112 年 國立成功大學藥理學研究所《分子生物學》

此題考驗對限制酶（Restriction enzyme）基本性質的理解。限制酶是分子生物學中用來切割特定 DNA 序列的酵素，其特性與應用至關重要。

(A) 限制酶切割 DNA 後，可能產生平末端（blunt end）或黏末端（sticky end），並非「只」產生平末端。例如 EcoRI 會產生黏末端。

此題在探討端粒酶（Telomerase）的功能。端粒酶是一種特殊的聚合酶，負責維持染色體末端（telomere）的長度，防止其在 DNA 複製過程中不斷縮短。

(A) 分離親代股是 DNA 解旋酶（Helicase）的功能，而非端粒酶。
(B) 端粒酶添加的重複序列長度因物種而異，並非固定為八個核苷酸。例如，人類端粒重複序列是 TTAGGG。

此題考察關於粒線體 DNA（mtDNA）的性質。

(A) 粒線體是半自主胞器，擁有自己的 DNA，稱為 mtDNA。這是正確的。
(B) 哺乳動物的 mtDNA 通常是環狀的，而非線性。
(C) 在大多數生物體中，mtDNA 主要來自母系遺傳（maternal inheritance），而非來自父母雙方。

核心觀念

本題考查細胞呼吸中電子傳遞鏈與氧化磷酸化的 ATP 產量。

NADH 將高能電子交給粒線體內膜上的電子傳遞鏈，電子依序經過複合體 I、III、IV，釋放的能量用於將氫離子運送至膜間腔，建立質子濃度梯度，最後由 ATP synthase 合成 ATP。

傳統生物學教材採用下列估算：

• 1 個 NADH 約產生 3 個 ATP
• 1 個 FADH₂ 約產生 2 個 ATP

因此，本題依考試慣用的傳統計算方式判定。

解題方法

NADH 的電子由複合體 I 進入電子傳遞鏈，可推動較多氫離子跨膜運輸，形成足以合成約 3 個 ATP 的質子動力。

因此：

$$1\ \mathrm{NADH} \longrightarrow 3\ \mathrm{ATP}$$

故正確選項為 (A)。

現代生物能學依實際質子運輸數量與 ATP synthase 的效率，通常估計 1 個 NADH 約產生 2.5 個 ATP；但本題選項未提供 2.5 ATP，且研究所入學考試採用傳統教材慣例，因此答案選 3 ATP。

選項分析

此題在考察分離蛋白質的技術，重點在於「依據大小」分離。

(A) 離子交換層析（Ion-exchange chromatography）是根據蛋白質的電荷來分離。
(B) 等電點聚焦（Isoelectric focusing, IEF）是根據蛋白質的等電點（pI）來分離，即在某個 pH 值下蛋白質淨電荷為零時，蛋白質會停止移動。

此題在探討如何檢測 DNA 合成速率，需要選擇一個適合被標記並能反映 DNA 合成過程的分子。

DNA 的合成是通過將核苷酸（dNTPs）聚合到 DNA 鏈上來進行的。因此，要檢測 DNA 合成速率，我們需要標記一個參與 DNA 合成過程的分子，並且這個分子最終會被整合到新合成的 DNA 中。

(A) 鳥糞嘌呤（Guanine）是 DNA 的組成鹼基之一，但直接標記鳥糞嘌呤可能不如標記整個核苷酸或其前驅物來得直接反映 DNA 合成速率。
(B) 胸苷（Thymidine）是 DNA 中獨有的嘧啶鹼基之一（在 RNA 中為尿嘧啶 U）。

核心觀念

本題考查胺基酸側鏈在生理 pH（約 7）下的電荷狀態。

胺基酸的 α-羧基在 pH 7 時通常為去質子化形式 $\mathrm{-COO^-}$，α-胺基則多為質子化形式 $\mathrm{-NH_3^+}$，兩者電荷可互相抵消。因此，本題主要比較各胺基酸側鏈是否帶電。

判斷原則是比較環境 pH 與側鏈的 $pK_a$：

• 若 $pH > pK_a$，酸性基團傾向去質子化並帶負電。
• 若 $pH < pK_a$，鹼性基團傾向質子化並帶正電。
• 不具可電離側鏈者，在生理 pH 下通常為中性。

解題方法

逐一判斷各選項側鏈的化學基團：

1. Aspartate（天門冬胺酸）與 Glutamate（麩胺酸）具有額外羧基，生理 pH 下會失去質子，帶負電。
2. Histidine（組胺酸）的咪唑側鏈 $pK_a$ 約為 6.0，在 pH 7 時主要為未質子化形式，但仍有少部分帶正電，不能視為完全無電荷的側鏈。
3. Glutamine（麩醯胺酸）具有醯胺側鏈，醯胺在生理 pH 下不會明顯解離，因此側鏈為中性。

