111 年 國立臺灣大學病理學研究所《微生物學及免疫學（B）》

本題主要在考察學生對日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus, JEV) 的基本認識，包括其分類、病毒結構、傳播途徑、宿主以及生命週期。

核心觀念： 病毒學、傳染病學、蟲媒病毒。

詳解：

日本腦炎病毒 (JEV) 是黃病毒屬 (Flavivirus) 的一種 RNA 病毒，屬於蟲媒病毒，是引起人類日本腦炎 (Japanese encephalitis, JE) 的主要病原體。

1. 病毒特徵 (Viral Characteristics):

• 分類： 屬於黃病毒屬 (Flavivirus)，與西尼羅病毒、登革病毒、黃熱病病毒等為近親。
• 結構：
  • 基因體： 單股正鏈 RNA 病毒 (+ssRNA)，基因體約 11 kb。
  • 衣殼： 由病毒蛋白 C (capsid protein) 構成。
  • 外套膜： 病毒有脂質外套膜，表面有 E 蛋白 (envelope protein) 和 M 蛋白 (matrix protein)，其中 E 蛋白是病毒感染宿主細胞的主要結構和抗原決定區。
• 抗原性： JEV 屬於 B 群腦炎病毒，有多種基因型，但通常只有一種血清型。疫苗主要針對主要的基因型 I。
• 傳播： 主要透過蚊子叮咬傳播，故稱為蟲媒病毒。

2. 生活史與傳播途徑 (Life Cycle and Transmission):

• 病媒蚊 (Vector): 主要傳播媒介是庫蚊屬 (Culex) 的蚊子，特別是 Culex tritaeniorhynchus。
• 宿主 (Host):
  • 主要宿主 (Amplifying host): 豬和鳥類是 JEV 的主要增殖宿主。蚊子吸食感染的豬或鳥類的血液後，病毒會在蚊子體內複製，再傳播給下一個宿主。

本題為一個較大的題組，涵蓋了嵌合抗原受體 (Chimeric Antigen Receptor, CAR) T 細胞治療的基礎知識、不同免疫細胞應用、載體技術以及在固態瘤治療上的挑戰。

核心觀念： 免疫學、基因工程、細胞治療、腫瘤免疫學。

---

2.1. 請簡述 CAR construct 的組成設計及其功能。(10分)

核心觀念： CAR 的結構與功能。

詳解：
CAR (Chimeric Antigen Receptor) 是一種基因工程改造的受體，它結合了抗體的抗原辨識能力與 T 細胞的殺傷訊號傳導能力，使得 T 細胞能夠辨識並攻擊表達特定抗原的癌細胞，而無需經過傳統的 T 細胞受體 (TCR) 活化途徑。

CAR Construct 的組成設計：
一個典型的 CAR construct 主要包含以下幾個部分：

1. 抗原辨識域 (Antigen-binding domain):

   • 組成： 通常來自單鏈可變區片段 (single-chain variable fragment, scFv)，這是從辨識癌細胞表面特定抗原的單株抗體衍生而來。
   • 功能： 能夠特異性地結合癌細胞表面的抗原分子，這是 CAR 能夠精準定位癌細胞的關鍵。

2. 連接區 (Hinge or Spacer region):

   • 組成： 通常是一段胺基酸序列，可能來自 IgG 的铰鏈區 (hinge region) 或其他蛋白質片段。
   • 功能： 提供彈性，讓抗原辨識域能夠以最佳角度接近並結合抗原，同時將抗原結合的訊號傳遞到細胞內訊號傳導域。

3. 跨膜區 (Transmembrane domain):

   • 組成： 一段疏水性的胺基酸序列，通常來自 T 細胞受體的 CD3-zeta 鏈或 CD8。
   • 功能： 將整個 CAR 分子錨定在細胞膜上，並將訊號從細胞外傳遞至細胞內。

4. 細胞內訊號傳導域 (Intracellular signaling domain):

   • 組成： 包含至少一個免疫受體酪胺酸活化基序 (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, ITAM)。
   • 第一代 CAR： 僅包含 CD3-zeta 鏈，提供 T 細胞活化所需的初步訊號。
   • 第二代 CAR： 在 CD3-zeta 鏈之外，額外包含一個共刺激分子 (co-stimulatory molecule) 的訊號傳導域，如 CD28 或 4-1BB (CD137)。
     • CD28： 提供強烈的活化訊號，促進 T 細胞的增生和存活。
     • 4-1BB (CD137)： 提供較持久的存活訊號，減少 T 細胞耗竭 (exhaustion)。
   • 第三代 CAR： 結合 CD3-zeta、CD28 和 4-1BB 等多個共刺激分子，以期提供更全面且持久的 T 細胞活化和存活訊號。
   • 功能： 當 CAR 結合抗原後，這些訊號傳導域會被活化，觸發細胞內一系列的訊號傳導路徑（如 PI3K-Akt、MAPK 路徑），最終導致 T 細胞的活化、增生、釋放細胞毒性分子（如穿孔素 perforin 和顆粒酶 granzymes）以及細胞激素（如 IFN-γ、TNF-α）等，進而殺死癌細胞。

