112 年 國立高雄大學生命科學系碩士班《分子生物學》

這題主要考查分子生物學的核心概念「基因中心法則」及其在生物技術（病毒疫苗開發）上的應用。

Central dogma (基因中心法則)
Central dogma 是指遺傳資訊在生物體內傳遞的方向性。最經典的定義是：DNA 透過轉錄 (transcription) 產生 RNA，RNA 再透過轉譯 (translation) 產生蛋白質。這個過程是單向的，即遺傳訊息從核酸（DNA 或 RNA）流向蛋白質。

更廣泛的定義也包含：

1. DNA 複製 (DNA replication)：DNA 可以自我複製，將遺傳訊息傳遞給下一代 DNA 分子。
2. 反轉錄 (Reverse transcription)：某些病毒（如反轉錄病毒，Retrovirus）可以利用 RNA 作為模板，合成 DNA。
3. RNA 複製 (RNA replication)：某些 RNA 病毒可以直接複製其 RNA 基因體。
4. RNA 轉譯 (Translation)：RNA 作為模板，合成蛋白質。
5. 蛋白質功能性 RNA (Functional RNA)：某些 RNA 分子（如 rRNA, tRNA）本身具有功能，不直接轉譯成蛋白質。
6. 蛋白質到蛋白質 (Protein to protein)：蛋白質構象的改變（如階級性摺疊、變性）不涉及遺傳訊息的改變。

利用 Central dogma 說明製造病毒疫苗的演進

Central dogma 的觀念，特別是 DNA $\rightarrow$ RNA $\rightarrow$ Protein 的訊息流，對於理解病毒複製和開發疫苗至關重要。疫苗的目標是誘導免疫系統對病毒產生反應，而不需要實際感染。

早期疫苗開發 (基於滅活或減毒病毒)
早期疫苗多是利用整個病毒，經過化學處理（如福馬林）或物理方法使其失去致病性（滅活疫苗），或是經過一系列培養使其毒性減弱（減毒疫苗）。這些疫苗仍包含病毒的全部遺傳物質和結構，能誘發較廣泛的免疫反應。

現代疫苗開發 (基於 Central dogma 的分子生物學技術)

隨著對 Central dogma 的深入理解和分子生物學技術的發展，疫苗開發進入了新紀元：

1. 次單位疫苗 (Subunit vaccines)：
   • 原理：只針對病毒的特定抗原（通常是表面蛋白質，如病毒的刺突蛋白 Spike protein）進行免疫。

這題考查 DNA 定序的技術，包括傳統的 Sanger 定序原理、焦磷酸定序的特點，以及次世代定序 (NGS) 的概念。

DNA 定序 (DNA Sequencing)
DNA 定序是指確定一條 DNA 分子中核苷酸（A, T, C, G）的準確順序。

1. Sanger 定序法 (Chain Termination Method)
這是最早發展成熟的 DNA 定序技術，由 Frederick Sanger 於 1977 年發明。

• 原理：利用 DNA 聚合酶進行 DNA 的體外合成，但反應體系中加入了一定比例的 二脫氧核苷三磷酸 (dideoxynucleoside triphosphates, ddNTPs)。ddNTPs 與 dNTPs (deoxynucleoside triphosphates) 的區別在於，ddNTPs 的 3' 端沒有羥基 (-OH)，因此一旦 ddNTPs 被納入新合成的 DNA 鏈，DNA 鏈的延長就會終止。
• 操作：
  • 將待定序的 DNA 模板、引子 (primer)、DNA 聚合酶、四種 dNTPs 和一種 ddNTP (例如 ddATP) 混合在一個反應管中，進行 DNA 合成。
  • 由於 ddATP 的隨機摻入，會產生一系列不同長度、以 ddATP 結尾的 DNA 片段。
  • 重複此步驟，分別使用 ddTTP, ddCTP, ddGTP，或將四種 ddNTPs 分別標記上不同的螢光染料，在一個反應管中進行，然後通過膠體電泳分離這些不同長度的 DNA 片段。
  • 通過檢測不同長度片段的終端核苷酸，就可以推斷出 DNA 的序列。
• 優缺點：準確性高，但通量較低，一次只能定序一個 DNA 片段，且需要較長的反應時間和較多的試劑。

