111 年 國立臺灣大學病理學研究所《細胞生物學（A）》

細胞膜上的蛋白質主要可分為整合蛋白（Integral proteins）、周邊蛋白（Peripheral proteins）以及脂質錨定蛋白（Lipid-anchored proteins）三大類。

1. 整合蛋白 (Integral proteins)：

   • 結構與功能：這類蛋白質部分或全部嵌入脂質雙層中。它們通常具有疏水性的胺基酸殘基，與脂質雙層的疏水核心相互作用。整合蛋白可以作為通道蛋白（Channel proteins）或載體蛋白（Carrier proteins），負責物質的運輸；也可以作為受體蛋白（Receptor proteins），接收細胞外的訊號；或是作為酵素，催化細胞膜內外的反應。
   • 繪圖說明：可畫出脂質雙層，並將蛋白質描繪成貫穿雙層（跨膜蛋白）或部分嵌入其中。

2. 周邊蛋白 (Peripheral proteins)：

   • 結構與功能：這類蛋白質不直接嵌入脂質雙層，而是透過非共價鍵（如離子鍵、氫鍵）與膜上的整合蛋白或磷脂分子結合。

鈣離子（$Ca^{2+}$）是細胞內重要的第二信使（second messenger），在細胞的眾多生理過程中扮演關鍵角色。其細胞內濃度受到嚴格調控，通常細胞質中的游離鈣離子濃度遠低於細胞外及細胞內儲存庫（如內質網、粒線體）中的濃度。

鈣離子在細胞中的主要生理功能包括：

1. 訊號傳導 (Signal Transduction)：

   • 當細胞接收到細胞外訊號（如荷爾蒙、神經傳導物質）或細胞內訊號（如細胞損傷）時，細胞內的鈣離子濃度會迅速升高。
   • 升高的鈣離子會與許多鈣離子結合蛋白（calcium-binding proteins）結合，其中最著名的是鈣調蛋白（Calmodulin）。
   • 鈣離子-鈣調蛋白複合物可以活化或抑制下游的許多蛋白質，包括激酶（kinases）、磷酸酶（phosphatases）、離子通道等，進而調控各種細胞反應，如基因表現、蛋白質合成、細胞增生、細胞分化、細胞凋亡等。

2. 肌肉收縮 (Muscle Contraction)：

   • 在骨骼肌、心肌和平滑肌中，鈣離子是啟動肌肉收縮的關鍵。
   • 神經訊號傳遞到肌細胞時，會引起肌漿網（sarcoplasmic reticulum）釋放鈣離子到細胞質中。

粗糙內質網（Rough Endoplasmic Reticulum, rER）與平滑內質網（Smooth Endoplasmic Reticulum, SER）是真核細胞內膜系統的組成部分，它們在結構和功能上存在顯著差異。

結構上的差異：

• rER：其特徵是內質網膜的外表面附著有大量的核糖體（ribosomes）。這些核糖體負責蛋白質的合成，並將合成的蛋白質直接轉運到rER腔內或整合到rER膜上。rER的囊腔（lumen）通常較發達，呈扁平的囊狀或管狀結構。
• SER：其內質網膜的外表面沒有核糖體附著，因此表面光滑。SER的結構通常呈管狀，與rER相連，但其腔體相對較小。

功能上的差異：

• rER 的主要功能：

  1. 蛋白質合成與摺疊：合成將要分泌到細胞外、插入細胞膜、或運送到高基氏體、溶酶體等細胞器的蛋白質。核糖體將多肽鏈合成後，立即通過rER膜上的通道進入rER腔內，在那裡進行摺疊、醣基化（glycosylation）和組裝。
  2. 蛋白質修飾：在rER腔內，蛋白質會進行初步的摺疊、二硫鍵形成、寡醣鏈的添加（N-連結醣基化）等修飾。
  3. 品質控制：rER具有監測蛋白質摺疊正確性的機制，錯誤摺疊的蛋白質會被標記並送往進行降解。

• SER 的主要功能：

  1. 脂質合成：是合成磷脂、膽固醇、類固醇荷爾蒙的主要場所。
  2. 解毒作用 (Detoxification)：在肝細胞中，SER含有許多參與藥物和毒素代謝的酵素，能將脂溶性的毒物轉化為水溶性，便於排出體外。
  3. 鈣離子儲存：在肌肉細胞中，SER（特稱為肌漿網 sarcoplasmic reticulum）是主要的鈣離子儲存庫，在肌肉收縮和舒張的過程中釋放和再攝取鈣離子。

