108 年 國立政治大學神經科學研究所（原：生命科學研究所）《細胞與分子生物學》

本題主要在考察細胞分子生物學中最基礎的基因表現相關名詞解釋。

(1) Genetic codon：
遺傳密碼子（genetic codon）是指在 mRNA 分子上，由三個連續的核苷酸所組成的序列，它決定了蛋白質合成時要加入哪一種胺基酸，或是作為蛋白質合成的起始或終止訊號。地球上絕大多數的生物都共享一套通用的遺傳密碼，稱為「通用遺傳密碼」。例如，AUG 是起始密碼子，同時也編碼甲硫胺酸；UAA、UAG、UGA 則是終止密碼子，它們不對應任何胺基酸。
【答案】遺傳密碼子是 mRNA 上由三個核苷酸組成的序列，決定胺基酸的種類或作為起始/終止訊號。

(2) Anticodon：
反密碼子（anticodon）是位於轉移核酸（tRNA）分子上，由三個核苷酸組成的序列。這個序列能與 mRNA 上的遺傳密碼子進行鹼基互補配對（遵循 Watson-Crick 鹼基配對規則，A-U, G-C），藉此將特定胺基酸帶到核糖體上，參與蛋白質的合成。

本題主要在考察基因表現調控的幾個重要層面，包括轉錄因子、mRNA 的非轉譯區以及 RNA 剪接。

(1) Transcription factors (TFs)：
轉錄因子（Transcription Factors, TFs）是一類能夠與 DNA 上的特定序列（如啟動子 promoter、增強子 enhancer、沉默子 silencer）結合的蛋白質。它們透過與 DNA 的結合，進一步招募或抑制 RNA 聚合酶（RNA polymerase）的活性，從而影響特定基因的轉錄起始速率，進而調控基因表現的水平。

• 活化型轉錄因子（Activators）：結合到 DNA 上特定序列後，能促進 RNA 聚合酶的招募或活性，增加轉錄速率。
• 抑制型轉錄因子（Repressors）：結合到 DNA 上特定序列後，能阻礙 RNA 聚合酶的招募或活性，降低轉錄速率。
  許多轉錄因子還需要與輔助因子（coactivators 或 corepressors）結合，才能發揮其完整的調控功能。
  【答案】轉錄因子是能結合 DNA 並調控 RNA 聚合酶活性的蛋白質，分為活化型和抑制型，影響基因轉錄起始速率。

(2) Untranslated regions (UTRs) on the mRNA：
mRNA 的非轉譯區（Untranslated Regions, UTRs）是指 mRNA 分子上，位於起始密碼子（AUG）上游的 5' UTR 和位於終止密碼子下游的 3' UTR。這些區域雖然不被轉譯成蛋白質，但在調控 mRNA 的穩定性、細胞質定位、翻譯效率以及 mRNA 的降解等方面扮演重要角色。

• 5' UTR：可能包含影響翻譯起始的序列（如原核生物的 Shine-Dalgarno sequence）或微小 RNA（miRNA）的結合位點，影響翻譯效率。

本題考查表觀遺傳學（epigenetics）中的兩個核心機制：DNA 的化學修飾和組蛋白（histone）的化學修飾，以及這些修飾如何影響基因轉錄。

(1) DNA 的化學修飾 (Chemical modifications on DNA)：
最主要的 DNA 化學修飾是 DNA 甲基化（DNA methylation）。在哺乳動物中，這通常發生在胞嘧啶（cytosine）的第五個碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）。這個過程主要由 DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）催化，通常在 CpG dinucleotides（胞嘧啶後面緊接著鳥糞嘌呤）區域進行。

• 影響轉錄：
  • 沉默基因（Gene silencing）：通常，CpG 島（CpG islands，即 CpG 序列高度密集的區域，常位於基因的啟動子區域）的過度甲基化與基因的長期沉默或低表現有關。甲基基團的加入會阻礙轉錄因子與 DNA 結合，或招募含甲基化 DNA 結合域（MBDs）的蛋白質，進而形成更緊實的染色質結構，阻止轉錄機器的進入，抑制轉錄。
  • 活化基因（Gene activation）：雖然較少見，但在某些情況下，DNA 甲基化也可能與基因活化有關，這通常與特定的轉錄因子或調控元件的結合模式有關。

