重要影響，能夠增強起始。
• -3 位置的 G/A 鹼基：起始密碼子 (AUG) 前的第三個鹼基，通常是 G 或 A，對翻譯起始效率也有影響。
• -6 位置的 C 鹼基：通常是 C。

此題考查 Group I self-splicing (第一類自我剪接) 過程中釋放的內含子 (intron) 的形狀。Group I self-splicing 是一種 RNA 分子自身催化剪接的反應，不需要蛋白質輔助。

在 Group I self-splicing 中，一個鳥苷 (G) 的 3'-OH 基團攻擊內含子的 5' 端磷酸二酯鍵，導致第一個外顯子 (exon) 被釋放，並形成一個內含子-外顯子連接。隨後，內含子的 3' 端攻擊第一個外顯子的 3' 端，將兩個外顯子連接起來，同時釋放出內含子。

此題考查成熟的轉運 RNA (tRNA) 分子 3' 末端的結構。所有真核生物和細菌的 tRNA 分子，在成熟後，其 3' 末端都會有一個共同的序列：CCA。

這個 CCA 末端是 tRNA 的一個重要結構特徵，它負責：

1. 胺基酸的接受 (Amino acid acceptance)：胺基酸通過酯鍵連接到 CCA 末端的腺苷 (Ade

核心觀念

本題考查真核生物前體 mRNA（precursor mRNA）剪接時，剪接體（spliceosome）中各 snRNA 的配對關係與功能。

主要配對如下：

• U1 snRNA：最初辨認並配對內含子的 5′剪接位點。
• U2 snRNA：配對分支點（branch point），使分支點腺苷酸暴露出來。
• U4 snRNA：與 U6 snRNA 配對，抑制 U6 的催化活性；活化剪接體時，U4 會與 U6 分離。
• U6 snRNA：與 U2 snRNA 及 5′剪接位點形成鹼基配對，建立剪接反應所需的催化核心。
• U5 snRNA：協助定位兩個外顯子末端，使剪接後的外顯子能正確接合。

因此，U6 所配對的兩個 snRNA 是 U2 與 U4，所涉及的內含子位置是 5′剪接位點。

解題方法

直接抓住 U6 snRNA 的三個關鍵配對對象：

其中：

1. U4 與 U6 先形成 U4/U6 雙 snRNP，U4 維持 U6 的非活化狀態。
2. 剪接體活化時，U4 與 U6 解離。
3. U6 改與 U2 配對，並與 5′剪接位點互作，形成催化中心，促進兩次轉酯化反應。

故正確組合為 U2、U4、5′剪接位點。

選項分析

此題考查 λ (Lambda) 噬菌體感染大腸桿菌 (E. coli) 後，其 cI 蛋白（λ 阻遏蛋白, λ repressor）與噬菌體 DNA 上的運營子 (operator) 區域的結合能力。λ 噬菌體的基因調控是一個經典的模型。

λ 噬菌體的運營子區域包含多個與 cI 蛋白結合的位點，分為 O_R (right operator) 和 O_L (left operator)。

• O_R 區域有三個 cI 結合位點：OR1, OR2, OR3。
• O_L 區域有三個 cI 結合位點：OL1, OL2, OL3。

cI 蛋白的結合親和力（binding affinity）在這些位點上是不同的，這決定了 λ 噬菌體的溶原 (lysogeny) 和裂解 (lysis) 狀態的轉換。

一般而言，cI 蛋白對 O_R 區域的結合親和力順序是：
OR1 > OR2 > OR3
其中，OR1 是結合能力最強的位點，它位於 P_R (promoter for right) 啟動子的核心區域。

此題考查 mRNA 上負責核糖體結合的序列名稱。核糖體結合是蛋白質合成（轉譯）的起始步驟。

(A) Shine-Dalgarno sequence：這是原核生物 mRNA 上的一個保守序列，位於起始密碼子 (AUG) 的上游，它與 16S rRNA 的 3' 末端互補配對，幫助核糖體準確地定位到起始密碼子上，從而啟動轉譯。