神經細胞（Neuron）具有高度特化的結構，例如長軸突（axon）和樹突（dendrites），這需要一套特殊的細胞骨架系統來支撐、維持其形態並參與其功能。雖然神經細胞也含有普遍存在於其他細胞的細胞骨架蛋白（如微管、微絲、中間絲），但有一些細胞骨架蛋白在神經細胞中表現得尤為重要，且其表達或結構特徵具有神經細胞的特異性，或在神經細胞中扮演關鍵角色。

以下介紹一些被認為是神經細胞特有或在神經細胞中極為重要的細胞骨架相關蛋白：

1. 微管相關蛋白 (Microtubule-Associated Proteins, MAPs)：

   • 微管是神經細胞中維持細胞形狀、軸突運輸（anterograde and retrograde transport）和突觸可塑性的重要結構。
   • MAPs 是一類多樣化的蛋白質，它們結合到微管上，影響微管的穩定性、動力學和功能。
   • MAP2 (Microtubule-associated protein 2)：主要存在於神經元的樹突和細胞體，是樹突形態和穩定性的關鍵。
   • Tau 蛋白 (Tau protein)：主要存在於軸突，對軸突微管的穩定性至關重要，並在軸突運輸中發揮作用。Tau 蛋白的異常聚集與阿茲海默症等神經退化性疾病有關。
   • MAPs 的特異性表達和調控是神經細胞結構和功能特化的重要基礎。

2. 神經絲 (Neurofilaments)：

   • 神經絲是構成神經細胞中間絲（intermediate filaments）的一種，是構成神經細胞細胞骨架的重要組成部分，尤其是在軸突中。
   • 神經絲由三種主要的蛋白質亞基組成：輕鏈（NF-L）、中鏈（NF-M）和重鏈（NF-H）。
   • 它們提供軸突機械強度，防止軸突被拉伸或壓縮而損傷，並在調節軸突直徑中起作用，進而影響神經訊號傳導的速度。

在細胞生物學研究中，對基因產物——蛋白質的「定性」、「定量」和「定位」是理解其功能和調控的基礎。以下將分別說明這三方面的實驗設計方法：

1. 蛋白質的定性 (Protein Qualitative Analysis)

定性是指確定某種蛋白質是否存在於細胞或組織中，以及其基本屬性（如分子量、等電點）。

• 方法：

  • 蛋白質電泳 (Protein Electrophoresis)：
    • SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis)：這是最常用的蛋白質定性方法之一。蛋白質樣品與 SDS 結合，使蛋白質帶有負電荷，並破壞其二級和三級結構，使其主要依據分子量分離。通過與已知分子量的蛋白質標準品對比，可以初步判斷目標蛋白質的分子量。
    • Western Blotting (免疫印跡)：在 SDS-PAGE 分離蛋白質後，將蛋白質轉移到膜（如 PVDF 或硝酸纖維素膜）上。然後使用特異性的抗體（primary antibody）來識別和結合目標蛋白質，再用帶有標記的二抗（secondary antibody）進行檢測（如酶標記或螢光標記）。這能精確地確認目標蛋白質的存在。
  • 質譜法 (Mass Spectrometry, MS)：可以精確測定蛋白質的分子量，並通過肽段質譜（peptide mass fingerprinting）或串聯質譜（tandem mass spectrometry）來識別蛋白質序列，從而進行蛋白質的鑑定。

• 實驗設計考量：

  • 需要有針對目標蛋白質的特異性抗體（Western Blot）或已知的蛋白質序列資訊（MS）。
  • 樣品製備（如細胞裂解、組織提取）需溫和，以避免蛋白質變性或降解。

2. 蛋白質的定量 (Protein Quantitative Analysis)

定量是指測量特定蛋白質在細胞或組織中的含量或濃度。

• 方法：
  • Western Blotting 的定量：通過比較目標蛋白質條帶的強度與已知濃度的標準品條帶強度，可以對蛋白質進行相對定量。更精確的定量需要使用數位影像分析軟體。
  • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)：這是一種高度靈敏且可進行定量分析的免疫學方法。在 ELISA 檢測中，通過測量酶催化產生的顏色或螢光強度，來確定目標蛋白質的濃度。

要證明不同蛋白質之間是否存在交互作用（Protein-protein interaction, PPI），有許多實驗方法可供選擇，這些方法可以分為「體外 (in vitro)」和「體內 (in vivo)」兩種。以下列舉兩種常用且經典的方法：

1. 酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H)

