114 年 國立臺灣大學病理學研究所《細胞生物學（A）》

本題主要考查細胞膜的組成成分及其在細胞中的功能，特別是物質交換和信號傳遞方面的作用。

細胞膜的主要成分是磷脂質（phospholipids）、蛋白質（proteins）和膽固醇（cholesterol），此外還有少量的醣類（carbohydrates）。

1. 磷脂質 (Phospholipids)：

   • 結構：磷脂質是構成細胞膜雙層結構（phospholipid bilayer）的基礎。它們具有親水性的頭部（包含磷酸基團）和兩個疏水性的尾部（脂肪酸鏈）。
   • 功能：由於其兩親性（amphipathic）特性，磷脂質在水性環境中會自發形成雙層結構，疏水尾部朝內，親水頭部朝外，這形成了細胞膜的基本骨架，並在細胞內外之間形成一道屏障，控制物質的進出。

2. 蛋白質 (Proteins)：

   • 結構：細胞膜蛋白質種類繁多，可以嵌入磷脂雙層中（整合蛋白，integral proteins），或附著在膜的表面（周邊蛋白，peripheral proteins）。
   • 功能：
     • 物質交換：許多膜蛋白是通道蛋白（channel proteins）或載體蛋白（carrier proteins），負責運輸特定的離子或分子通過細胞膜，例如葡萄糖載體、離子通道等。
     • 信號傳遞：受體蛋白（receptor proteins）位於細胞膜表面，能識別並結合特定的信號分子（如激素、神經傳導物質），啟動細胞內的一系列反應，將信號傳遞至細胞內部。

本題主要考查線粒體的功能，特別是其在細胞能量代謝中的核心作用。

線粒體（Mitochondria）是真核細胞中重要的細胞器，通常被稱為細胞的「發電廠」，因為它主要負責細胞呼吸（cellular respiration）的過程，產生細胞代謝所需的大部分能量。

線粒體的主要功能：

1. 產生 ATP (能量貨幣)：
   • 線粒體是細胞有氧呼吸的主要場所。透過這個過程，線粒體將葡萄糖、脂肪酸等有機分子分解產生的能量，轉化為細胞可以直接利用的能量貨幣——三磷酸腺苷（ATP）。
   • 這個過程主要包括：
     • 丙酮酸氧化與檸檬酸循環 (Citric Acid Cycle, Krebs Cycle)：發生在線粒體基質（mitochondrial matrix）中，將丙酮酸（來自細胞質的糖解作用）進一步氧化，產生少量 ATP，但主要產生還原性輔酶 NADH 和 FADH₂。
     • 氧化磷酸化 (Oxidative Phosphorylation)：發生在外膜下的內膜（inner mitochondrial membrane）上，是 ATP 生成的主要階段。NADH 和 FADH₂ 將電子傳遞給電子傳遞鏈（electron transport chain），最終電子傳遞給氧氣，形成水。電子傳遞過程中釋放的能量被用來將質子（H⁺）從基質泵入膜間隙（intermembrane space），建立質子梯度。質子通過 ATP 合成酶（ATP synthase）流回基質時，驅動 ATP 的合成。

本題旨在考察學生對內質網（Endoplasmic Reticulum, ER）結構及其粗糙型和光滑型在功能上的區別的理解。

內質網是真核細胞內一個龐大、相互連接的膜網系統，遍布細胞質。它分為兩個區域，其名稱和功能差異很大：粗糙內質網（Rough ER, RER）和光滑內質網（Smooth ER, SER）。

1. 粗糙內質網 (Rough Endoplasmic Reticulum, RER)

• 結構特徵：

  • RER 的膜表面附著有大量的核糖體（ribosomes），這使得內質網膜看起來「粗糙」。
  • RER 的膜結構通常是扁平的囊狀（cisternae）或管狀結構，彼此之間相互連通。
  • RER 的腔（lumen）與核膜外層的腔相連。

