113 年 國立高雄大學生命科學系碩士班《分子生物學》

這題考驗對「總體蛋白質體學」（proteomics）的定義理解。總體蛋白質體學是一門研究生物體內所有蛋白質的學科，包含蛋白質的結構、功能、相互作用以及在不同生理或病理條件下的表現。

選項 (A) 描述的是基因組學 (genomics) 或蛋白質體學與基因組學的交叉領域。
選項 (B) 較為貼近 proteomic 的研究範圍，但「sets of proteins」較為籠統，且未強調「全部」蛋白質。

這題考驗對分子生物學常用工具及其功能的配對判斷。

選項 (A) 電泳 (electrophoresis) 的原理是利用帶電分子在電場中移動的速度差異來分離，DNA 帶負電，因此可以透過電泳分離不同大小的 DNA 片段。此配對正確。

選項 (B) DNA 聚合酶 (DNA ligase) 的功能是連接 DNA 片段，特別是將帶有互補黏性末端 (sticky ends) 的 DNA 片段或修補 DNA 斷裂處。

這題考驗對真核生物基因結構中外顯子 (exon) 和其對應蛋白質結構的理解。

真核生物基因由外顯子 (exon) 和內含子 (intron) 組成。外顯子是最終會被轉錄成 mRNA 並進一步轉譯成蛋白質的基因序列；內含子則是會在轉錄後被剪接掉的序列。

選項 (A) 內含子 (intron) 是在兩個外顯子之間，而不是與外顯子平行。
選項 (B) 一個基因通常轉譯成一個主要的蛋白質產物，但一個蛋白質可能由多個胜肽鏈 (polypeptide) 組成，這與外顯子的數量不一定直接對應。

這題考驗對動物細胞基因導入技術的了解。

選項 (A) CRISPR/Cas9 是一種基因編輯技術，可以精確地在基因組的特定位置引入、刪除或修改 DNA 片段。透過設計合適的 guide RNA，可以將目標 DNA 片段整合到動物細胞的基因組中。這是目前引入特定 DNA 片段到動物細胞基因組中最成功且精確的方法之一。

選項 (B) in vitro hybridization (體外雜交) 是指在實驗室條件下，讓 DNA 鏈之間形成雙股螺旋。這本身並不能將 DNA 導入細胞的基因組。

這題考驗對大腸桿菌 (E. coli) lac operon 調控機制的理解。lac operon 的表現受到兩種分子：葡萄糖 (glucose) 和乳糖 (lactose) 的調控。

lac operon 的轉錄主要受兩類因子調控：

1. Repressor protein (阻遏蛋白)：由 lacI 基因編碼，在沒有乳糖存在時，會結合到 operator 區域，阻止 RNA 聚合酶結合啟動子，從而抑制轉錄。當乳糖存在時，乳糖的代謝物 allolactose 會結合到阻遏蛋白，使其變構，脫離 operator，解除抑制。
2. Catabolite Activator Protein (CAP，分解代謝物活化蛋白)：CAP 蛋白需要與環腺苷酸 (cAMP) 結合形成 CAP-cAMP 複合物，才能結合到 operon 的 CAP 結合位點，進一步促進 RNA 聚合酶與啟動子結合，提高轉錄效率。cAMP 的濃度與細胞內葡萄糖濃度呈反比：葡萄糖濃度高時，cAMP 濃度低；葡萄糖濃度低時，cAMP 濃度高。

現在我們分析各選項：
A) 有葡萄糖，但乳糖量比葡萄糖多：
- 葡萄糖多，意味著 cAMP 低，CAP 蛋白不易與之結合，不利於 CAP-cAMP 促進轉錄。

這題考驗對遺傳密碼 (genetic code) 的基本概念，特別是密碼子 (codon) 的定義。

密碼子是 mRNA 分子上連續的三个核苷酸鹼基序列，它對應於一個特定的胺基酸，或者作為起始或終止信號。

選項 (A) 蛋白質 (protein) 是胺基酸鏈，胺基酸的順序是由 mRNA 上的密碼子決定的，蛋白質本身不包含密碼子。

這題考驗對真核生物中不同 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 功能的理解。

真核生物細胞有三種主要的 RNA 聚合酶，分別負責轉錄不同類型的 RNA：

• RNA 聚合酶 I (RNA polymerase I)：主要負責轉錄核糖體 RNA (rRNA) 的前體，如 28S, 18S, 和 5.8S rRNA。
• RNA 聚合酶 II (RNA polymerase II)：主要負責轉錄信使 RNA (mRNA)，以及一些小核 RNA (snRNA) 和 microRNA (miRNA)。