• 原理：
  Y2H 是一種「體內」的篩選方法，用於檢測蛋白質之間的直接結合。該系統利用了轉錄因子（如 GAL4）的功能結構域：一個 DNA 結合域（DNA-binding domain, DBD）和一個激活域（activation domain, AD）。

  • 將第一個蛋白質（蛋白質 A）的基因與 DBD 融合，形成 DBD-A 融合蛋白。
  • 將第二個蛋白質（蛋白質 B）的基因與 AD 融合，形成 AD-B 融合蛋白。
  • 這兩種融合蛋白在酵母細胞中共同表達。
  • 如果蛋白質 A 和蛋白質 B 能夠在酵母細胞內相互結合，它們就會將 DBD 和 AD 帶到啟動子（promoter）的結合位點附近，重新組合成一個有功能的轉錄因子。
  • 這個重組的轉錄因子能夠激活下游報告基因（如 LacZ, HIS3）的表達。
  • 報告基因的表達（如藍色菌落或能在缺乏組胺酸的培養基上生長）就證明了蛋白質 A 和蛋白質 B 之間存在交互作用。

• 優點：

  • 是一種「體內」方法，可以在接近生理的環境下檢測蛋白質交互作用。
  • 適合用於高通量篩選，可以尋找未知蛋白與已知蛋白的交互蛋白。

• 限制：

  • 只能檢測「直接」的蛋白質交互作用。
  • 結果可能存在假陽性（如 DBD 或 AD 自身激活，或非特異性結合）和假陰性（如融合蛋白表達不穩定、蛋白質在細胞內定位錯誤、或交互作用需要輔助因子）。
  • 酵母細胞與哺乳動物細胞的生理環境有差異。

2. 共免疫沉澱法 (Co-Immunoprecipitation, Co-IP)

• 原理：
  Co-IP 是一種「體內」或「體外」皆可應用，但更常用於「體內」證明蛋白質交互作用的方法。
  • 首先，需要從表達目標蛋白質 A 和蛋白質 B 的細胞或組織中提取細胞裂解液。

蛋白質醣化（Glycosylation）是指將寡醣鏈（oligosaccharide chains）共價連接到蛋白質上的生物化學過程。這是真核細胞中最常見的翻譯後修飾（post-translational modification, PTM）之一，發生在內質網（ER）和高基氏體（Golgi apparatus）中。

蛋白質醣化的重要性：

蛋白質醣化對蛋白質的結構、功能、穩定性、定位以及細胞間的相互作用至關重要。其重要性體現在以下幾個方面：

1. 蛋白質摺疊與品質控制：在內質網中，醣基化是蛋白質正確摺疊和組裝的關鍵。例如，蛋白質上的寡醣鏈可以被內質網的伴侶蛋白（chaperones）識別，幫助蛋白質正確摺疊，並防止錯誤摺疊的蛋白質聚集。
2. 蛋白質穩定性：寡醣鏈的添加可以保護蛋白質免受蛋白酶的降解，從而增加蛋白質的半衰期和穩定性。
3. 蛋白質定位與運輸：特定的寡醣結構可以作為信號，指導蛋白質被運輸到正確的細胞器（如溶酶體），或被分泌到細胞外。
4. 細胞識別與黏附：細胞表面的醣蛋白（glycoproteins）上的寡醣鏈在細胞識別、免疫應答、細胞-細胞黏附以及病原體入侵等過程中扮演重要角色。
5. 信號傳導：許多細胞表面的受體是醣蛋白，其醣基化狀態可以影響受體與配體的結合能力，以及下游的信號傳導效率。
6. 酶活性調節：醣基化可以影響蛋白質的構象，進而調節其酶活性。