所以最符合「側鏈無電荷」的選項是 Glutamine。

選項分析

• (A) Aspartate：錯誤

  Aspartate 側鏈含有額外羧基：

  $\mathrm{-CH_2-COOH \rightleftharpoons -CH_2-COO^- + H^+}$

  其側鏈 $pK_a$ 約為 3.9。因為生理 pH 7 遠高於此 $pK_a$，側鏈幾乎完全以 $\mathrm{-COO^-}$ 形式存在，帶 $-1$ 電荷。

• (B) Glutamate：錯誤

  Glutamate 側鏈同樣含有額外羧基，$pK_a$ 約為 4.1：

此題考驗對轉錄起始過程的理解，特別是哪些分子或序列與轉錄起始點上游區域（upstream of the start site）相關。

轉錄起始需要 RNA 聚合酶（RNA polymerase）識別並結合到啟動子（promoter）區域，而啟動子通常位於轉錄起始點的上游。啟動子包含一些順式作用元件（cis-acting elements），如 TATA box，這些是 RNA 聚合酶複合體識別和結合的位點。

此題考驗對核酶（Ribozymes）的理解。核酶是具有催化活性的 RNA 分子。

(A) 核酶的催化功能確實來自其 RNA 本身，RNA 分子通過其三維結構折疊形成活性中心，可以催化化學反應。
(B) 雖然許多核糖體（ribosome）含有 RNA 和蛋白質，被稱為核糖核蛋白顆粒，但核酶本身不一定屬於此類。有些核酶是獨立的 RNA 分子，有些則與蛋白質結合。

此題考驗對 DNA 結構異常，特別是可能導致 DNA 錯誤配對（mispairing）或重組的 DNA 序列特徵的理解。

(A) 直接重複序列（Direct repeat）：序列 A 重複出現，例如 A-A。雖然本身不直接導致配對錯誤，但在某些情況下可能參與染色體易位。
(B) 倒位重複序列（Inverted repeat）：序列 A 後面緊接著其反向互補序列 A'，例如 A-B-A'。這種結構容易形成髮夾（hairpin）結構，在 DNA 複製或修復過程中，如果 DNA 聚合酶跨越髮夾結構，可能導致複製錯誤或突變。
(C) 鏡像重複序列（Mirror repeat）：序列 A 後面緊接著其自身的反向互補序列 A'，例如 A-B-C-C'-B'-A'。這種結構也容易形成髮夾結構，類似倒位重複序列，可能導致 DNA 複製錯誤。

核心觀念

DNA gyrase 是一種細菌特有的第二型拓撲異構酶（type II topoisomerase），主要功能是：

• 利用 ATP 提供能量；
• 暫時切開 DNA 的兩條股；
• 讓另一段雙股 DNA 通過切口；
• 再將原本切開的兩條股接回；
• 每完成一次循環，使 DNA 的 linking number 改變 $-2$，因此能主動引入負超螺旋。

DNA 拓撲結構常用下式表示：

$$Lk = Tw + Wr$$

其中 $Lk$ 是 linking number、$Tw$ 是扭轉數（twist）、$Wr$ 是繞曲數（writhe）。DNA gyrase 的典型作用是降低 $Lk$，使 DNA 形成負超螺旋。

解題方法

判斷各選項時，抓住 DNA gyrase 的三個關鍵特徵即可：

1. 主要存在於原核生物，尤其是細菌。
2. 會引入負超螺旋，使 $Lk$ 降低。
3. 會造成暫時性的雙股 DNA 斷裂，再將雙股接回。

因此，凡是將其功能寫成增加 linking number、消除負超螺旋，或修補單股 nick，均不符合 DNA gyrase 的標準功能。

選項分析

(A) occurs in both eukaryotes and prokaryotes

錯誤。DNA gyrase 是原核生物的重要拓撲異構酶，典型存在於細菌。在真核生物中，主要由 DNA topoisomerase I 和 DNA topoisomerase II 負責調節 DNA 拓撲結構，並沒有一般細菌型的 DNA gyrase。

核心觀念

本題考查以 cDNA cloning 製備重組 DNA（recombinant DNA）的基本材料與功能。重組 DNA 是指由不同來源的 DNA 片段接合而成的 DNA 分子，通常需要：