此題考查 microRNA (miRNA) 的生物生成過程，特別是哪個酶負責將前驅 miRNA (pre-miRNA) 加工成成熟的 miRNA。

miRNA 的生成是一個多步驟的過程：

1. 轉錄：基因組中的 miRNA 基因被轉錄成初級轉錄產物 (pri-miRNA)。
2. 細胞核中的加工：pri-miRNA 在細胞核中被一個稱為 Microprocessor complex 的複合物加工。該複合物由 DGCR8 (也稱為 Pasha) 和 Drosha 酶組成。DGCR8 作為一個 RNA 結合蛋白，識別並結合 pri-miRNA，然後將其引導到 Drosha 的 RNase III 活性位點，Drosha 將 pri-miRNA 切割成約 70 個核苷酸長的前驅 miRNA (pre-miRNA)。
3. 細胞質中的加工：pre-miRNA 被運輸到細胞質中。在那裡，一個稱為 Dicer 的 RNase III 型酶會進一步將 pre-miRNA 切割成約 22 個核苷酸對的雙鏈 RNA 分子，稱為 miRNA 雙鏈。
4. 成熟 miRNA 的形成：miRNA 雙鏈中的一條鏈（成熟鏈）被保留，與 Argonaute 蛋白結合，形成 RNA 誘導的沉默複合體 (RISC)。另一條鏈則被降解。

此題考查抗生素 puromycin 的作用機制。Puromycin 是一種胺基糖苷類抗生素，它可以干擾蛋白質合成（轉譯）。

Puromycin 的結構與胺基醯化 tRNA 的 3' 末端 (CCA) 上的胺基酸非常相似。它能夠進入核糖體 A 位點，並被肽基轉移酶 (peptidyl transferase) 識別，與正在生長的肽鏈形成肽鍵。然而，puromycin 沒有 3' 端可以繼續延伸，因此，一旦 puromycin 被連接到肽鏈上，蛋白質的合成就會終止，並釋放出一個不完整的肽鏈。

(A) 16S rRNA：是核糖體小亞基 (30S) 的組成部分，在核糖體定位和起始階段起作用。
(B) 23S rRNA：是核糖體大亞基 (50S) 的組成部分，具有肽基轉移酶的活性，參與肽鍵的形成。

核心觀念

本題考查真核生物粒線體 RNA 的「插入／刪除型 RNA editing」，尤其是錐蟲類粒線體 mRNA 的尿嘧啶核苷酸（U）編輯。

此類 RNA editing 通常依照下列步驟進行：

1. guide RNA 與待編輯 RNA 配對，提供編輯位置的辨識資訊。
2. 由核酸外切酶（exonuclease）移除不正確或多餘的 U。
3. 由 terminal uridylyl transferase（TUTase）在 RNA 末端加入 U。
4. 由 RNA ligase 將切開的 RNA 片段重新連接。

因此，RNA editing 的核心酵素包括：

• RNA ligase
• terminal uridylyl transferase（TUTase）
• exonuclease

解題方法

判斷各選項是否參與 RNA editing 的關鍵，在於辨認它們在「U 的移除、U 的添加、RNA 片段連接」三個步驟中的功能：

逐一比對後，沒有直接參與上述編輯流程的酵素，即為答案。

選項分析

(A) RNA ligase

RNA ligase 會催化 RNA 片段之間磷酸二酯鍵的形成。在 RNA 被切開、完成 U 的插入或刪除後，RNA ligase 負責將片段重新接合，因此參與 RNA editing。

此題考查檢測蛋白質之間相互作用 (protein-protein interaction, PPI) 的技術。

(A) Far western blot：這是一種改良的 Western blot 技術，用於檢測蛋白質之間的相互作用。

在 DNA 複製過程中，當 DNA 解旋酶 (helicase) 解開雙螺旋形成複製叉時，會導致複製叉前方的 DNA 鏈發生過度的超螺旋 (supercoiling)。這種超螺旋會阻礙解旋酶的進行，因此需要一種酶來解除這種超螺旋。

這種酶是 DNA gyrase (DNA 促旋酶)，它是一種拓撲異構酶 (topoisomerase)。

大腸桿菌 (E. coli) 的 DNA 複製起始是一個受嚴格調控的過程，發生在一個稱為複製起點 (origin of replication) 的特定 DNA 位置，稱為 oriC。起始階段涉及多種蛋白質和 DNA 結構。