常見的蛋白質醣連接方式：

蛋白質醣化主要有兩種連接方式，取決於寡醣鏈與蛋白質中胺基酸殘基的結合方式：

1. N-醣苷鍵連接 (N-linked glycosylation)：
   • 連接方式：寡醣鏈的還原端（通常是 N-乙醯葡萄糖胺, GlcNAc）通過氮原子與蛋白質中天冬醯胺（Asparagine, Asn）殘基的側鏈醯胺基連接。

新冠肺炎病毒（SARS-CoV-2）是一種單股正鏈 RNA 病毒，屬於冠狀病毒科。其引起的疾病稱為 COVID-19。

(A) 此病毒的基本構造

SARS-CoV-2 病毒顆粒（virion）具有以下基本結構：

1. 基因組 (Genome)：病毒具有一個長約 30,000 個核苷酸的單股正鏈 RNA 基因組（(+)ssRNA）。這個 RNA 分子攜帶著病毒複製和組裝所需的遺傳信息。
2. 衣殼蛋白 (Nucleocapsid protein, N)：RNA 基因組與衣殼蛋白結合，形成核糖核酸複合物（nucleocapsid）。N 蛋白在病毒 RNA 的複製、包裝和轉錄過程中起重要作用。
3. 結構蛋白 (Structural proteins)：病毒顆粒包含四種主要的結構蛋白：
   • 刺突蛋白 (Spike protein, S)：這是病毒最顯著的特徵之一，形成病毒表面的「冠狀」結構。S 蛋白是病毒感染宿主細胞的關鍵，它介導病毒與宿主細胞受體的結合，並引發病毒膜與宿主細胞膜的融合。S 蛋白是一個大的跨膜糖蛋白，由 S1 和 S2 兩個亞基組成。S1 亞基負責結合宿主受體，S2 亞基則負責病毒膜與宿主細胞膜的融合。
   • 膜蛋白 (Membrane protein, M)：M 蛋白是病毒顆粒中最豐富的結構蛋白，它嵌入病毒包膜中，並參與病毒的組裝和出芽過程。
   • 包膜蛋白 (Envelope protein, E)：E 蛋白是一種小的跨膜蛋白，參與病毒的組裝、出芽和細胞內物質運輸。
   • 衣殼蛋白 (Nucleocapsid protein, N)：如前所述，與 RNA 基因組結合形成核糖核酸複合物。
4. 病毒包膜 (Viral envelope)：病毒顆粒被一層脂質雙層膜包裹，這層膜來源於宿主細胞膜（通常是細胞質膜或內體膜）。病毒的結構蛋白（S, M, E）嵌入或附著在這層包膜上。

(B) 怎麼入侵人體宿主細胞?

SARS-CoV-2 入侵人體宿主細胞主要分為以下幾個步驟：

1. 附著 (Attachment)：病毒表面的刺突蛋白（S 蛋白）的 S1 亞基與宿主細胞表面的特異性受體結合。
2. 受體介導的內吞或膜融合 (Receptor-mediated endocytosis or Membrane fusion)：
   • 路徑一 (TMPRSS2 依賴性途徑)：S 蛋白被宿主細胞表面的絲氨酸蛋白酶 TMPRSS2（Transmembrane Serine Protease 2）切割，使其 S2 亞基活化。活化的 S2 亞基會引發病毒包膜與宿主細胞質膜的直接融合，釋放病毒的 RNA 基因組到細胞質中。
   • 路徑二 (ACE2 和內體蛋白酶依賴性途徑)：S 蛋白與宿主細胞受體結合後，病毒被宿主細胞通過內吞作用（endocytosis）攝入細胞內，形成內體。在內體內，病毒的 S 蛋白會被內體中的蛋白酶（如 Cathepsin L）切割活化，引發病毒包膜與內體膜的融合，最終釋放病毒 RNA 到細胞質中。
3. RNA 釋放與複製 (RNA Release and Replication)：一旦病毒 RNA 進入細胞質，它就可以作為 mRNA 被宿主細胞的核糖體識別，開始合成病毒的複製酶（如 RNA 聚合酶）。這些複製酶隨後會複製病毒 RNA 基因組，並轉錄出病毒結構蛋白和非結構蛋白的 mRNA。

此題需根據提供的 ABO 血型譜系圖，推導出相關個體的血型及其機率。譜系圖中包含了小明的父母、小明、姊姊、姊夫、姊夫的父母（姊夫的爸爸媽媽）、姊夫的弟弟、姊姊的子女（外甥）。

首先，我們需要根據已知個體的血型和其親代的血型，推導出基因型。ABO 血型系統有三種等位基因：$I^A$ (對應 A 抗原), $I^B$ (對應 B 抗原), 和 $i$ (對應 O 抗原)。其表現型與基因型對應關係如下：

• A 型：$I^A I^A$ 或 $I^A i$
• B 型：$I^B I^B$ 或 $I^B i$
• AB 型：$I^A I^B$
• O 型：$ii$

分析譜系圖中的已知資訊：

1. 小明的父母：父親血型為 AB ($I^A I^B$)，母親血型為 O ($ii$)。

   • 父親提供 $I^A$ 或 $I^B$ 等位基因。
   • 母親提供 $i$ 等位基因。
   • 小明的血型為 B ($I^B i$)。這意味著小明從父親那裡繼承了 $I^B$ 等位基因，從母親那裡繼承了 $i$ 等位基因。
   • 推論：父親的基因型確定為 $I^A I^B$。母親的基因型確定為 $ii$。