CAR 的整體功能：
CAR 的主要功能是賦予免疫細胞（主要是 T 細胞）一種人為設計的、能夠獨立於 MHC 分子呈遞抗原而直接辨識癌細胞表面特定抗原的能力，並在結合後啟動細胞的殺傷機制，有效清除癌細胞。

【答案】CAR construct 由抗原辨識域 (scFv)、連接區、跨膜區及細胞內訊號傳導域 (至少一個 ITAM，如 CD3-zeta；第二代以上含 CD28 或 4-1BB 等共刺激域) 組成。其功能是讓免疫細胞（如 T 細胞）能不經 MHC 分子呈遞，直接辨識癌細胞表面特定抗原，結合後觸發細胞內訊號，啟動 T 細胞的增生、細胞毒殺作用及分泌細胞激素，進而清除癌細胞。

2.2. 請比較使用 CAR-T, CAR-NK 及 CAR-γδT 的優缺點。(10分)

核心觀念： 不同免疫細胞作為 CAR 載體的特性比較。

詳解：
CAR 療法最初主要應用於 T 細胞 (CAR-T)，但近年來也拓展到其他免疫細胞，如自然殺手細胞 (NK cells, CAR-NK) 和 γδ T 細胞 (CAR-γδT)，各自具有獨特的優缺點。

1. CAR-T (CAR-T cells):

• 優點：

  • 強大的殺傷力與記憶功能： 傳統 T 細胞具有良好的增生能力和免疫記憶，CAR-T 療法可產生持久的抗腫瘤反應，有利於預防復發。
  • 廣泛的應用與成熟的技術： CAR-T 療法是目前最成熟的 CAR 療法，在治療 B 細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤等血液腫瘤方面取得了顯著成功，技術和臨床經驗較為豐富。
  • 可調控性： T 細胞的活化、分化和功能可被較好地調控。

• 缺點：

  • 異體移植的排斥反應： 使用異體 T 細胞（來自健康捐贈者）時，會面臨移植物抗宿主疾病 (Graft-versus-host disease, GVHD) 的風險，以及宿主對異體細胞的免疫排斥。
  • 自體細胞的製備複雜與昂貴： 使用病患自體 T 細胞時，需要進行外體基因改造，製備過程耗時、成本高，且對於免疫功能受損的病患，其 T 細胞的品質和數量可能不足。
  • 細胞因子風暴 (Cytokine Release Syndrome, CRS) 和神經毒性 (ICANS)： 活化的 CAR-T 細胞會大量釋放細胞激素，引起全身性發炎反應 (CRS)，嚴重時可危及生命。部分病患還會出現神經系統毒性。
  • MHC 限制： 雖然 CAR 繞過了 MHC 呈遞，但 T 細胞的活化和功能依然受 MHC 限制，可能影響其在某些環境下的表現。

2. CAR-NK (CAR-NK cells):

• 優點：

  • 異體移植的優勢： NK 細胞天生具有較低的同種異體抗原，使其在異體移植時引起 GVHD 的風險極低，且較不易被宿主 T 細胞排斥。這使得 CAR-NK 細胞可以製備成「現成型」(off-the-shelf) 療法，方便使用。
  • 廣泛的抗腫瘤活性： NK 細胞本身就具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力（通過識別缺乏 MHC-I 的細胞），CAR 的加入可以進一步增強其特異性和殺傷力。
  • 較低的 CRS 風險： 相較於 CAR-T，CAR-NK 細胞引起的 CRS 風險通常較低。
  • 可與 CAR-T 聯合治療： NK 細胞和 T 細胞具有不同的作用機制，聯合使用可能產生協同效應。

• 缺點：

  • 免疫記憶較弱： NK 細胞的免疫記憶功能不如 T 細胞，其抗腫瘤反應的持久性可能較差。
  • 殺傷力可能不如 CAR-T： 在某些情況下，NK 細胞的細胞毒殺能力可能不如 T 細胞。
  • CAR 載體設計的挑戰： NK 細胞的基因轉導和工程改造相對 T 細胞更具挑戰性。

3. CAR-γδT (CAR-γδT cells):

• 優點：

  • 異體移植的潛力： γδ T 細胞與 αβ T 細胞相比，對 MHC 分子的依賴性較低，且某些 γδ T 細胞亞群引起的 GVHD 風險也較低，具有製備異體「現成型」療法的潛力。
  • 腫瘤識別廣泛： γδ T 細胞可以識別非肽抗原（如細胞應激標記物），且其活化不完全依賴 MHC，能識別更多類型的腫瘤細胞。
  • 可介導細胞毒殺與免疫調節： 既能直接殺傷腫瘤細胞，也能分泌細胞因子調節其他免疫細胞。