2. 焦磷酸定序 (Pyrophosphate Sequencing, PPi Sequencing)
焦磷酸定序，也稱為化學發光定序法 (Chemiluminescent sequencing)，是基於 DNA 合成過程中釋放的焦磷酸 (Pyrophosphate, PPi) 來檢測。

• 原理：當 DNA 聚合酶將一個 dNTP 納入到 DNA 鏈時，會釋放一個焦磷酸分子 (PPi)。這個 PPi 在 ATP 硫化酶 (ATP sulfurylase) 的作用下，會將 ADP 轉化為 ATP。而 ATP 則在螢光素酶 (luciferase) 的催化下，與螢光素 (luciferin) 反應，產生光信號。
• 操作：
  • 將 DNA 模板、引子、DNA 聚合酶和特定的一種 dNTP（例如 dATP）加入反應體系。
  • 如果 dATP 被核酸酶識別並納入 DNA 鏈，就會釋放 PPi，進而產生光信號。
  • 接著洗去未反應的 dNTP，再加入另一種 dNTP（例如 dTTP），重複上述過程。
  • 通過檢測每次加入 dNTP 後產生的光信號強度，可以判斷該核苷酸是否被納入，以及被納入了多少個（如果連續加入相同核苷酸，信號會累加）。
• 特點：
  • 非終止法：與 Sanger 定序不同，它不是通過終止合成來獲得片段，而是通過檢測合成過程中的信號。
  • 同盒定序 (In-situ sequencing)：可以在一個反應孔中進行多次循環。
  • 較適合短片段定序：因為信號會隨著合成長度的增加而衰減，所以更適合定序數百 bp 的片段。
  • 一次性檢測：可以檢測到特定核苷酸的加入，但無法直接判斷其位置，需要通過多次循環和不同核苷酸的加入來推斷序列。
• 註：焦磷酸定序本身不是一種獨立的定序技術，而是某些高通量定序技術（如 Illumina 的早期版本）的關鍵檢測原理之一。現代的焦磷酸定序技術（如 Ion Torrent）則利用半導體晶片檢測 pH 值的變化，因為 PPi 在水中會轉化為 H+，改變 pH 值。

3. 次世代定序 (Next Generation Sequencing, NGS)
次世代定序（也稱為高通量定序 High-throughput Sequencing，HTS）是指一系列與 Sanger 定序不同的 DNA 定序技術，其特點是能夠在一次實驗中對數百萬甚至數十億

這題考查原核生物基因調控的基本單元「操縱子 (Operon)」以及基因調控中兩種重要的作用模式：順式作用 (cis-acting) 和反式作用 (trans-acting)。

1. Operon (操縱子)

• 定義：Operon 是指在原核生物中，由一組功能相關的基因（通常是編碼同一代謝途徑中酶的基因）與它們共同的啟動子 (promoter)、終止子 (terminator) 以及操縱者 (operator) 序列共同構成的一個功能單位。
• 結構：
  • 結構基因 (Structural genes)：編碼蛋白質的基因，通常在操縱子中是相鄰排列的。例如，大腸桿菌的乳糖操縱子 (lac operon) 包含 lacZ (β-galactosidase), lacY (permease), lacA (transacetylase) 三個結構基因。
  • 啟動子 (Promoter)：RNA 聚合酶結合並開始轉錄的 DNA 區域。
  • 操縱者 (Operator)：一個位於啟動子下游或內部（有時與啟動子重疊）的 DNA 序列，是阻遏蛋白 (repressor protein) 結合的位點。
  • 調控基因 (Regulatory gene)：通常位於操縱子之外，編碼一個調控蛋白（如阻遏蛋白或激活蛋白）。這個調控基因的產物會作用於操縱子上的操縱者序列，從而控制結構基因的轉錄。
• 功能：Operon 允許原核生物協調地表達一系列相關基因。當細胞需要這些基因產物時（例如，存在誘導物），調控蛋白會失活或激活，從而啟動轉錄；當不需要時，調控蛋白會結合到操縱者上，阻止轉錄。這種整合的調控機制能夠節省能量和資源。
• 例子：乳糖操縱子 (lac operon) 和色胺酸操縱子 (trp operon) 是最經典的例子。