1. 取得目標基因的 DNA 片段，例如 cDNA。
2. 利用互補配對或限制酶切割，使 DNA 片段具有可接合的末端。
3. 使用 DNA ligase 將 DNA 片段與載體共價連接。

在以真核生物 mRNA 製備基因 cDNA 的流程中，poly(dT)、cDNA 與 DNA ligase 都可能是必要成分。

解題方法

依照「mRNA → cDNA → 載體接合」的流程判斷各選項：

$$\text{mRNA} \xrightarrow[\text{poly(dT) primer}]{\text{reverse transcriptase}} \text{cDNA} \xrightarrow{\text{DNA ligase}} \text{recombinant DNA}$$

真核生物多數成熟 mRNA 的 $3'$ 端具有 poly(A) tail。poly(dT) 可與 poly(A) tail 互補配對，因此能作為 oligo(dT) primer，引導 reverse transcriptase 合成 cDNA。

取得 cDNA 後，需將其插入 plasmid 等 DNA vector。DNA ligase 能催化相鄰核苷酸之間形成 phosphodiester bond，使 cDNA 與載體 DNA 接合，形成重組 DNA。

選項分析

(A) poly(dT)

正確。在利用 mRNA 製備 cDNA 的方法中，poly(dT) 可與 mRNA 的 poly(A) tail 互補，作為 cDNA 合成的引子。

核心觀念

原核生物通常沒有真核生物的 RNA 剪接機制，因此無法直接正確處理含有 intron 的真核基因前體 mRNA。要在原核細胞中表現真核蛋白，通常需使用不含 intron 的 cDNA，並將其接在原核生物可辨識的啟動子與翻譯調控序列下。

基本表現流程為：

$$\text{DNA} \xrightarrow{\text{轉錄}} \text{mRNA} \xrightarrow{\text{翻譯}} \text{蛋白質}$$

因此，基因必須同時具備：

1. 可被原核 RNA polymerase 辨識的 promoter。
2. 適合原核翻譯起始的 ribosome-binding site，例如 Shine–Dalgarno sequence。
3. 不依賴真核剪接的連續 coding sequence，通常為 cDNA。

解題方法

判斷各選項是否為「表現真核基因所必需」的條件：

• 若原核細胞無法移除 intron，含 intron 的基因便會產生錯誤或無法翻譯的 mRNA。
• 若缺乏原核細胞可辨識的調控元件，基因無法有效轉錄或翻譯。
• Fusion protein 只能改善蛋白質的穩定性、溶解度或純化效率，並非表現本身的必要條件。

所以，標準分子生物學定義下，必要的是「無 intron 的 coding sequence」以及「適當的原核調控元件」；fusion protein 並非必要。

選項分析

(A) absence of introns

正確。原核生物通常缺乏真核 spliceosome，無法像真核細胞一樣將 pre-mRNA 中的 intron 剪除。因此，真核基因若要在原核細胞中表現，通常須使用由成熟 mRNA 反轉錄而來的 cDNA，使 coding sequence 連續且不含 intron。

(B) fusion protein

此題考驗對操縱子（Operon）概念的理解，並要求找出關於操縱子的錯誤敘述。

操縱子是原核生物基因表達調控的一種基本單位，通常由一個啟動子（promoter）、一個操縱序列（operator）和一個或多個結構基因（structural genes）組成。

(A) 操縱子是原核生物基因表達的特徵，主要存在於細菌等原核生物中。真核生物通常沒有操縱子，其基因表達調控機制更為複雜，例如通過增強子、沉默子等。因此，「are eukaryotic gene」是錯誤的。
(B) 操縱子確實包含結構基因，這些基因編碼合成特定功能相關蛋白質（如代謝途徑中的酶）所需的蛋白質。
(C) 一個操縱子通常有一個啟動子，但可以包含多個結構基因。

此題考驗對脫氧核苷酸（Deoxyribonucleotides）來源的理解。脫氧核苷酸是 DNA 的組成單位。

(A) 脫氧核苷酸可以從飲食中攝取，但人體細胞本身也能自行合成。因此，並非「必須」由飲食供應。
(B) 脫氧核苷酸確實是從核苷酸（ribonucleotides，RNA 的組成單位）經過修飾合成的。具體來說，是通過將核糖（ribose）還原成脫氧核糖（deoxyribose），然後再結合鹼基和磷酸基團。