• 缺點：

  • 細胞數量相對較少： 外周血中 γδ T 細胞的比例相對較低，獲取足夠數量的細胞進行治療可能較困難。
  • 成熟度較低： 相較於 CAR-T，CAR-γδT 療法的研究和臨床應用仍處於早期階段，技術和臨床數據較少。
  • 異體移植的 GVHD 風險仍需評估： 雖然部分 γδ T 細胞 GVHD 風險較低，但仍需針對特定亞群和治療方案進行仔細評估。

總結比較：

特性	CAR-T	CAR-NK	CAR-γδT
主要優勢	強大殺傷力、免疫記憶、技術成熟	低 GVHD 風險、易製備異體療法、較低 CRS 風險	低 MHC 依賴、潛在異體療法、腫瘤識別廣泛
主要劣勢	GVHD 風險、製備複雜昂貴、CRS/ICANS	免疫記憶較弱、殺傷力可能較低、載體設計挑戰	細胞數量少、技術成熟度低、GVHD 風險仍需評估
應用潛力	血液腫瘤、固態瘤 (持續發展)	血液腫瘤、固態瘤、異體療法	血液腫瘤、固態瘤、異體療法

【答案】CAR-T 優點為強大殺傷力與免疫記憶、技術成熟，缺點為 GVHD 風險、製備昂貴、易有 CRS/ICANS。CAR-NK 優點為低 GVHD 風險、易製備異體療法、較低 CRS 風險，缺點為免疫記憶弱、殺傷力可能較低。CAR-γδT 優點為低 MHC 依賴、潛在異體療法、腫瘤識別廣泛，缺點為細胞數量少、技術成熟度低。

2.3. 請舉出數種可將 CAR construct 送入免疫細胞表達的方式,並說明其優缺點。(10分)

核心觀念： 基因轉導技術在 CAR 療法中的應用。

詳解：
將 CAR 的基因序列導入免疫細胞（如 T 細胞、NK 細胞）是 CAR 療法成功的關鍵步驟。常用的方法包括病毒載體和非病毒載體。

1. 病毒載體 (Viral Vectors):

• a) 反轉錄病毒載體 (Retroviral Vectors, 如 γ-retrovirus, lentivirus):
  • 原理： 病毒基因體中的 CAR 基因序列被整合到宿主細胞基因組中。慢病毒 (lentivirus) 是目前最常用的反轉錄病毒載體。
  • 優點：
    • 高效整合： 能夠高效地將基因整合到宿主細胞的基因組中，從而實現 CAR 的穩定、長期表達。
    • 感染分裂細胞和非分裂細胞： 慢病毒特別適合感染非分裂細胞（如靜止的 T 細胞），這是其相較於 γ-retrovirus 的一大優勢。

本題組涉及腸道菌相、懷孕期間的免疫活化以及其對後代發育和行為的影響，並要求學生設計實驗來驗證相關假設。

核心觀念： 微生物學、免疫學、神經科學、發育生物學、實驗設計。

---

3.1. 簡述作者主張懷孕母鼠若處於發炎情況將可能對其胎鼠所產生的影響。(10分)

核心觀念： 母體發炎對胎兒發育的影響。

詳解：
根據文章提供的圖像摘要，作者主張在懷孕期間，如果母鼠處於發炎狀態（Maternal Immune Activation, MIA），可能會對其胎鼠產生一系列負面影響，主要體現在以下幾個方面：

1. 腸道菌相失調 (Gut dysbiosis)： 發炎的母體可能影響其腸道菌相的平衡，導致腸道菌群組成改變。
2. 免疫系統改變：
   • IL-17A 的升高： 發炎狀態會導致母體產生較多的 IL-17A，這是一種促發炎細胞因子，可能穿過胎盤影響胎兒。
   • 胎兒免疫細胞發育異常： 胎鼠的 CD4+ T 細胞等免疫細胞可能發育或功能出現異常。
3. 行為異常 (Behavioral abnormalities)： 胎鼠出生後可能表現出行為異常，例如社交行為、學習能力或情緒調節等方面出現問題。
4. 對腸道疾病的易感性增加 (Enhanced susceptibility to intestinal inflammation)： 胎鼠長大後，其腸道系統對發炎的反應可能更為敏感，更容易罹患腸道炎症。
5. 染色質可及性改變 (Altered chromatin accessibility)： 發炎可能影響胎鼠細胞內 DNA 的結構（染色質），進而影響基因的表達調控，這可能是行為和生理異常的分子基礎。