(2) Histones 的化學修飾 (Chemical modifications on histones)：
組蛋白是構成核小體（nucleosome）的基本單位，DNA 纏繞在組蛋白周圍形成染色質（chromatin）。組蛋白的 N 端尾巴（N-terminal tails）可以接受多種可逆的化學修飾，這些修飾統稱為「組蛋白密碼」（histone code）。主要的修飾包括：
- 乙醯化（Acetylation）：由組蛋白乙醯轉移酶（Histone Acetyltransferases, HATs）催化，將乙醯基添加到組蛋白（如 H3、H4）的賴胺酸（lysine）殘基上。

本題考查兩種重要的細胞膜受體：G蛋白偶聯受體（GPCRs）和受體酪胺酸激酶（RTKs），要求比較它們的生化特性和下游訊號傳遞。

(1) G protein coupled receptor (GPCR)：

• 生化特性：
  • 結構：GPCRs 是一類跨膜蛋白質，具有七個跨膜螺旋結構域（seven transmembrane domains）。它們位於細胞膜上，細胞外側是配體結合區，細胞內側與 G 蛋白偶聯。
  • 配體：可以結合多種多樣的配體，包括胺類神經傳導物質（如腎上腺素、血清素）、胜肽類激素（如胰高血糖素）、嗅覺和味覺分子等。
  • G 蛋白：GPCRs 的細胞內側與一種特殊的 GTP-結合蛋白質（G protein）相互作用。G 蛋白通常由 α、β、γ 三個亞基組成。在未活化狀態下，Gα 亞基與 GDP 結合；當 GPCR 被配體活化後，會誘使 Gα 亞基釋放 GDP 並結合 GTP，從而活化 G 蛋白，並使其與 βγ 亞基分離。
• 下游訊號傳遞：
  • 活化 G 蛋白：GPCR 活化後，誘使 G 蛋白的 Gα 亞基與 GTP 結合並釋放 βγ 亞基。
  • 第二信使系統：活化的 Gα-GTP 和 βγ 亞基可以獨立作用於細胞內的效應分子（effector molecules），產生第二信使（second messengers）。
    • Gs 蛋白：刺激腺苷酸環化酶（adenylyl cyclase），增加細胞內 cAMP 的濃度，進而活化蛋白激酶 A (PKA)。
    • Gi 蛋白：抑制腺苷酸環化酶，降低 cAMP 濃度；或活化離子通道（如鉀離子通道）。
    • Gq 蛋白：活化磷脂酶 C (PLC)，PLC 水解磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP2）產生 IP3 和 DAG。IP3 釋放細胞內鈣離子（Ca$^{2+}$），DAG 活化蛋白激酶 C (PKC)。
  • 訊號放大：第二信使系統能有效放大初始訊號。
  • 訊號終止：GTP 酶活性（GTPase activity）的 Gα 亞基會將 GTP 水解為 GDP，使 G 蛋白失活；第二信使也會被降解或清除；受體本身也可能被磷酸化並被抑制蛋白（如 β-arrestin）結合而下調。

(2) Receptor tyrosine kinase (RTK)：

• 生化特性：
  • 結構：RTKs 是一類跨膜蛋白質，具有單一跨膜螺旋結構域。它們的細胞外區域是配體結合區，細胞內區域則具有酪胺酸激酶活性，能催化特定的酪胺酸殘基磷酸化。
  • 配體：通常與生長因子（如 EGF, PDGF, FGF, insulin）結合。
  • 激酶活性：RTKs 本身就是一種酶。當配體結合後，受體會發生二聚化（dimerization），導致細胞內激酶區域的激活，通過跨位點磷酸化（trans-phosphorylation）來磷酸化彼此的酪胺酸殘基。
• 下游訊號傳遞：
  • 受體二聚化與自體磷酸化：配體結合後，受體分子二聚化，激活細胞內的酪胺酸激酶活性，對自身進行磷酸化，產生多個磷酸化的酪胺酸殘基。
  • 招募下游信號分子：這些磷酸化的酪胺酸殘基成為下游信號分子（如含有 SH2 或 PTB 結構域的蛋白質）的結合位點。這些信號分子包括：
    • Adaptor proteins（接頭蛋白）：如 Grb2，它能同時結合磷酸化的 RTK 和 SOS（一個 GEF，Guanine nucleotide Exchange Factor），激活 Ras GTPase。
    • Enzymatic proteins（酶類蛋白質）：如 PI3K（磷脂酰肌醇 3-激酶），它磷酸化 PIP2 產生 PIP3，PIP3 激活下游的 Akt 等激酶。
    • Transcription factors（轉錄因子）：如 STATs，它們被 RTK 磷酸化後，二聚化並轉位到細胞核，直接調控基因表現。

