108 年 國立臺灣大學藥理學系研究所《微生物學及免疫學（B）》

此題主要在考察學生對格蘭氏陰性菌與格蘭氏陽性菌細胞構造的理解，特別是細胞膜與細胞壁的組成與功能差異。

核心觀念： 格蘭氏染色法是根據細胞壁結構區分細菌的方法。格蘭氏陽性菌細胞壁主要由厚層肽聚醣組成，而格蘭氏陰性菌則有較薄的肽聚醣層，並額外具有外膜。

解題步驟：

1. 簡圖標示：

   • 格蘭氏陽性菌 (Gram-positive bacteria):
     • 細胞膜 (Cell membrane)
     • 厚層肽聚醣 (Thick peptidoglycan layer)
     • 偶爾有磷壁酸 (Teichoic acids) 錨定在肽聚醣中。
   • 格蘭氏陰性菌 (Gram-negative bacteria):
     • 細胞膜 (Cell membrane)
     • 薄層肽聚醣 (Thin peptidoglycan layer)
     • 周質空間 (Periplasmic space) 夾在細胞膜與外膜之間。
     • 外膜 (Outer membrane)，包含脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS)、脂蛋白 (Lipoprotein) 和孔蛋白 (Porins)。

   圖示說明：

   • 繪製一個圓形代表細菌。
   • 格蘭氏陽性菌：從內到外依序為細胞膜，然後是厚厚的肽聚醣層。
   • 格蘭氏陰性菌：從內到外依序為細胞膜，一個相對小的周質空間，然後是薄薄的肽聚醣層，最外層是較厚的細胞壁（外膜）。在外膜上標示 LPS 和孔蛋白。

2. 細胞膜 (Cell Membrane) 的異同：

   • 組成 (Composition): 兩者都主要由磷脂雙層 (phospholipid bilayer) 和蛋白質組成。
   • 功能 (Function): 兩者功能相同，都是細胞的屏障，控制物質進出（選擇性通透性），並參與能量代謝（如呼吸鏈）。

此題考驗學生對於基因工程、蛋白質表現、純化以及抗體產生流程的理解與整合能力。核心在於如何設計一個從基因建構到產生抗體的實驗流程，並說明各步驟的原理。

核心觀念： 基因重組技術、原核表現系統、親和層析純化、動物免疫產生抗體。

實驗流程設計與說明：

整個流程可分為三大階段：
I. 重組蛋白 (6His-A) 的製備與純化
II. 動物免疫產生抗體
III. 抗體檢測與應用 (此部分為抗體產生後的延伸，但為完整性會簡述)

I. 重組蛋白 (6His-A) 的製備與純化

1. 基因建構 (Gene Construction):

   • 目的： 將抗原 A 的基因序列與 6個組胺酸 (Histidine) 的編碼序列，以適當的連接方式，建構成一個重組 DNA 分子。
   • 方法：
     • 取得抗原 A 的 cDNA 或基因序列。
     • 透過 PCR (Polymerase Chain Reaction) 擴增目標基因，並在其兩端引入適當的限制酶切點 (restriction enzyme sites) 或進行黏性末端 (sticky ends) 的設計。
     • 將 6個組胺酸編碼序列 (通常是 18個組胺酸的密碼子，如 CAT 或 CAC) 的合成寡核苷酸，同樣處理成可連接的序列。
     • 將抗原 A 基因和 6xHis 序列，使用連接酶 (ligase) 和適當的載體 (vector) 進行連接。載體通常是一個質體 (plasmid)，其中包含啟動子 (promoter)、終止子 (terminator)、複製起始點 (origin of replication) 以及抗生素抗性基因 (antibiotic resistance gene) 等。
   • 原因與原理：
     • 6xHis tag： Histidine 殘基能與過渡金屬離子（如 Ni²⁺, Co²⁺）強烈結合。這為後續的親和層析純化提供了基礎。將其接在抗原 A 的 N-端或 C-端，通常不影響抗原的結構或功能。
     • 載體： 提供 DNA 的複製能力，並包含必要的調控元件（如啟動子）來驅動目標基因的表現。抗生素抗性基因用於篩選轉形成功的細菌。

2. 細菌轉形 (Bacterial Transformation):