參與起始的關鍵分子包括：

1. DnaA protein (DnaA 蛋白)：這是起始階段的核心調控蛋白質。DnaA 蛋白在 ATP 結合狀態下，能夠識別並結合到 oriC 區域的 DnaA 結合位點。多個 DnaA 蛋白聚集後，會引起 oriC DNA 結構的局部解旋，形成一個「複製泡」(replication bubble)。

組蛋白 (histones) 是真核細胞中與 DNA 結合形成染色質 (chromatin) 的主要蛋白質。組蛋白的 N 端尾巴 (N-terminal tails) 是組蛋白修飾的主要位點，這些修飾對調節基因表達、DNA 複製、修復和染色質結構起著至關重要的作用。

常見的組蛋白修飾類型有以下幾種：

1. 乙醯化 (Acetylation)：組蛋白乙醯轉移酶 (HATs) 將乙醯基添加到組蛋白尾巴上的賴氨酸 (lysine) 殘基上。乙醯化通常與基因激活相關，因為它會中和賴氨酸的陽電荷，減弱組蛋白與帶負電的 DNA 之間的相互作用，使染色質變得更開放，便於轉錄因子接近。
2. 甲基化 (Methylation)：組蛋白甲基轉移酶 (HMTs) 將甲基基團添加到組蛋白尾巴上的賴氨酸 (lysine) 或精氨酸 (arginine) 殘基上。甲基化可以被激活或抑制基因表達，取決於甲基化的位點和程度（單甲基化、二甲基化、三甲基化）。

V(D)J 重組是發生在免疫系統中，特別是 B 細胞和 T 細胞發育過程中，用於產生抗體和 T 細胞受體 (TCR) 多樣性的一種特殊的 DNA 重組過程。它通過隨機組合不同的 V (variable), D (diversity), J (joining) 基因片段來構建免疫球蛋白和 TCR 的基因。

V(D)J 重組的關鍵分子包括：

1. RAG1 (Recombination-Activating Gene 1) 和 RAG2 (Recombination-Activating Gene 2)：這兩個蛋白質是 V(D)J 重組的啟動酶。RAG1 具有催化 DNA 斷裂和連接的活性，RAG2 則與 RAG1 協同作用，負責識別 DNA 上的 V(D)J 重組信號序列 (recombination signal sequences, RSSs)。RAG1/RAG2 複合物在 RSSs 處切割 DNA，產生雙鏈斷裂 (DSBs)。

此題考查大腸桿菌 (E. coli) DNA 聚合酶 III (DNA polymerase III) 的複製過程。DNA 聚合酶 III 的 β 亞基 (β subunit) 形成一個環狀結構（β clamp 或 sliding clamp），它能緊密地結合在 DNA 鏈上，將 DNA 聚合酶 III 的核心酶鎖定在模板上，從而大大提高了其延續性 (processivity)。

真核生物的轉錄終止是一個複雜的過程，與原核生物不同，它通常與 mRNA 的加工（如加尾）緊密偶聯。對於 RNA 聚合酶 II (Pol II)，其轉錄終止模型主要有以下幾種：

1. Torpedo Model (魚雷模型)：這是目前最廣泛接受的模型之一，特別是對於 Poly(A) 信號下游的終止。
   • 當 Pol II 轉錄到 mRNA 的 Poly(A) 信號（通常是 AAUAAA 序列）時，一系列的 RNA 結合蛋白會識別這個信號。
   • 這些蛋白質會招募一個酶複合物，該複合物會切割 mRNA 的 3' 端，在 Poly(A) 信號下游約 10-30 個核苷酸處。
   • 切割後，Pol II 仍然附著在 DNA 上並繼續延伸。
   • 在切割位點的 5' 端，會產生一個自由的 RNA 末端。
   • 一個 5' to 3' 核酸外切酶（例如 Rat1/Xrn2）會開始降解這個自由的 RNA 末端，並沿著 RNA 鏈追趕 Pol II。
   • 當外切酶追上 Pol II 時，它會觸發 Pol II 的釋放，從而終止轉錄。

前驅 mRNA 剪接 (precursor mRNA splicing) 是真核生物 mRNA 加工過程中的一個關鍵步驟，它通過去除內含子 (introns) 並連接外顯子 (exons) 來形成成熟的 mRNA。這個過程主要由稱為剪接體 (spliceosome) 的大型 RNA-蛋白質複合物催化。