本題考查細胞自噬（autophagy）的過程與功能。

自噬（Autophagy）是一個細胞內維持穩態（homeostasis）的關鍵過程，意指「自我吞噬」。它是一種細胞回收機制，透過將細胞質中的受損胞器、蛋白質聚集體、入侵的病原體等物質，包覆在雙層膜結構的自噬體（autophagosome）中，然後將自噬體與溶酶體（lysosome）融合，在溶酶體內部的酸性水解酶作用下將內容物降解，回收其組成為基本的營養物質（如胺基酸、脂肪酸、核苷酸），供細胞重新利用。

自噬的過程主要可分為三個階段：

1. 起始與成核（Initiation and Nucleation）：

   • 在細胞面臨壓力（如營養缺乏、氧化壓力、內質網壓力）或清除特定細胞成分時，自噬的啟動信號會被啟動。
   • 一個稱為「膜泡」或「吞噬泡」（phagophore）的雙層膜結構開始形成，通常認為其來源有多種，包括內質網、高爾基體、細胞膜或線粒體外膜。
   • 這一過程涉及一系列的自噬相關基因（Autophagy-related genes, Atgs）的協同作用，形成一個稱為「自噬起始複合物」（autophagy initiation complex）的蛋白質機器。例如，ULK1 複合物（在酵母中）或其同源物（在哺乳動物中）是起始階段的關鍵啟動者，需要與 Beclin-1 (ATG6) 和 VPS34 (磷脂酰肌醇 3-激酶) 形成複合物，產生 PIP3，為吞噬泡的擴張提供膜。

2. 延伸與閉合（Elongation and Closure）：

   • 吞噬泡的膜結構開始延伸，包覆細胞質中的目標物質（如受損的線粒體，稱為「選擇性自噬」；或細胞質的廣泛區域，稱為「總體自噬」）。
   • 這一階段的膜延伸和擴張，主要由兩個 ATG 蛋白質複合物介導：
     • ATG12-ATG5-ATG16L1 複合物。
     • LC3（微管相關蛋白質 1A/1B-自噬相關蛋白輕鏈 3）的脂質化（lipidation）。LC3 在吞噬泡膜上被加工，形成 LC3-II（與磷脂酰乙醇胺 PE 結合），LC3-II 是自噬體膜的標誌物。LC3-II 的數量與自噬體形成的程度呈正相關。
   • 當吞噬泡的膜完全包覆目標物質並閉合成一個完整的雙層膜囊泡時，就形成了自噬體（autophagosome）。

本題要求比較蛋白質輸送到三個不同細胞內或細胞外的目的地：分泌蛋白、溶酶體和粒線體，所涉及的分子機制。這三個目的地都涉及蛋白質的跨膜運輸和正確摺疊。

核心觀念： 蛋白質的運輸和分選（sorting）是一個複雜的過程，依賴於蛋白質上特定的信號序列（signal sequences）和細胞內負責識別、運輸和加工這些蛋白質的分子機器（如信號肽識別顆粒 SRP、轉運體、信號肽切割酶、分子伴侶等）。

(1) Secretory proteins (分泌蛋白)