   • 目的： 將含有重組 DNA 的載體導入大腸桿菌 (E. coli) 細胞。
   • 方法：
     • 化學法 (Chemical Competence): 使用二價陽離子（如 CaCl₂）處理大腸桿菌，使其細胞膜通透性增加，然後將質體 DNA 與處理過的細菌混合，並進行熱休克 (heat shock) 或低溫孵育。
     • 電穿孔法 (Electroporation): 利用高壓電脈衝瞬間打開細菌細胞膜的孔洞，讓質體 DNA 進入。
   • 原因與原理： 質體 DNA 難以自行穿過細菌細胞膜，需要外力輔助。成功轉形的細菌才能在含有抗生素的培養基上生長。

3. 篩選與擴增 (Selection and Amplification):

   • 目的： 篩選出成功轉入重組載體的細菌，並使其大量增殖。
   • 方法：
     • 將轉形後的細菌塗抹在含有適當抗生素（如氨苄青黴素 Ampicillin, AmpR）的固體培養基平板上，並於 37°C 培養。
     • 挑選長出的菌落 (colonies)，並在含有相同抗生素的液體培養基中進行擴大培養。
   • 原因與原理： 只有成功轉入含有抗生素抗性基因（如 AmpR）的載體的細菌才能在抗生素存在下存活並生長。

4. 誘導蛋白質表現 (Induction of Protein Expression):

   • 目的： 誘導細菌表現出目標重組蛋白 (6His-A)。
   • 方法：
     • 當細菌生長到一定密度 (OD₆₀₀ 值，例如 0.6-0.8) 時，加入誘導劑 (inducer)。如果使用的是 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 誘導的 lac 啟動子系統，則加入 IPTG。
     • 在誘導條件下（通常是 37°C 或較低溫度，如 18-25°C，以提高可溶性蛋白產量和正確摺疊）繼續培養一段時間（例如 4-24 小時）。
   • 原因與原理： 許多重組蛋白的表現載體使用可誘導啟動子（如 lac 啟動子）。在沒有誘導劑時，啟動子被阻遏蛋白 (repressor) 抑制，目標基因表現量低。加入誘導劑（如 IPTG）會結合阻遏蛋白，使其脫離啟動子，從而啟動目標基因的高量表現。較低的培養溫度有助於蛋白質正確摺疊，減少包涵體 (inclusion bodies) 的形成。

5. 細胞裂解與蛋白提取 (Cell Lysis and Protein Extraction):

   • 目的： 打破細菌細胞，釋放出目標蛋白。
   • 方法：
     • 收集細菌細胞（離心）。
     • 使用細胞裂解緩衝液 (lysis buffer)，其中可能包含：
       • 鹽 (Salt): 如 NaCl，調節離子強度。
       • pH 緩衝劑: 如 Tris-HCl，維持 pH 穩定。
       • 去垢劑 (Detergent): 如 Triton X-100 或 NP-40，幫助溶解細胞膜。
       • 還原劑 (Reducing agent): 如 DTT (Dithiothreitol) 或 β-mercaptoethanol，防止蛋白質二硫鍵形成，保持其活性。
       • 蛋白酶抑制劑 (Protease inhibitors): 防止細胞內蛋白酶降解目標蛋白。
       • 咪唑 (Imidazole): 在此階段加入少量咪唑（約 10-20 mM）可以預防 His-tag 與層析柱上的金屬離子過度結合，有利於後續純化。
     • 可採用物理方法（如超音波處理 sonication、高壓均質機 homogenization）或化學方法（如溶菌酶 lysozyme）輔助裂解。
   • 原因與原理： 裂解是釋放細胞內蛋白的前提。緩衝液成分的選擇旨在維持蛋白活性並促進溶解。

6. 親和層析純化 (Affinity Chromatography Purification):

   • 目的： 利用 6xHis-tag 的特性，特異性地分離出目標重組蛋白。
   • 方法：
     • 使用含有固定化金屬離子（如鎳離子 Ni²⁺）的層析介質（如 Ni-NTA agarose）。
     • 將裂解後的細胞提取液上樣到裝有 Ni-NTA 介質的層析柱上。
     • 用低濃度咪唑的緩衝液洗滌，去除非特異性結合的蛋白質。
     • 用高濃度咪唑的洗脫緩衝液 (elution buffer) 洗脫。咪唑分子能與金屬離子競爭性結合，取代 His-tag，從而釋放出純化的 6His-A 蛋白。
   • 原因與原理： 6個組胺酸殘基的鄰近排列使其能與金屬離子形成穩定的螯合物。咪唑是結構類似 His-tag 的小分子，高濃度時能有效競爭性地將 His-tag 從金屬離子上取代下來，從而洗脫出目標蛋白。