剪接體的核心組成為一系列稱為小核核糖核蛋白 (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) 的複合物。每個 snRNP 由一個小核 RNA (small nuclear RNA, snRNA) 和多個蛋白質組成。

TFIID (TBP-associated factor D) 是真核生物中一個關鍵的通用轉錄因子 (general transcription factor, GTF)，它在 RNA 聚合酶 II (Pol II) 介導的轉錄起始過程中，是第一個結合到核心啟動子 (core promoter) 的因子。TFIID 是一個大型的蛋白質複合物，其主要組分是：

1. TBP (TATA-binding protein)：這是 TFIID 的核心組分。TBP 能夠識別並結合到啟動子中的 TATA box 序列（如果存在的話）。即使在沒有 TATA box 的啟動子中，TBP 也能通過其他方式與啟動子區域結合。TBP 的結合是招募其他 TFIID 組分和後續轉錄因子的基礎。
2. TAFs (TBP-associated factors)：TBP 結合了一系列稱為 TAFs 的蛋白質。這些 TAFs 共同構成 TFIID 的剩餘部分。TAFs 的功能多樣，包括：

轉運 RNA (tRNA) 在真核生物中需要經過一系列的加工修飾才能成為成熟的分子，其中就包括 5' 末端的處理。

tRNA 的 5' 末端加工主要由一個稱為 RNase P (RNAse P) 的酶複合物負責。RNase P 是一種核糖核蛋白酶 (ribonucleoprotein enzyme)，它包含一個 RNA 組分和多個蛋白質組分。

這個問題涉及遺傳密碼的簡併性 (degeneracy of the genetic code) 和 tRNA 的數量。

• 遺傳密碼的簡併性：有 64 種可能的密碼子 (codons)，但只有 20 種標準胺基酸。這意味著許多胺基酸可以由不止一種密碼子編碼。其中有 3 個是終止密碼子，不編碼胺基酸。因此，編碼胺基酸的密碼子有 61 種。
• tRNA 的數量：如果每種編碼胺基酸的密碼子都需要一個專門的 tRNA 來識別，那麼理論上需要 61 種 tRNA。然而，實際情況是，大多數物種的 tRNA 數量少於 61 種，但又多於 20 種。

這種現象可以用 Wobble hypothesis (擺動假說) 來解釋：

1. 擺動配對 (Wobble pairing)：在 tRNA 的反密碼子 (anticodon) 的第三個鹼基（5' 端）與 mRNA 的密碼子的第三個鹼基（3' 端）之間，配對的靈活性（擺動）允許一個 tRNA 分子識別多個密碼子。例如，一個反密碼子為 ICG (Inosine, Cytosine, Guanine) 的 tRNA 可以識別密碼子 UGU (Cys) 和 UGC (Cys)。
2. 不同密碼子簡併度：胺基酸的簡併度不同。有些胺基酸（如亮氨酸、精氨酸）有多達 6 個密碼子，而有些（如甲硫氨酸、色氨酸）只有 1 個。通常，具有多個密碼子的胺基酸，其對應的 tRNA 通過擺動假說可以識別這些密碼子。

鹼基切除修復 (Base Excision Repair, BER) 是一種重要的 DNA 修復途徑，用於修復由氧化、烷基化、脫氨基或脫嘌呤等導致的單個鹼基損傷。BER 途徑主要包括以下幾個步驟：

BER 途徑的兩個主要類型：短路徑 (Short-patch BER) 和長路徑 (Long-patch BER)