2. 小明：血型為 B ($I^B i$)。

3. 姊姊：血型為 A ($I^A i$)。

   • 姊姊的基因型為 $I^A i$。這意味著她從母親（O 型, $ii$）那裡繼承了 $i$，從父親（AB 型, $I^A I^B$）那裡繼承了 $I^A$。這與父親的基因型 $I^A I^B$ 相符。

4. 姊夫：血型為 A ($I^A i$)。

   • 姊夫的基因型為 $I^A i$。這意味著他從父親（姊夫的爸爸）那裡繼承了 $I^A$，從母親（姊夫的媽媽）那裡繼承了 $i$。

5. 姊夫的爸爸：血型為 AB ($I^A I^B$)。

   • 姊夫的爸爸基因型確定為 $I^A I^B$。

6. 姊夫的媽媽：血型為 O ($ii$)。

   • 姊夫的媽媽基因型確定為 $ii$。

現在我們來推導姊夫的弟弟和外甥的血型：

I. 推導姊夫弟弟的血型

• 姊夫的弟弟與姊夫是同父母的兄弟。
• 姊夫的父母是：父親 (AB 型, $I^A I^B$) 和母親 (O 型, $ii$)。
• 他們所生的子女（包括姊夫和他的弟弟）的基因型只能是 $I^A i$ (A 型) 或 $I^B i$ (B 型)。
  • 父親提供 $I^A$ 或 $I^B$。
  • 母親提供 $i$。

此題要求根據提供的圖示，說明細胞移動（特別是游走，chemotaxis 或 haptotaxis）的步驟 (A→B→C→D) 以及參與的分子。圖示展示了一個細胞從一個較靜止或初始狀態 (A) 開始，逐漸變形、前進，並最終移動到新位置 (D) 的過程。

細胞移動的步驟 (A→B→C→D) 闡述：

這個圖示描述了細胞在外力或化學梯度引導下的移動過程，其核心是細胞膜的延伸、附著和收縮，以及細胞質的流動。

• 階段 A：準備與前沿延伸 (Preparation and Lamellipodium Extension)

  • 圖示 A 顯示細胞處於初始狀態，細胞前端開始出現一個扁平的、扇形擴展的結構，標示為 "Lamellipodium"（薄膜狀偽足）。
  • 同時，細胞前端出現了 "Focal adhesion"（細胞黏著點），這是細胞與細胞外基質 (ECM) 或其他表面相互作用的結構。
  • "Direction of movement" 指示了細胞移動的方向。
  • 參與分子：
    • 肌動蛋白 (Actin)：薄膜狀偽足的形成是通過肌動蛋白絲的聚合（polymerization）來實現的。肌動蛋白單體（G-actin）在細胞膜前端的細胞質中，在formin 等蛋白的幫助下，快速聚合形成肌動蛋白絲（F-actin），推動細胞膜向前延伸。
    • 肌球蛋白 (Myosin)：肌球蛋白 II (Myosin II) 參與肌動蛋白絲的收縮，為細胞移動提供動力。它與肌動蛋白絲形成交聯，並通過 ATP 水解提供能量，使肌動蛋白絲滑動，產生張力。
    • 整合素 (Integrins)：細胞膜上的整合素是細胞與 ECM 之間的關鍵受體。它們與 ECM 成分（如纖維連接蛋白 fibronectin, 層粘連蛋白 laminin）結合，形成細胞黏著點 (Focal adhesions)。這些黏著點提供細胞移動時的「錨點」。
    • 信號傳導分子：如 Rho GTPases (Rho, Rac, Cdc42)，它們是細胞骨架重組的關鍵調控者。Rac 促進薄膜狀偽足的形成，Rho 促進後方的收縮，Cdc42 參與細胞極性的建立。

• 階段 B：新的附著點形成與舊附著點解離 (New Adhesion Formation and Old Adhesion Dissociation)

  • 圖示 B 中，細胞前端繼續延伸，並形成了新的細胞黏著點 ("New adhesion")，這些黏著點位於細胞移動的前方。
  • 同時，細胞後方的舊黏著點 ("Old adhesion"，在圖 D 中標示) 開始解離。
  • 參與分子：
    • 整合素 (Integrins)：新的整合素與 ECM 結合，形成新的黏著點，為細胞提供新的前進支撐。