• 目的地： 細胞外，或細胞膜上的蛋白質。
• 分子機制：
  1. 信號肽 (Signal Peptide)： 分泌蛋白的 N 端通常帶有一個約 15-30 個胺基酸組成的疏水性信號肽。這個信號肽在蛋白質合成早期（仍在核糖體上進行）就會被識別。
  2. 信號肽識別顆粒 (Signal Recognition Particle, SRP)： 當信號肽從核糖體釋放出來時，會被細胞質中的 SRP 識別並結合。SRP 是一個由 RNA 和蛋白質組成的複合物。
  3. SRP 受體 (SRP Receptor)： SRP-核糖體-mRNA-新合成肽鏈複合物會被轉運到內質網（ER）膜上的 SRP 受體，SRP 受體與核糖體上的信號肽識別位點結合。
  4. 轉運體 (Translocon)： SRP 釋放後，核糖體會與內質網膜上的蛋白質轉運體（一個離子通道，稱為轉運體或 Sec61 複合物）結合。新合成的肽鏈通過這個轉運體進入內質網腔（ER lumen）或插入內質網膜。
  5. 信號肽切割： 一旦蛋白質進入內質網腔或插入膜中，位於內質網腔側的信號肽酶（signal peptidase）會識別並切除信號肽。
  6. 摺疊與修飾： 在內質網腔內，蛋白質開始摺疊，並可能接受進一步的修飾，如二硫鍵形成、糖基化（N-linked glycosylation）。分子伴侶（chaperones，如 BiP）協助蛋白質正確摺疊。
  7. 運輸： 正確摺疊和修飾的蛋白質會通過囊泡運輸系統，經過高爾基體（Golgi apparatus），最終被分泌到細胞外或運送到細胞膜。

(2) Lysosome (溶酶體)

• 目的地： 溶酶體（一個細胞內的膜結合細胞器）。
• 分子機制：
  1. 信號序列 (Signal Sequence)： 溶酶體中的水解酶（lysosomal hydrolases）是合成在內質網的，它們的 N 端也帶有信號肽，最開始的運輸步驟與分泌蛋白類似，進入內質網腔。
  2. Mannose-6-Phosphate (M6P) 信號： 在內質網腔內，這些水解酶會被一個特殊的酵素（N-acetylglucosamine phosphotransferase）識別。該酵素在水解酶的特定寡糖鏈（通常是高甘露糖結構）上，將 N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）加上磷酸基團，形成一個獨特的標記：Mannose-6-Phosphate (M6P)。這是溶酶體酶的「地址標籤」。
  3. M6P 受體 (M6P Receptor)： 在高爾基體順式側（cis-Golgi），M6P 信號被 M6P 受體識別並結合。
  4. 囊泡運輸： M6P 受體-溶酶體酶複合物會被包裝進貨運囊泡（transport vesicles），這些囊泡從高爾基體出芽。
  5. 靶向溶酶體： 這些囊泡最終會運輸到晚期內體（late endosome），並在那裡釋放溶酶體酶（因為內體環境的 pH 較低，M6P 受體會釋放其結合的溶酶體酶）。
  6. 形成溶酶體： 溶酶體酶被釋放到內體腔，最終與成熟的溶酶體融合，發揮其水解功能。
  • 注意： M6P 標記是針對分泌到細胞外或進入溶酶體的溶酶體酶。有些溶酶體膜蛋白則使用其他信號機制。

(3) Mitochondria (粒線體)

• 目的地： 粒線體（細胞質中的細胞器），蛋白質可被輸送到粒線體外膜、內膜、膜間腔或基質（matrix）。
• 分子機制：
  1. 信號肽 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS)： 粒線體蛋白質的 N 端通常帶有一個信號肽，稱為粒線體靶向信號（MTS）。MTS 通常是 15-50 個胺基酸組成的兩性（amphipathic）α-螺旋結構，富含帶正電的胺基酸（如離胺酸、精胺酸）和疏水性胺基酸。MTS 不需要被切割，但通常在蛋白質進入粒線體後會被切除。
  2. 細胞質中的前體形式： 這些蛋白質在細胞質中以未摺疊或部分摺疊的前體形式存在，通常由細胞質伴侶蛋白質（如 Hsp70）協助維持其穩定性並防止其在運輸前摺疊。
  3. 粒線體外膜轉運複合物 (TOM Complex)： 蛋白質前體上的 MTS 會被粒線體外膜上的轉運體複合物（TOM Complex, Translocase of Outer Membrane）識別，並通過 TOM pore 進入膜間腔或開始插入外膜。
  4. 靶向特定隔室：
     • 外膜： 蛋白質插入 TOM 複合物本身或與外膜結合的蛋白質。