2. cis-acting 與 trans-acting 作用
這兩個術語用來描述基因調控元件和其作用因子之間的空間關係。

• cis-acting 作用 (順式作用)：
  • 定義：指一個 DNA 序列（或 RNA 序列）只能作用於其自身的染色體（或同一分子）上的基因表達。這些序列通常是基因組中非編碼的 DNA 區域，例如啟動子、增強子 (enhancer)、沉默子 (silencer)、操縱者、內含子 (intron) 中的剪接位點等。

這題考查原核生物一種特殊的基因調控機制——衰減 (Attenuation)，並探討其在真核生物中的可能性。

Attenuation (衰減調控)
Attenuation 是一種在原核生物中發現的基因表達調控機制，它發生在轉錄和轉譯的偶聯過程中，通過改變 RNA 聚合酶在 mRNA 前體上的前進速度來調節基因表達。這種調控通常發生在編碼特定代謝途徑（如胺基酸合成）的操縱子中。

• 原理：
  • 前導序列 (Leader sequence)：在結構基因的起始序列之前，通常有一個稱為「前導序列」的 mRNA 區域。這個前導序列本身不編碼功能性蛋白質，但它包含一些重要的調控元件。
  • 調控元件：前導序列通常包含：
    1. 一個編碼一個小肽段的開放閱讀框 (Open Reading Frame, ORF)，這個肽段富含特定胺基酸（如色胺酸 trp 或纈胺酸 val）。
    2. 幾個保守的配對區域，可以形成不同的 RNA 二級結構，特別是形成 反向重複序列 (inverted repeats)，這允許形成 髮夾環 (hairpin loop) 結構。
  • 調控機制：
    • 當環境中缺乏目標胺基酸時：例如，當細胞缺乏色胺酸時。核糖體在翻譯前導序列的 ORF 時，會因為缺乏相應的 tRNA 而在富含色胺酸的密碼子上「卡住」。這種核糖體停滯會維持前導序列的特定構象，使得 RNA 聚合酶能夠繼續前進，並最終轉錄結構基因。
    • 當環境中目標胺基酸充足時：例如，當細胞中色胺酸充足時。核糖體可以順利快速地翻譯完前導序列的 ORF，不會停滯。在核糖體通過後，前導序列會形成一個特定的髮夾環結構，稱為 終止子 (terminator hairpin loop)。這個結構會信號 RNA 聚合酶，導致其脫落，提前終止轉錄。這樣，結構基因就不會被轉錄，從而節省了能量和資源。
• 例子：色胺酸操縱子 (trp operon) 的衰減調控是最經典的例子。

在真核生物中是否可能發生？
一般情況下，衰減調控在真核生物中不太可能像在原核生物中那樣普遍或直接發生。 主要原因如下：

1. 轉錄和轉譯的分離：真核生物的細胞核和細胞質是分離的。轉錄發生在細胞核內，而轉譯發生在細胞質中。這導致轉錄和轉譯之間存在時間和空間上的延遲，缺乏原核生物那樣的即時偶聯。這使得核糖體在 mRNA 上的停滯無法直接、即時地影響 RNA 聚合酶在 DNA 上的轉錄進程。