• 主要功能：

  • 蛋白質的合成、摺疊與修飾：RER 是合成分泌蛋白、膜蛋白以及內膜系統（如高爾基體、溶酶體）中蛋白質的主要場所。附著在 RER 上的核糖體合成蛋白質，並將其直接轉運到 RER 的腔內。在腔內，蛋白質會進行摺疊、糖基化（N-連結糖基化）和質量控制。
  • 脂質合成：雖然光滑內質網在脂質合成中佔主導地位，但 RER 參與某些脂質的合成，特別是參與構成細胞膜的磷脂。
  • 蛋白質運輸：合成和修飾後的蛋白質會被包裝到貨物運輸囊泡（transport vesicles）中，運往高爾基體進行進一步的加工和分選。

2. 光滑內質網 (Smooth Endoplasmic Reticulum, SER)

• 結構特徵：
  • SER 的膜表面沒有核糖體附著，因此看起來「光滑」。
  • SER 的結構通常是更為分支狀的管狀網絡。
  • SER 的腔與 RER 的腔相連。

本題考查學生對細胞週期（Cell Cycle）各階段的理解，特別是 DNA 複製發生的時期及其重要性。

在真核細胞的細胞週期中，DNA 複製（DNA replication）是細胞分裂前準備階段中至關重要的一步，它確保了每個子細胞都能獲得一套完整的遺傳物質。

DNA 複製發生的階段：

DNA 複製主要發生在細胞週期的 S 期 (Synthesis Phase)。細胞週期大致分為 G₁ 期、S 期、G₂ 期（合稱間期, Interphase）和 M 期（有絲分裂期, Mitotic Phase）。

• G₁ 期 (Gap 1 Phase)：細胞生長，合成蛋白質和 RNA。
• S 期 (Synthesis Phase)：DNA 複製發生，每個染色體都會被精確地複製成兩條姐妹染色分體（sister chromatids），這兩條染色分體通過著絲點（centromere）連接在一起。
• G₂ 期 (Gap 2 Phase)：細胞繼續生長，並為有絲分裂做最後準備，合成一些在 M 期必需的蛋白質，並檢查 DNA 複製是否準確完成。
• M 期 (Mitotic Phase)：細胞核分裂（有絲分裂）和細胞質分裂（胞質分裂），產生兩個子細胞。

S 期（DNA 複製）的重要性：

1. 遺傳物質的完整性：S 期是細胞週期中最關鍵的步驟之一，因為它確保了每個染色體都得到精確的複製。這使得在隨後的 M 期中，姐妹染色分體能夠被分離並分配到兩個子細胞中，保證了每個子細胞都繼承了與親代細胞完全相同的遺傳信息。

本題考查學生對細胞骨架（Cytoskeleton）三個主要組成部分——微管（Microtubules）、微絲（Microfilaments，又稱肌動蛋白絲 Actin Filaments）和中間絲（Intermediate Filaments）——結構、功能及其在細胞活動中應用的理解。

細胞骨架是一個動態的網絡，遍布細胞質，由蛋白質纖維組成，為細胞提供結構支持、維持細胞形狀，並參與細胞運動、物質運輸以及細胞分裂等重要過程。

1. 微管 (Microtubules)

• 結構：

  • 由稱為微管蛋白（tubulin）的蛋白質亞單位（α-tubulin 和 β-tubulin）組成的中空圓柱狀結構。
  • 直徑約 25 奈米。
  • 動態結構，可以快速聚合（聚合形成微管）和解聚（解聚拆散微管）。
  • 通常從細胞的微管組織中心（MTOC，如 centrosome）出發，呈輻射狀分佈。

• 功能：

  • 維持細胞形狀：提供細胞的剛性支持，抵抗外力。
  • 細胞運動：參與鞭毛（flagella）和纖毛（cilia）的運動，以及某些細胞的運動（如變形蟲運動）。
  • 細胞內物質運輸：作為「軌道」，貨物分子（如囊泡、細胞器）通過動力蛋白（dynein）或驅動蛋白（kinesin）等馬達蛋白（motor proteins）在微管上移動。
  • 染色體分離：構成有絲分裂紡錘體（mitotic spindle）的主要成分，在細胞分裂時將姐妹染色分體拉開。