這題考驗對基因表現調控層級以及如何透過 mRNA 水平進行分析的理解。

基因表現的調控可以在多個層級進行，包括：

1. Replication control (複製調控)：控制 DNA 何時以及如何複製。這發生在轉錄之前，測量 mRNA 無法直接分析此層級。
2. Transcriptional control (轉錄調控)：控制 RNA 聚合酶是否結合啟動子，以及 RNA 合成的速率。這是調控基因表現最主要的層級之一。轉錄產生的 mRNA 量直接反映了轉錄的效率。
3. Post-transcriptional control (轉錄後調控)：包括 RNA 的加工（如剪接、加帽、加尾）和運輸。
   • Alternative splicing (選擇性剪接)：一種轉錄後調控，可以產生不同的 mRNA 異構體，進而產生不同的蛋白質。測量總 mRNA 量可能無法完全區分選擇性剪接的影響，但 mRNA 的序列分析（如 RNA-seq）可以。然而，題目問的是「水平」，通常指 mRNA 的豐度。

這題考驗對總體蛋白質體學 (proteomics) 和基因組學 (genomics) 研究範疇的區別。

• 基因組學 (Genomics)：研究生物體的全部基因組，包括基因的結構、功能、變異、演化以及它們之間的相互作用。它主要關注 DNA 層級的信息。
• 總體蛋白質體學 (Proteomics)：研究一個細胞、組織或生物體內的全部蛋白質（蛋白質體），包括蛋白質的結構、功能、相互作用、表達水平、修飾以及它們在生理和病理過程中的作用。它關注的是蛋白質層級的信息，這是基因組信息的功能性體現。

現在分析各選項：
A) 一個物種的基因數量 (the number of genes characteristic of a species)：這是基因組學研究的範疇，通過定序和分析基因組來確定。
B) 選擇性剪接的模式 (the patterns of alternative splicing)：選擇性剪接是發生在轉錄後的 RNA 加工過程，它會影響到最終產生的 mRNA 種類，進而影響蛋白質的多樣性。

這題是關於 DNA 半保留複製 (semiconservative replication) 和密度梯度離心 (density gradient centrifugation) 的經典實驗題，通常與 Meselson-Stahl 實驗相關。

實驗步驟分析：

1. 第一代生長 (Growth in 15N medium)：E. coli 在含有重氮 (15N) 的培養基中生長，意味著細胞中的所有 DNA 模板鏈都已經被 15N 標記。這時的 DNA 是「重」DNA。
2. 轉移到 14N medium (Transfer to 14N medium)：將這些 E. coli 細胞轉移到含有輕氮 (14N) 的培養基中，並讓其進行兩輪 DNA 複製。
3. 第一輪複製 (First round of replication)：
   • DNA 進行半保留複製，每條舊的 15N 模板鏈都會作為模板，合成一條新的 14N 鏈。
   • 因此，第一輪複製後產生的所有 DNA 分子，都是一條 15N 鏈和一條 14N 鏈組成的雜合 DNA。
   • 這種雜合 DNA 的密度介於純 15N DNA (高密度) 和純 14N DNA (低密度) 之間，稱為「中間密度」DNA。

滾動圓複製 (Rolling Circle Replication) 是一種特殊的 DNA 複製機制，常見於某些病毒（如噬菌體 λ）、質體 (plasmid) 以及真核生物的線粒體和葉綠體 DNA 的複製。這種機制允許單一 DNA 分子進行連續複製，產生多個拷貝。

滾動圓複製的步驟：

1. 起始點的產生 (Initiation)：

   • 複製起始於一個雙鏈 DNA 分子（通常是環狀 DNA，如質體）上的特定複製起始點 (origin of replication)。
   • 一個特定的蛋白質（通常是複製酶或解旋酶）會識別並結合到起始點，並在其中一條 DNA 鏈上造成一個單鏈斷裂 (nick)。這條被切斷的鏈稱為「起始鏈」或「導引鏈」(leading strand)。

2. 延伸與解旋 (Elongation and Unwinding)：

   • 斷裂點的 3' 端作為引物，DNA 聚合酶（通常是 DNA 聚合酶 III 或其同源物）開始沿著未被切斷的鏈（模板鏈，lagging strand）進行合成。
   • 在這個過程中，新的 DNA 鏈由模板鏈合成，而舊的起始鏈則被不斷地從環狀模板上「推開」（解旋）。
   • 由於新的 DNA 鏈是在未斷裂的鏈上連續合成（5' 到 3' 方向），而斷裂的起始鏈則不斷地被推出，形成一個不斷延伸的「尾巴」。
   • 這個過程就像一個滾動的圓圈，不斷地「滾動」並合成新的 DNA。