A. 短路徑 (Short-patch BER)：這是最常見的 BER 形式，用於修復單個核苷酸的損傷。

1. DNA 糖苷酶 (DNA Glycosylase) 識別和切除受損鹼基：
   • 首先，一個特異性的 DNA 糖苷酶識別 DNA 鏈上受損的鹼基（例如，氧化損傷的 8-oxoG，脫氨基產生的尿嘧啶 U，或脫嘌呤位點 AP site）。
   • DNA 糖苷酶切斷了受損鹼基與其糖基之間的 N-糖苷鍵，從而將受損鹼基從 DNA 骨架上移除，產生一個無鹼基位點 (apurinic/apyrimidinic site, AP site)。
2. AP 位點的處理：
   • AP 位點的 5' 端通常有一個磷酸二酯鍵，而 3' 端通常是一個 3'-OH。
   • AP 核酸內切酶 (AP endonuclease)（例如 E. coli 中的 Exonuclease III，或真核生物中的 APE1）識別 AP 位點，並在 AP 位點的 5' 端切割磷酸二酯鍵。這會在 DNA 骨架上產生一個缺口 (nick)。
3. DNA 聚合酶進行填補 (Gap filling)：
   • DNA 聚合酶 β (DNA polymerase β)（在真核生物中）或 DNA 聚合酶 I (DNA polymerase I)（在細菌中）識別這個缺口。
   • DNA 聚合酶利用模板鏈的序列，在缺口處添加一個正確的核苷酸，填補空隙。
4. DNA 連接酶進行連接 (Ligation)：
   • DNA 連接酶 (DNA ligase)（例如 DNA ligase I）識別 DNA 鏈上的缺口，並催化 3'-OH 末端與 5'-磷酸末端之間的磷酸二酯鍵的形成，從而將修復的 DNA 片段連接起來，恢復 DNA 的完整性。

B. 長路徑 (Long-patch BER)：當短路徑無法完成修復（例如，當有多個相鄰的損傷或修復酶效率較低時），或者在某些情況下，長路徑會啟動。

大腸桿菌 (E. coli) 中的同源重組 (Homologous recombination, HR) 是一種重要的 DNA 修復和遺傳物質重組機制，它利用同源 DNA 序列作為模板來修復 DNA 斷裂（特別是雙鏈斷裂, DSBs）或發生遺傳物質的交換。HR 過程非常複雜，涉及多種蛋白質和 DNA 結構。以下是其主要分子過程：

主要階段和涉及的分子：

1. 損傷識別和 DNA 末端處理 (Damage Recognition and DNA End Resection)

• DNA 雙鏈斷裂 (DSB)：HR 的起始信號。
• RecBCD 複合物：這是 E. coli 中處理 DSBs 和啟動 HR 的關鍵酶。
  • RecBCD 能夠識別 DSBs 的斷裂末端。
  • 它具有解旋酶 (helicase) 和核酸外切酶 (exonuclease) 的活性。
  • RecBCD 沿著 DNA 移動，解開雙鏈。如果遇到一個 Chi (χ) 位點 (GCTGGTGG)，RecBCD 會改變其核酸外切酶的活性，使其主要在 Chi 位點的下游（3' 端）進行切除，產生一個單鏈的 3' 突出端 (3' overhang)。這個 3' overhang 是進行後續重組的關鍵。
• RecFOR 複合物：在沒有 Chi 位點或 RecBCD 無法有效工作的情況下（例如，在複製叉停滯時），RecFOR 複合物（RecF, RecO, RecR）可以參與產生 3' overhangs。RecFOR 能夠結合單鏈 DNA (ssDNA) 並幫助 RecA 結合。

2. 3' overhang 的結合和絲狀結構的形成 (RecA Filament Formation)

• RecA 蛋白：這是 HR 的核心蛋白質。RecA 蛋白能夠結合到單鏈 DNA (ssDNA) 上，形成一個絲狀結構 (filament)。
  • RecA 絲狀結構具有掃描同源 DNA 序列並尋找配對區域的能力。
  • RecA-ssDNA 絲狀結構是進行同源序列搜尋和 DNA 鏈交換的關鍵。

3. 同源序列搜尋和鏈交換 (Homologous Pairing and Strand Exchange)

• RecA 絲狀結構：在 RecA 絲狀結構的引導下，單鏈 DNA 會尋找基因組中與之具有同源性的雙鏈 DNA 區域（模板 DNA）。

色胺酸衰減 (Tryptophan attenuation) 是原核生物（如大腸桿菌 E. coli）中一種獨特的基因表達調控機制，它對色胺酸操縱子 (tryptophan operon) 的表達進行精細調控。衰減機制與啟動子處的阻遏蛋白 (repressor) 結合作用是互補的，共同確保色胺酸在細胞內濃度較低時能夠有效合成，而在濃度較高時迅速關閉合成途徑。

色胺酸操縱子包含多個結構基因 (trpE, trpD, trpC, trpB, trpA)，它們編碼色胺酸生物合成所需的酶。這個操縱子的表達受阻遏蛋白 (TrpR) 和衰減機制共同調控。