• 應用舉例：

  • 細胞分裂：紡錘絲的形成和作用。
  • 軸突運輸：神經元軸突內，囊泡和蛋白質通過微管和馬達蛋白從細胞體運輸到軸突末端。
  • 鞭毛和纖毛的運動：構成鞭毛和纖毛的「9+2」微管結構。

2. 微絲 (Microfilaments / Actin Filaments)

• 結構：

  • 由肌動蛋白（actin）蛋白質單體聚合而成，形成細長的、通常是分支的絲狀結構。
  • 直徑約 7 奈米，是細胞骨架中最細的成分。
  • 動態性極強，聚合和解聚速度快。

• 功能：

  • 維持細胞形狀和機械強度：形成細胞皮層（cell cortex），支撐細胞膜。
  • 細胞運動：參與細胞爬行運動（如變形蟲運動）、肌動蛋白絲的伸展形成細胞偽足（pseudopods）。
  • 肌肉收縮：與肌球蛋白（myosin）協同作用，產生收縮力。
  • 細胞質流動 (Cytoplasmic Streaming)：在植物細胞和某些單細胞生物中，推動細胞質流動。
  • 胞質分裂 (Cytokinesis)：在動物細胞分裂末期，形成收縮環，缢裂細胞質。
  • 細胞內吞和胞吐：參與囊泡的形成和移動。

• 應用舉例：

  • 肌肉收縮：肌動蛋白絲與肌球蛋白絲的滑動。
  • 細胞爬行：肌動蛋白絲的聚合驅動細胞向前移動。
  • 動物細胞分裂：胞質分裂時形成收縮環。
  • 形成細胞偽足：在免疫細胞吞噬病原體時。

3. 中間絲 (Intermediate Filaments)

• 結構：

  • 由多種蛋白質（如角蛋白 keratin、波形蛋白 vimentin、神經絲 neurofilaments、核層蛋白 lamins）構成的纖維狀結構。
  • 直徑約 8-12 奈米，介於微管和微絲之間。
  • 結構相對穩定，聚合解聚速度較慢，提供長期的機械穩定性。
  • 不與馬達蛋白結合，不參與主動運輸。

• 功能：

  • 提供機械強度和韌性：抵抗張力，防止細胞被拉伸或撕裂。
  • 維持細胞形狀：特別是在受到機械壓力時。
  • 固定細胞器：將細胞核和其他細胞器固定在細胞質中的特定位置。
  • 形成核層 (Nuclear Lamina)：在核膜內側形成一層蛋白質網，支持核膜結構。

本題考查學生根據蛋白質在細胞內的定位推測其功能的基礎知識。綠色螢光蛋白（GFP）是一種常用的標記工具，用於可視化蛋白質在細胞內的定位。

核心觀念：細胞內的細胞器和結構具有高度分工，特定功能的蛋白質通常定位在執行該功能的特定區域。

題目情境：一個蛋白質被 GFP 標記後，觀察到它主要分佈在細胞核（nucleus）中。

推測該蛋白質的功能：

如果一個蛋白質主要定位在細胞核，那麼它很可能參與細胞核內的各種生化過程。細胞核是細胞的遺傳物質（DNA）所在地，也是基因表達調控、DNA 複製和修復等關鍵過程發生的場所。因此，定位在細胞核的蛋白質，其功能可能與以下方面有關：

1. DNA 複製與修復：負責複製 DNA 的酶（如 DNA 聚合酶）、解旋酶（helicase）、引發酶（primase）以及參與 DNA 修復的蛋白質，都位於細胞核內。
2. RNA 合成與轉錄調控：參與轉錄的酶（如 RNA 聚合酶）、轉錄因子（transcription factors）、增強子結合蛋白（enhancer-binding proteins）、啟動子結合蛋白（promoter-binding proteins）等，它們調控基因的表達，均在細胞核內發揮作用。
3. RNA 加工與成熟：參與 mRNA 前體剪接（splicing）、加帽（capping）和加尾（polyadenylation）的蛋白質，以及參與 rRNA 合成和組裝核糖體的蛋白質，都位於細胞核（特別是核仁）。
4. 染色質結構與組織：組蛋白（histones）是構成核小體（nucleosome）的主要成分，負責將 DNA 纏繞包裝起來。非組蛋白（non-histone proteins）則參與染色質的緊縮、鬆弛以及染色體結構的維持。