這題考的核心觀念是細胞外基質 (Extracellular Matrix, ECM) 中兩種重要結構蛋白——膠原蛋白 (collagen) 和纖維連結蛋白 (fibronectin)——的生化特性與生物功能比較。考生需要深入理解這兩種蛋白質在結構、組成、修飾以及在細胞黏附、遷移、組織形成等方面的作用差異。

解題過程

本題要求比較膠原蛋白 (collagen) 和纖維連結蛋白 (fibronectin) 的生化特性與生物功能。

(1) 膠原蛋白 (Collagen)

• 生化特性 (Biochemical Properties):

  • 結構與組成: 膠原蛋白是哺乳動物中最豐富的蛋白質，佔總蛋白質的 25-30%。它是一種結構蛋白，主要由三條多胜肽鏈（α-鏈）組成，這些鏈以左手螺旋方式纏繞成右手螺旋的三股螺旋結構，形成一個堅固的纖維。其獨特的胺基酸組成是每三個胺基酸中就有一個甘胺酸 (glycine)，且富含脯胺酸 (proline) 和羥脯胺酸 (hydroxyproline)。脯胺酸和羥脯胺酸的含量對於維持三股螺旋結構的穩定性至關重要，羥脯胺酸的羥基化反應需要維生素 C 作為輔因子。
  • 結構層級: 膠原蛋白有多種類型（目前已知超過 28 種），但最常見的是纖維形成型膠原蛋白（如第一型、第二型、第三型），它們會進一步組合成更粗大的纖維束，提供組織的抗張強度。
  • 合成與修飾: 膠原蛋白在細胞內合成後，會經過細胞外的修飾，包括羥基化、醣基化，以及形成分子間的交聯 (cross-linking)。這些交聯反應（主要由賴胺酸氧化酶 Lysyl oxidase 催化）對於形成穩定的膠原纖維至關重要，能顯著增強其機械強度。
  • 溶解性: 膠原蛋白本身是不可溶的，形成堅固的纖維結構。

• 生物功能 (Biological Functions):

  • 結構支撐: 作為細胞外基質的主要結構成分，提供組織（如皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、軟骨）強大的抗張強度和結構完整性。
  • 組織形成與修復: 在胚胎發育、傷口癒合等過程中，膠原蛋白的合成和重塑是關鍵步驟。
  • 細胞黏附與訊號傳遞: 雖然主要功能是結構支撐，但膠原蛋白的某些形式（如細胞外基質中的特定序列）也能與細胞表面的整合素 (integrins) 結合，參與細胞訊號傳遞。

(2) 纖維連結蛋白 (Fibronectin)

• 生化特性 (Biochemical Properties):

  • 結構與組成: 纖維連結蛋白是一種二級結構的醣蛋白 (glycoprotein)，由兩條相似但可能不同的多胜肽鏈組成，通過二硫鍵 (disulfide bonds) 連接。每條多胜肽鏈包含多個重複的結構域 (domains)，這些結構域負責與細胞表面受體（如整合素）、其他 ECM 成分（如膠原蛋白、肝素）以及細胞外基質的組裝因子結合。
  • 結構域功能: 重要的結合區域包括：
    • RGD 序列: 位於第三個重複的 III 型結構域，是與整合素結合的關鍵序列（Arg-Gly-Asp）。
    • 膠原蛋白結合區域: 位於 N-端。
    • 肝素結合區域: 位於 C-端。
    • 細胞黏附區域 (Cell-binding domain): 包含 RGD 序列。
  • 可溶性與纖維化: 纖維連結蛋白可以以可溶性形式存在於血漿中，也可以作為細胞外基質的組成部分。細胞可以分泌纖維連結蛋白，並通過整合素介導的訊號，將其組裝成不溶性的纖維網絡。
  • 剪接變異 (Alternative Splicing): 纖維連結蛋白基因可以通過選擇性剪接產生多種異構體 (isoforms)，這些異構體在組織中的表達和功能可能有所不同。

• 生物功能 (Biological Functions):

  • 細胞黏附 (Cell Adhesion): 纖維連結蛋白是細胞黏附的重要介質，通過其 RGD 序列與細胞表面的整合素結合，幫助細胞附著在細胞外基質上。