7. 質控與定量 (Quality Control and Quantification):

   • 目的： 檢測純化蛋白的純度、濃度和活性。

此題要求學生解釋一篇學術論文中圖表的含義，並提出個人見解。這考驗學生閱讀圖表、理解複雜生物學概念、整合資訊以及提出批判性思考的能力。圖 2 描繪了膠質母細胞瘤 (glioma) 微環境中的免疫抑制性細胞成分及其作用機制。

核心觀念： 腫瘤微環境 (Tumor Microenvironment, TME)，免疫逃逸 (Immune Evasion)，免疫抑制細胞 (Immunosuppressive Cells)，腫瘤幹細胞 (Cancer Stem Cells, CSCs)，細胞因子 (Cytokines)，免疫檢查點 (Immune Checkpoints)。

Dr. Wang 想表達的概念 (文字說明)：

圖 2 旨在闡述膠質母細胞瘤 (glioma) 的微環境中，腫瘤細胞（特別是腫瘤幹細胞）如何透過釋放多種訊號分子，調控並招募各種免疫抑制性細胞，共同營造一個有利於腫瘤生長、逃避免疫監視的微環境。

具體來說，圖示展示了以下幾個關鍵點：

1. 腫瘤細胞是訊息中心： 膠質母細胞瘤細胞（特別是腫瘤幹細胞，雖然圖中未直接標示 CSC，但文章標題點出）是釋放免疫抑制性分子的主要來源。這些分子（如 CCL2, CSF-1, CXCL1, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, VEGF, PEG-2, TGF-β 等）在圖的各個分支中都有體現。
2. 招募與活化免疫抑制性細胞： 這些腫瘤來源的訊號分子，如同「化學引誘劑」，能吸引多種免疫抑制細胞進入腫瘤微環境，並影響它們的功能。圖中列出了主要的免疫抑制細胞群：
   • 腫瘤相關巨噬細胞 (Tumor-associated macrophages, TAMs): 尤其是在 A 部分，CCL2, CSF-1, CXCL1 等招募 TAMs。TAMs 在腫瘤微環境中常表現出 M2 樣極化，釋放 TGF-β, IL-10 等，抑制 T 細胞功能。
   • 骨髓衍生抑制細胞 (Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs): B 部分顯示，IL-1β, IL-6, IFN-γ, VEGF, PEG-2, TGF-β 等可以促進 MDSCs 的招募和擴增。MDSCs（包括 G-MDSC 和 M-MDSC）通過消耗關鍵氨基酸（如 L-arginine, L-cysteine）和產生活性氧 (ROS) 或一氧化氮 (NO)，抑制 T 細胞和 NK 細胞的活化。
   • 調節性 T 細胞 (Regulatory T cells, Tregs): C 部分說明了 CCL28-CCR10 和 CCL22-CCR4 軸在招募 Tregs 中的作用。Tregs 通過釋放 TGF-β 和 IL-10，以及直接與效應 T 細胞接觸，來抑制 T 細胞的免疫反應。
   • 其他細胞： 圖中也提及了 NK 細胞 (NK cell) 和 B 細胞 (Breg)，儘管它們在免疫抑制中的具體作用可能更複雜。DC (樹突狀細胞) 在腫瘤微環境中也可能被誘導為免疫抑制表型。
3. 細胞因子和分子機制： 各種免疫抑制細胞釋放的細胞因子（如 TGF-β, IL-10, IL-2, IFN-γ）和分子（如 PD-L1, Arginase 1, NKG2D 配體）共同作用，達到免疫抑制效果。
   • PD-1/PD-L1 軸： B 部分顯示 PD-L1 在腫瘤細胞或免疫細胞上表達，與 T 細胞上的 PD-1 結合，導致 T 細胞耗竭 (exhaustion) 和凋亡。
   • Arginase 1, NO, ROS： MDSCs 產生這些物質，耗盡 T 細胞所需的精氨酸，或直接損傷 T 細胞。
   • NKG2D 配體： 腫瘤細胞可能上調 NKG2D 配體，但這可能同時增加對 NK 細胞的敏感性，也可能是腫瘤細胞的一種複雜策略。
   • 血管生成 (Angiogenesis)： VEGF 等細胞因子促進腫瘤血管生成，這不僅為腫瘤提供營養，也可能影響免疫細胞的浸潤。
   • 抵抗凋亡 (Resistance to apoptosis)： 腫瘤細胞獲得抵抗凋亡的能力，使其得以在不利環境中生存。