此題要求列出五種用於核酸（DNA 和 RNA）的主要雜環鹼基。

核酸中的含氮鹼基主要分為兩大類：嘌呤（purines）和嘧啶（pyrimidines）。
嘌呤有兩個環結構，嘧啶有一個環結構。

DNA 和 RNA 共有的鹼基是：

1. 腺嘌呤（Adenine, A）：一種嘌呤。
2. 鳥糞嘌呤（Guanine, G）：一種嘌呤。

此題要求列出並簡述四種偵測 mRNA 的方法，這些方法可用於量化 mRNA 含量、時間變化或空間定位。

mRNA 的偵測是研究基因表達的關鍵。以下是四種常用的方法：

1. Northern Blotting（北方墨點法）：

   • 原理：將總 RNA 或 mRNA 分離，經過變性電泳分離大小，然後轉移到膜上（如硝酸纖維素膜）。使用帶有放射性同位素或螢光標記的 DNA 或 RNA 探針，與膜上的目標 mRNA 進行雜交（hybridization）。
   • 應用：可以檢測特定 mRNA 的存在、大小（反映剪接變異）和相對豐度。通過對比不同樣品（如不同時間點、不同處理條件）的條帶強度，可以估計 mRNA 的含量。

2. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)（反轉錄聚合酶鏈式反應）：

   • 原理：首先，從樣品中提取 RNA，然後使用反轉錄酶（reverse transcriptase）將目標 mRNA 反轉錄成 cDNA。接著，以 cDNA 為模板，利用 PCR 技術進行指數級擴增。擴增產物的大小和量可以通過凝膠電泳或實時定量 PCR (qRT-PCR) 來分析。
   • 應用：非常靈敏，可以檢測極低量的 mRNA。qRT-PCR 可以精確量化 mRNA 的含量，分析其在不同條件下的變化。

3. In Situ Hybridization (ISH)（原位雜交）：

此題要求說明三種主要 RNA 分子：信使 RNA (mRNA)、核糖體 RNA (rRNA) 和轉運 RNA (tRNA) 的功能。

1. 信使 RNA (mRNA, Messenger RNA)：

   • 功能：mRNA 的主要功能是作為 DNA 遺傳信息的「信使」。在細胞核中，DNA 的基因序列通過轉錄過程被複製成 mRNA 分子。隨後，mRNA 分子離開細胞核，進入細胞質，並與核糖體結合。mRNA 上的核苷酸序列以密碼子的形式（三個連續的核苷酸代表一個胺基酸）攜帶合成蛋白質所需的氨基酸序列信息。它指導蛋白質的合成過程。

2. 核糖體 RNA (rRNA, Ribosomal RNA)：

   • 功能：rRNA 是構成核糖體（ribosome）的主要成分，佔核糖體總質量的絕大部分。核糖體是蛋白質合成的場所。rRNA 不僅在結構上支撐核糖體，更重要的是，rRNA 中的某些部分（特別是核糖體中的肽基轉移酶活性，由 rRNA 催化）具有催化肽鍵形成的能力，將氨基酸連接起來形成蛋白質鏈。

此題要求列出並簡述三種測定蛋白質之間相互作用（Protein-protein interaction, PPI）的方法。研究 PPI 對理解細胞功能、信號傳導通路和疾病機制至關重要。

以下是三種常用的 PPI 測定方法：

1. 酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) 系統：

   • 原理：這是一種體內（in vivo）的遺傳篩選方法。它基於一個轉錄因子（如 GAL4）被分成兩個功能區域：DNA 結合域（DNA-binding domain, DBD）和激活域（activation domain, AD）。如果兩個蛋白質（蛋白質 X 和蛋白質 Y）相互作用，它們分別與 DBD 和 AD 融合後，可以將 DBD 和 AD 重新組裝在一起，從而激活下游報告基因（如 HIS3、lacZ）的表達。通過篩選報告基因表達的酵母菌落，可以找出相互作用的蛋白質對。
   • 優點：可以篩選大量蛋白質，用於發現新的相互作用。
   • 缺點：可能存在假陽性和假陰性結果，且相互作用發生在酵母細胞核內。

2. 免疫沉澱 (Co-Immunoprecipitation, Co-IP)：

   • 原理：這是一種體內（in vivo）或體外（in vitro）的方法。首先，用特異性抗體針對細胞裂解液中的某個目標蛋白質（蛋白質 A）進行免疫沉澱，將蛋白質 A 及其結合的蛋白質（蛋白質 B）從複雜的蛋白質混合物中沉澱下來。然後，通過 Western Blotting 或質譜法（Mass Spectrometry）檢測沉澱物中是否存在蛋白質 B，從而證明蛋白質 A 和 B 之間存在相互作用。
   • 優點：可以在生理條件下檢測蛋白質相互作用，相對準確。