本題要求學生從細胞生物學的角度，討論癌細胞（Cancer cells）相較於正常細胞所表現出的獨特細胞行為，並重點從細胞增殖（proliferation）、細胞死亡（cell death）和細胞代謝（metabolism）三個方面進行闡述。

癌細胞的產生是細胞正常調控機制失常的結果，它們展現出多種與正常細胞不同的特徵，這些特徵共同促成了腫瘤的發生、發展和轉移。

1. 細胞增殖 (Cell Proliferation)

正常細胞的增殖受到嚴格的調控，有明確的生長週期，並受到生長因子、抑制信號和細胞接觸抑制（contact inhibition）的約束。癌細胞則表現出不受控制的增殖：

• 持續的細胞分裂信號：癌細胞可能產生過量的生長因子，或其生長因子受體過度活躍，使其持續接收到增殖信號。
• 逃避生長抑制信號：癌細胞的抑癌基因（tumor suppressor genes）功能喪失（如 p53, Rb），使其無法響應抑制生長和誘導細胞凋亡的信號。
• 細胞週期調控異常：癌細胞的細胞週期檢查點（如 G₁/S 檢查點）功能失常，使其可以無視 DNA 損傷或分裂指令的異常，持續進行分裂。
• 無限的複製能力（永生化, Immortality）：正常細胞有分裂次數的限制（Hayflick limit），與端粒（telomere）的縮短有關。癌細胞通常能夠維持端粒長度（通過激活端粒酶 telomerase），從而獲得無限增殖的能力。
• 逃避接觸抑制：正常細胞在接觸到其他細胞時會停止增殖，而癌細胞則會失去這種接觸抑制，表現為細胞的堆積，形成腫瘤。

2. 細胞死亡 (Cell Death)

細胞死亡是維持組織穩態和清除受損或異常細胞的正常生理過程。癌細胞則具有逃避細胞死亡的能力：

• 抵抗細胞凋亡 (Apoptosis)：細胞凋亡是程序性細胞死亡，是清除異常細胞的重要機制。癌細胞通常會獲得抵抗凋亡的能力，這可能是由於：
  • 凋亡通路關鍵蛋白的突變：如 p53 基因突變（p53 是重要的腫瘤抑制基因，能誘導細胞凋亡），或 BCL-2 家族蛋白（如 BCL-2, BCL-XL）的過度表達，這些蛋白質是抗凋亡的。
  • 凋亡信號傳遞通路受阻。
• 抵抗壞死（Necrosis）：雖然壞死通常是非程序性的，但某些情況下，癌細胞也能抵抗由外來損傷引起的壞死。