3. 複製的終止與產物 (Termination and Products)：

   • 當複製進行到足夠的長度，或者遇到另一個起始點時，複製可以終止。

原核生物 (Prokaryotes) 和真核生物 (Eukaryotes) 在轉錄 (transcription) 和轉譯 (translation) 機制上存在顯著差異，這主要是由於細胞結構和基因組織的不同。以下列出至少四個主要差異：

1. 細胞結構與耦合性 (Cellular Structure and Coupling)：

   • 原核生物：沒有細胞核，DNA 位於細胞質的核區 (nucleoid)。轉錄和轉譯都在同一個細胞室中進行，並且可以發生「耦合」(coupling)。也就是說，當 mRNA 分子還在被轉錄時，核糖體就可以開始在其上進行轉譯。
   • 真核生物：具有細胞核，DNA 位於細胞核內，而轉譯發生在細胞質中。轉錄在細胞核進行，產生的 mRNA 需要經過加工（如加帽、剪接、加尾）後才能運輸到細胞質進行轉譯。因此，轉錄和轉譯是分開進行的，不存在耦合性。

2. RNA 聚合酶種類 (RNA Polymerase Types)：

   • 原核生物：通常只有一種 RNA 聚合酶，負責轉錄所有類型的 RNA（mRNA, tRNA, rRNA）。
   • 真核生物：有多種類型的 RNA 聚合酶，每種負責轉錄特定類型的 RNA。最主要的三種是 RNA 聚合酶 I (轉錄 rRNA)、RNA 聚合酶 II (轉錄 mRNA 和一些小 RNA) 和 RNA 聚合酶 III (轉錄 tRNA 和 5S rRNA)。

3. mRNA 的加工 (mRNA Processing)：

   • 原核生物：mRNA 分子在轉錄後通常不需要進行顯著的加工，可以直接用於轉譯。mRNA 的半衰期通常較短。
   • 真核生物：轉錄產生的前驅 mRNA (pre-mRNA) 需要經過一系列的加工才能成為成熟的 mRNA，包括：
     • 5' 端加帽 (5' capping)：在 mRNA 的 5' 端添加一個特殊的甲基化鳥苷酸 (m7G)。

啟動子 (Promoter) 和增強子 (Enhancer) 都是 DNA 序列，它們在真核生物基因表現的轉錄調控中扮演著至關重要的角色，但它們的功能和特性有所不同。

1. 啟動子 (Promoter)

• 功能：啟動子是 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 結合到 DNA 上並開始轉錄作用的「起點」。它提供了 RNA 聚合酶及其輔助因子（如基本轉錄因子）識別和結合的位點，從而決定轉錄起始的位置和方向。
• 位置：啟動子通常位於基因的起始轉錄位點 (transcription start site, TSS) 上游（5' 端），緊鄰著要被轉錄的基因。
• 結構：真核生物的啟動子通常包含一些保守的 DNA 序列元件，例如：
  • TATA 盒 (TATA box)：位於 TSS 上游約 25-30 個鹼基對處，是許多啟動子的核心元件，參與識別和結合 TFIID (一個基本轉錄因子)。
  • 起始位點附近元件 (Initiator element, Inr)：有時會出現在 TSS 上，不依賴於 TATA 盒。
  • 下游啟動子元件 (Downstream promoter elements, DPE)：位於 TSS 下游，當 TATA 盒缺失時，DPE 變得重要。
  • GC 盒 (GC box)：富含 G 和 C 鹼基，是 SP1 等轉錄因子結合的位點，通常與基因的組成性表現 (constitutive expression) 有關。
• 作用方式：啟動子是 RNA 聚合酶結合並形成「起始複合物」(pre-initiation complex, PIC) 的基礎。基本轉錄因子會先結合到啟動子，然後招募 RNA 聚合酶 II，最終形成可以開始轉錄的複合物。

2. 增強子 (Enhancer)

• 功能：增強子是能夠顯著提高基因轉錄速率的 DNA 序列。它們通過與特定的轉錄因子（激活因子，activators）結合，並與啟動子處的轉錄起始複合物發生相互作用，來增強轉錄。
• 位置：與啟動子不同，增強子沒有嚴格的位置限制。它們可以位於：
  • 基因上游（遠端或近端）
  • 基因下游