總結： 作者主張，懷孕母鼠的發炎（Maternal Immune Activation, MIA）會透過多種途徑（如改變腸道菌相、影響母體細胞因子分泌、直接作用於胎兒發育）對胎鼠的免疫系統、腸道健康、神經行為以及長期的生理調控產生不利影響。

【答案】作者主張，懷孕母鼠處於發炎情況（Maternal Immune Activation, MIA）會導致胎鼠出現腸道菌相失調、免疫系統改變（如 IL-17A 升高、CD4+ T 細胞異常）、行為異常、對腸道發炎的易感性增加，以及細胞染色質可及性改變，進而影響胎鼠的長期發育和健康。

3.2. 你認為作者為達成此結論所應規劃的實驗設計為何?請舉出需檢測的項目之目的及原理,可善用文字配合簡圖表達。(25分)

核心觀念： 實驗設計、動物模型、免疫學檢測、行為學測試、分子生物學檢測。

詳解：
為了驗證「懷孕母鼠發炎對胎鼠的影響」這一假設，需要設計一個包含對照組和實驗組的動物實驗，並對母鼠、胎鼠及出生後的子代進行多方面的檢測。

實驗設計架構：

1. 動物模型： 使用實驗室常用的健康、非近親繁殖的成年母鼠。

2. 分組：

   • 對照組 (Control Group): 懷孕母鼠接受生理鹽水注射，模擬發炎誘導的處理，但不引起發炎反應。
   • 實驗組 (MIA Group): 懷孕母鼠接受發炎誘導劑（如 Poly(I:C) 或 LPS）進行腹腔注射，模擬母體免疫活化 (Maternal Immune Activation)。
   • 額外可考慮的組別：
     • 腸道菌相干預組： 對實驗組母鼠進行抗生素處理以改變菌相，或給予益生菌，觀察是否能改善胎鼠的後續影響。
     • 特定細胞因子阻斷組： 對實驗組母鼠在注射發炎誘導劑的同時，給予阻斷 IL-17A 等關鍵細胞因子的藥物。

3. 發炎誘導劑的選擇與時機：

   • Poly(I:C)： 模擬病毒感染，誘導 TRL3 活化，產生 I 型干擾素 (IFN)。
   • LPS (Lipopolysaccharide)： 模擬細菌感染，誘導 TRL4 活化，產生促發炎細胞因子（如 TNF-α, IL-6, IL-1β）。
   • 時機： 通常在懷孕中期（如懷孕第 9-12 天）進行注射，此時胎兒的神經系統和免疫系統發育活躍，對環境刺激更為敏感。

4. 觀察與檢測時程：

   • 懷孕期間： 監測母鼠體重、行為、發炎標記物。
   • 生產後： 記錄生產狀況、幼鼠存活率、體重。
   • 幼鼠期： 觀察幼鼠的生長發育、行為。
   • 成年期： 進行更全面的行為學測試、生理學檢測、免疫學分析和分子生物學分析。

需檢測的項目、目的與原理：

(A) 母鼠方面的檢測 (Maternal Assessment):

1. 血清細胞因子水平 (Serum Cytokine Levels):

   • 目的： 驗證發炎誘導劑是否成功誘導了母體發炎反應，並評估關鍵發炎因子（如 IL-17A, TNF-α, IL-6, IL-1β, IFN-γ）的變化。
   • 原理：
     • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): 通過抗原抗體反應，定量檢測血清中特定細胞因子的濃度。
     • Luminex 或 Flow Cytometry 結合細胞因子檢測： 可同時檢測多種細胞因子。

2. 腸道菌相分析 (Gut Microbiota Analysis):

   • 目的： 評估母體發炎是否改變了其腸道菌相的組成和多樣性。
   • 原理：
     • 16S rRNA 基因定序 (Sequencing): 分析糞便或腸道內容物中細菌的 16S rRNA 基因序列，識別細菌種類並評估群落結構（如 Alpha/Beta 多樣性、相對豐度）。
     • 宏基因組定序 (Metagenomic Sequencing): 提供更詳細的菌種信息及菌群的代謝潛力。

3. 母鼠行為觀察 (Maternal Behavior Observation):

   • 目的： 評估母鼠的育幼行為是否受發炎影響。
   • 原理： 記錄母鼠的築巢行為、母乳餵養行為、對幼鼠的保護行為等。

(B) 胎鼠/幼鼠/成年子代方面的檢測 (Offspring Assessment):

1. 胎鼠/幼鼠生理指標 (Offspring Physiological Parameters):
   • 目的： 評估發炎對胎鼠出生率、存活率、體重及生長發育的影響。
   • 原理： 記錄出生數、死胎數、幼鼠體重、出生後每日體重增長率。