這題考查 DNA 的結構層次，從基本的序列到高級的三維空間結構。

DNA 的結構層次
DNA（去氧核糖核酸）是一種攜帶遺傳訊息的生物大分子，其結構可以從低到高分為一次、二次和三次構造。

1. DNA 的一次構造 (Primary Structure)

• 定義：DNA 的一次構造是指其核苷酸序列。它是由一系列的核苷酸（腺嘌呤 A, 鳥嘌呤 G, 胞嘧啶 C, 胸腺嘧啶 T）按照特定的順序連接而成的線性分子。
• 組成：每個核苷酸由三部分組成：一個去氧核糖（五碳醣）、一個磷酸基團和一個含氮鹼基（A, G, C, T）。
• 連接方式：核苷酸之間通過磷酸二酯鍵 (phosphodiester bond) 連接，形成一個長鏈。磷酸基團連接到一個核苷酸的 5' 碳原子和下一個核苷酸的 3' 碳原子上。
• 重要性：DNA 的一次序列決定了攜帶的遺傳訊息，是編碼蛋白質、調控基因表達的基礎。

2. DNA 的二次構造 (Secondary Structure)

• 定義：DNA 的二次構造是指其雙螺旋結構。這是 DNA 最廣為人知的結構，由兩條反向平行 (antiparallel) 的多核苷酸鏈組成，通過鹼基之間的氫鍵配對（A 與 T 配對，G 與 C 配對）相互纏繞形成螺旋。
• 形成：
  • 雙鏈：兩條 DNA 鏈。
  • 反向平行：一條鏈的 5' 端指向另一條鏈的 3' 端，反之亦然。
  • 鹼基配對：A 總是與 T 通過兩個氫鍵配對，G 總是與 C 通過三個氫鍵配對（沃森-克里克鹼基配對規則）。
  • 螺旋形成：鹼基配對的骨架（磷酸-醣鏈）位於螺旋的外側，而疏水的鹼基則堆積在螺旋的內部。這種結構形成一個右手螺旋，稱為 B 型 DNA (B-DNA)。
• 特點：
  • 大溝 (Major groove) 和 小溝 (Minor groove)：雙螺旋結構在外觀上呈現出大小溝，這些溝為蛋白質（如轉錄因子）與 DNA 結合提供了位點。
  • 多樣性：除了 B 型 DNA，DNA 還可以形成 A 型 DNA (A-DNA，較短、較粗，在乾燥條件下) 和 Z 型 DNA (Z-DNA，左手螺旋，在某些特定序列下形成)。

這題考查基因表達調控的兩個重要階段：轉譯 (Translational) 和轉譯後 (Post-translational) 調控。

1. Translational Regulation (轉譯調控)
轉譯調控是指細胞通過調控 mRNA 被翻譯成蛋白質的效率來控制蛋白質合成的水平。這發生在 mRNA 離開細胞核進入細胞質後，但在蛋白質合成完成之前。

• 調控機制：

  • mRNA 的結合蛋白 (RNA-binding proteins, RBPs)：
    • 許多 RBPs 可以結合到 mRNA 的特定區域（如 5' UTR, 3' UTR 或編碼區），從而影響核糖體結合、起始翻譯、延伸或終止。
    • 例如，某些 RBPs 可以阻礙核糖體結合到 5' 端，抑制翻譯；另一些 RBPs 可以穩定 mRNA，促進翻譯。
  • microRNAs (miRNAs)：
    • miRNAs 是小分子 RNA，它們可以與目標 mRNA 的 3' UTR 結合，導致：
      • mRNA 被降解。
      • 抑制翻譯。
    • miRNAs 是真核生物中非常普遍和重要的轉譯調控因子。
  • 核糖體結合位點 (Ribosome Binding Site, RBS) 的改變：
    • 在原核生物中，Shine-Dalgarno 序列的可用性會影響核糖體結合。
    • 在真核生物中，5' 帽結構的完整性以及 5' UTR 中形成髮夾結構的程度也會影響核糖體結合和掃描。
  • 離子濃度和能量狀態：
    • 細胞內離子（如 Mg2+）的濃度，以及 ATP 和 GTP 的可用性，會影響核糖體的活性和翻譯效率。
  • 翻譯起始因子的磷酸化：
    • 許多翻譯起始因子（如 eIF2, eIF4E）的磷酸化狀態會影響其活性，從而調控整體翻譯水平。例如，在細胞壓力下，eIF2 的磷酸化會廣泛抑制翻譯。
  • tRNA 的可用性：
    • 特定 tRNA 的豐度或修飾狀態，可能影響攜帶特定胺基酸的核糖體延伸速度，從而影響某些蛋白質的合成。