衰減機制的工作原理：

衰減機制依賴於轉錄和轉譯的緊密偶聯（在原核生物中，兩者同時發生），以及 mRNA 二級結構的形成。

1. 色胺酸濃度與 mRNA 的二級結構：
   • 在色胺酸濃度高時：細胞內有足夠的色胺酸。參與轉譯的 tRNA^Trp (攜帶色胺酸的 tRNA) 濃度也高。當核糖體在衰減區 (attenuator region) 的領導序列 (leader sequence) 處轉譯時，由於 tRNA^Trp 充足，核糖體能夠順利地通過領導序列中的色胺酸密碼子 (trp codons)。這會導致形成一個特定的 mRNA 二級結構，稱為 終止子結構 (terminator structure) 或稱 rho-independent terminator。這個結構包含一個 GC-rich 的莖 (stem) 和一個隨後的 U-rich 的環 (loop)，這種結構會導致 RNA 聚合酶從 DNA 模板上脫落，提前終止轉錄。
   • 在色胺酸濃度低時：細胞內色胺酸匱乏。參與轉譯的 tRNA^Trp 濃度低。當核糖體轉譯到領導序列中的色胺酸密碼子時，由於缺乏 tRNA^Trp，核糖體會在這個密碼子處停滯（ribosome stalling）。這個停滯會阻止終止子結構的形成。取而代之的是，會形成另一個 mRNA 二級結構，稱為 抗終止子結構 (anti-terminator structure)。這個結構阻止了終止子結構的形成，從而允許 RNA 聚合酶繼續轉錄，直至到達操縱子的末端，合成所有結構基因的 mRNA。

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一種存在於細菌和古細菌中的適應性免疫系統，用於抵禦外源 DNA，如噬菌體和質粒。近年來，CRISPR-Cas9 系統已被改造成強大的基因編輯工具。

CRISPR 系統的工作原理 (細菌中的免疫系統)：

CRISPR 系統主要包含兩個關鍵組分：

1. CRISPR 陣列 (CRISPR array)：這是一段重複的 DNA 序列 (repeats)，中間夾雜著獨特的短 DNA 序列，稱為間隔序列 (spacers)。這些間隔序列是從過去感染過的噬菌體或質粒的 DNA 中獲得的，相當於細菌的「記憶」。
2. Cas 基因 (CRISPR-associated genes)：這些基因編碼 Cas 蛋白，其中一些是核酸酶 (nucleases)，負責切割 DNA。

CRISPR 系統的工作分為三個主要階段：

• 適應階段 (Adaptation / Spacer Acquisition)：當細菌遇到外源 DNA 時，Cas 蛋白（如 Cas1 和 Cas2）會識別並將外源 DNA 的一小段（稱為 protospacer）切割下來，並將其整合到 CRISPR 陣列的間隔序列中。
• 表達階段 (Expression / crRNA Biogenesis)：CRISPR 陣列被轉錄成一個長 RNA 分子 (pre-crRNA)。然後，這個 pre-crRNA 被 Cas 蛋白（如 RNase III）加工，切割成包含一個間隔序列和部分重複序列的小分子 RNA，稱為 CRISPR RNA (crRNA)。
• 干預階段 (Interference)：crRNA 會與一種 Cas 蛋白（如 Cas9）形成一個複合物。這個 Cas-crRNA 複合物會掃描細胞內的 DNA，尋找與 crRNA 間隔序列互補的外源 DNA 序列。一旦找到匹配的目標 DNA，Cas 蛋白就會利用其核酸酶活性，在目標 DNA 的特定位置進行切割，從而破壞外源 DNA，保護細菌。

CRISPR-Cas9 基因編輯工具：

科學家們利用 CRISPR-Cas9 系統的干預階段，將其改造成一個精確的基因編輯工具。

• Cas9 蛋白：作為一種 DNA 酶，它能切割雙鏈 DNA。
• 引導 RNA (guide RNA, gRNA)：這是人工設計的 RNA 分子，它結合了 crRNA 的間隔序列功能和 tracrRNA（一種輔助 RNA）的功能。gRNA 可以被設計成與任何目標 DNA 序列互補。