本題要求設計一個實驗來研究某未知蛋白質（Protein X）的定位與功能，這是一個結合了分子生物學、細胞生物學和實驗設計的綜合題。

實驗設計思路：
研究蛋白質的定位與功能，通常需要先確定其在細胞內的確切位置，然後通過操縱該蛋白質的表達或活性，觀察對細胞的影響，從而推斷其功能。

1. 標記技術的選擇與理由

• 標記技術：我將使用 綠色螢光蛋白（GFP）融合蛋白技術 (GFP fusion protein technology)。具體來說，我會將編碼 GFP 的基因與編碼 Protein X 的基因進行融合，構建一個表達載體，使其在細胞內表達時，Protein X 與 GFP 形成一個融合蛋白。
• 選擇理由：
  1. 可視化定位：GFP 是一種內源性發光的螢光蛋白，其發出的綠色螢光可以在活細胞中被觀察到，無需額外染色。這使得我們可以實時、動態地觀察 Protein X 在細胞內的精確定位，以及其在細胞週期或特定刺激下的移動情況。
  2. 生物相容性好：GFP 融合蛋白通常對蛋白質原有的生物學活性影響較小（尤其是在融合點設計合理的情況下），能夠較好地反映 Protein X 的天然定位和行為。
  3. 技術成熟且易於操作：GFP 融合技術是目前研究蛋白質定位的標準方法之一，相關的載體、表達系統和顯微鏡技術都比較成熟。
  4. 可結合其他技術：GFP 標記的細胞可以進一步與免疫螢光染色（免疫染色）結合，用其他顏色的螢光標記特定的細胞器或已知蛋白質，從而精確確定 Protein X 相對於細胞內其他結構的定位。

2. 實驗步驟設計

• 細胞培養 (Cell Culture)：

  • 選擇一種合適的模式細胞系（如 HeLa 細胞、HEK293 細胞），這些細胞系易於培養和轉染。
  • 在適當的培養基、溫度（如 37°C）、濕度和 CO₂ 濃度（如 5% CO₂）下培養細胞。

• 蛋白質標記 (Protein Labeling)：

  • 構建表達載體：將編碼 Protein X 的 cDNA 克隆到一個帶有 GFP 標記的表達載體中。載體應包含一個強啟動子（如 CMV 啟動子），以確保高效表達。需要注意融合點的選擇，通常將 GFP 融合在 Protein X 的 N 端或 C 端，避免影響其活性區域。
  • 細胞轉染 (Transfection)：使用標準的轉染方法（如脂質體轉染、電穿孔）將構建好的 GFP-Protein X 融合蛋白表達載體導入培養的細胞中。
  • 穩定細胞株的建立（可選，用於長期研究）：如果需要穩定的表達，可以在轉染後篩選出穩定整合了載體的細胞株。

• 觀察方法 (Observation Methods)：

  • 螢光顯微鏡 (Fluorescence Microscopy)：轉染後，在適當的時間（如 24-48 小時，確保蛋白質有足夠時間表達）觀察細胞。使用激發波長（對應 GFP 的激發光）照射細胞，並觀察細胞發出的綠色螢光。這可以初步判斷 Protein X 的細胞內定位（例如，細胞質、細胞核、特定細胞器）。
  • 共軛焦顯微鏡 (Confocal Microscopy)：為了獲得更高的分辨率和更精確的定位信息，特別是當蛋白質定位在較小的結構或需要區分細胞核、細胞質等區域時，應使用共軛焦顯微鏡。它可以排除散射光，獲得清晰的細胞光學切片。
  • 免疫螢光染色 (Immunofluorescence Staining)：為了更精確地確定 Protein X 相對於已知細胞器的定位，可以在觀察 GFP 螢光後，對細胞進行固定（fixation）、透化（permeabilization），然後用針對特定細胞器標記物（如核膜的 Lamin B1、線粒體的 Tomm20、高爾基體的 GM130）的一抗和相應的螢光二抗進行染色。這樣，就可以用不同顏色的螢光同時顯示 Protein X 和目標細胞器。

3. 對照實驗設計與理由

為了確保觀察到的結果是 Protein X 本身的定位，並排除實驗中的假陽性或假陰性，需要設置以下對照：

• 空載體對照 (Empty Vector Control)：

  • 方法：對細胞轉染一個不含 Protein X 基因，但含有 GFP 基因的空載體。
  • 目的：驗證 GFP 本身發出的螢光信號是否會產生假陽性結果，以及細胞本身是否會發出干擾性的螢光。如果空載體轉染的細胞沒有觀察到特定結構的螢光，而 GFP-Protein X 融合蛋白卻有，則說明觀察到的信號確實來自 Protein X。

• 非融合 GFP 對照 (Non-fused GFP Control)：

  • 方法：將 GFP 單獨作為一個獨立的蛋白質表達（例如，GFP-linker 融合蛋白，linker 是一個短肽），觀察其定位。
  • 目的：了解 GFP 標籤本身是否會影響蛋白質的定位，或者 GFP 本身在細胞內的分布模式。