• 重要性：轉譯調控允許細胞快速響應環境變化，快速調整特定蛋白質的合成速率，而無需改變 mRNA 的水平。

2. Post-translational Regulation (轉譯後調控)
轉譯後調控是指在蛋白質合成完成之後，通過對蛋白質進行化學修飾、降解、定位或與其他分子結合，來調控蛋白質的活性、穩定性、功能或位置。

• 調控機制：
  • 蛋白質的化學修飾 (Chemical modifications)：這是最常見和多樣化的轉譯後調控方式。
    • 磷酸化 (Phosphorylation)：在絲氨酸 (Ser), 蘇氨酸 (Thr), 酪氨酸 (Tyr) 上添加磷酸基團，常作為信號傳導的開關。

這題考查真核生物 mRNA 加工過程中的 RNA 剪接 (RNA splicing) 和一種分子生物學技術 cDNA cloning (互補 DNA 體外重組)，並要求說明兩者之間的關聯。

1. RNA splicing (RNA 剪接)

• 定義：RNA 剪接是真核生物 mRNA 前體（pre-mRNA）在轉錄後、成熟為功能性 mRNA 之前進行的一種加工過程。在此過程中，pre-mRNA 中的非編碼區段（內含子 introns）被移除，而編碼區段（外顯子 exons）則被連接起來，形成一個連續的編碼區。
• 機制：
  • 剪接體 (Spliceosome)：RNA 剪接主要由一個稱為剪接體 (spliceosome) 的大型分子複合物執行。剪接體由一系列小核核糖核蛋白 (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) 和其他蛋白質組成。
  • 識別位點：剪接體能夠識別 pre-mRNA 上內含子兩端的剪接位點 (splice sites)。通常，內含子的 5' 端有一個 GU 序列，3' 端有一個 AG 序列，在 5' 端下游約 20-50 個核苷酸處有一個分支位點 (branch point) 序列（富含腺嘌呤 A）。
  • 催化過程：剪接體通過一系列精確的催化步驟，將 5' 剪接位點的 GU 序列切割下來，並將 5' 外顯子與 3' 外顯子之間的內含子 5' 端連接到分支位點上，形成一個稱為 套索 (lariat) 的環狀結構。隨後，剪接體再次切割 3' 剪接位點，並將兩個外顯子連接起來，同時釋放出套索狀的內含子，內含子隨後被降解。
• 變異剪接 (Alternative splicing)：一個基因的 pre-mRNA 可以通過不同的組合方式連接外顯子，產生多種不同的 mRNA 分子，從而編碼多種不同的蛋白質。這是真核生物增加蛋白質多樣性的重要機制。

2. cDNA cloning (互補 DNA 體外重組)

• 定義：cDNA (complementary DNA) 是指利用 mRNA 作為模板，在反轉錄酶 (reverse transcriptase) 的作用下合成的單鏈 DNA，然後再合成互補鏈，形成雙鏈 DNA。cDNA cloning 則是將這些合成的 cDNA 分子插入到載體（如質體）中，然後轉殖到宿主細胞（如細菌）進行大量複製和表達的技術。
• 目的：
  • 獲取真核生物的編碼序列：由於真核生物的基因包含內含子，直接從基因組 DNA 中克隆編碼序列會比較複雜。而 mRNA 是經過剪接去除內含子的成熟轉錄本，因此其 cDNA 只包含編碼區，便於在原核生物中進行表達。
  • 研究基因表達：通過比較不同條件下細胞中 mRNA 的豐度，可以推斷基因的表達水平。
  • 蛋白質生產：將 cDNA 克隆到表達載體中，可以在原核或真核宿主中生產目標蛋白質。
• 方法：
  • 從細胞中提取總 mRNA。