轉錄因子 (Transcriptional factors, TFs) 是蛋白質，它們能夠結合到 DNA 的特定序列（如啟動子、增強子、沉默子）上，從而調控基因的轉錄速率。它們的活性受到嚴格調控，以確保基因在適當的時間和細胞中表達。以下是活化轉錄因子的四種常見方式：

1. 信號誘導的蛋白質定位/核轉運 (Signal-induced Localization/Nuclear Translocation)：

   • 許多轉錄因子在細胞質中處於失活狀態，或者與抑制蛋白結合。
   • 當細胞接收到特定的細胞外或細胞內信號（如生長因子、激素、細胞因子、壓力信號等）時，這些信號會觸發一系列的信號傳導通路。
   • 這些通路最終可能導致轉錄因子發生構象改變，脫離抑制蛋白，或者被磷酸化，使其能夠從細胞質運輸到細胞核。
   • 一旦進入細胞核，轉錄因子就可以結合到其目標 DNA 序列上，啟動或增強轉錄。
   • 例子：NF-κB 轉錄因子通常被抑制蛋白 IκB 結合在細胞質中；當細胞受到 IL-1 或 TNF-α 等刺激時，IκB 被降解，NF-κB 釋放並進入細胞核。

2. 共價修飾，尤其是磷酸化 (Covalent Modification, especially Phosphorylation)：

   • 蛋白質的共價修飾，特別是磷酸化，是調控轉錄因子活性的重要機制。
   • 激酶 (kinases) 可以將磷酸基團添加到轉錄因子上的特定胺基酸殘基（如絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸）。
   • 磷酸化可以：
     • 改變轉錄因子的構象，使其能夠結合 DNA 或其他蛋白質。
     • 促進或抑制轉錄因子與 DNA 的結合。
     • 影響轉錄因子與輔助因子 (co-factors) 的相互作用。
     • 導致轉錄因子的核質轉運。
     • 改變轉錄因子的穩定性（增加或減少降解）。
   • 例子：p53 轉錄因子在 DNA 損傷時會被多種激酶磷酸化，這使其穩定並能結合 DNA，啟動細胞週期的檢查點或凋亡。

在利用 CRISPR-Cas9 技術進行基因編輯（包括生成 CRISPR-Cas9 基因編輯克隆）時，載體 (vector) 的設計至關重要，它需要包含幾個關鍵元件來確保 Cas9 蛋白的表達、guide RNA (gRNA) 的產生以及後續的分子克隆過程。以下是生成 CRISPR-Cas9 克隆所需的載體上的關鍵元件：

1. Cas9 蛋白表達元件 (Cas9 Protein Expression Element)：

   • Cas9 基因：載體需要攜帶編碼 Cas9 核酸酶的基因。Cas9 基因通常是細菌源的（如 Streptococcus pyogenes 的 SpCas9），但也可以是其他來源的。
   • 啟動子 (Promoter)：Cas9 基因需要一個強效的啟動子來驅動其在目標細胞中的表達。對於真核細胞，通常使用組成性啟動子（如 CMV 啟動子、SV40 啟動子）或細胞類型特異性啟動子，以確保 Cas9 蛋白的充分產生。
   • 終止信號 (Terminator)：Cas9 基因的轉錄需要一個合適的終止信號。

2. guide RNA (gRNA) 產生元件 (guide RNA Production Element)：

   • gRNA 序列：載體需要包含一個能夠產生特定 guide RNA (gRNA) 的元件。gRNA 由兩部分組成：一個與目標 DNA 序列互補的 20 個鹼基長的「引導序列」(spacer sequence)，以及一個與 Cas9 蛋白結合的「支架序列」(scaffold sequence)。
   • RNA 聚合酶 III 啟動子 (RNA Polymerase III Promoter)：真核細胞中的 RNA 聚合酶 III 負責轉錄 tRNA 和 5S rRNA，它也適合用來轉錄短的非編碼 RNA，如 gRNA。因此，載體上通常會使用一個 RNA 聚合酶 III 啟動子（如 U6 啟動子或 H1 啟動子）來驅動 gRNA 的轉錄。
   • gRNA 序列的引入：引導序列的設計是 CRISPR-Cas9 基因編輯的關鍵。在構建載體時，需要將設計好的引導序列插入到支架序列的上游，通常通過在啟動子下游合成一個包含引導序列和支架序列的 DNA 片段，然後將其插入載體。

3. 選擇標記基因 (Selection Marker Gene)：

   • 為了區分成功轉化或轉染了載體的細胞與未轉化的細胞，載體需要包含一個選擇標記基因。