109 年 國立臺灣大學病理學研究所《微生物學及免疫學（B）》

本題主要在探討黴漿菌（Mycoplasma）的生物學特性，屬於微生物學的基礎知識。黴漿菌是一類特殊的原核生物，因其缺乏細胞壁，在結構、遺傳、致病機制及藥物敏感性等方面都與其他細菌有顯著差異。

一、 細胞特徵

1. 結構與形態：

   • 最小的原核生物：黴漿菌是已知最小的、能夠獨立生存的原核生物，直徑約 0.2-0.3 微米，介於病毒和一般細菌之間。
   • 無細胞壁：這是黴漿菌最顯著的特徵。它們只有一層細胞膜，沒有肽聚醣（peptidoglycan）構成的細胞壁。這使得它們對滲透壓非常敏感，也影響了它們對抗生素的敏感性（例如，青黴素類抗生素因作用於細胞壁合成而被無效）。
   • 多樣的形態：由於缺乏細胞壁的約束，黴漿菌的形態變化多端，可以呈球狀、桿狀、絲狀，甚至出現特殊的「分枝」結構，常被描述為「瓶塞狀」或「煎蛋狀」。
   • 細胞膜：細胞膜是黴漿菌最外層結構，含有膽固醇（唯一已知能自行合成膽固醇的原核生物，但大多數是從宿主細胞攝取）以增加穩定性，這也是它們區別於其他細菌的特點。

2. 基因體：

   • 最小的基因體：黴漿菌擁有最小的原核生物基因體，通常只有 0.5-1.5 百萬鹼基對（Mb）。
   • 基因數少：基因數量也相對較少，約 500-1000 個基因，這反映了它們高度簡化的代謝和依賴宿主生存的策略。
   • 基因組結構：與大多數細菌一樣，它們通常有一個單一的、環狀的 DNA 分子。
   • 基因缺失：為了適應寄生生活，許多維持獨立生存所必需的基因（如參與核酸合成、胺基酸合成、細胞壁合成等）已在演化過程中丟失。

3. 代謝與生長：

   • 嚴格的寄生性：絕大多數黴漿菌是專性寄生生物，依賴宿主細胞獲取必需的營養物質和能量。
   • 需氧或兼性厭氧：部分種類為好氧，部分為兼性厭氧。
   • 特殊營養需求：它們需要從宿主攝取膽固醇、脂肪酸、胺基酸和核苷酸等，這也是其基因體簡化的原因。

4. 藥物耐受性：

   • 對 β-內醯胺類抗生素無效：由於缺乏細胞壁，對青黴素、頭孢菌素等作用於肽聚醣合成的抗生素無效。
   • 對四環黴素、大環內酯類、喹諾酮類敏感：這些抗生素作用於細菌的核糖體（如 50S 或 30S 核糖體次單元）或 DNA 複製，因此對黴漿菌有效。
   • 內源性抗藥性：某些黴漿菌菌株可能因其核糖體結構或藥物外排機制的改變，對某些抗生素產生內源性抗藥性。
   • 生物膜形成：部分黴漿菌能夠形成生物膜（biofilm），這會增加其對抗生素的抵抗力，因為生物膜內的細菌代謝活性較低，且生物膜結構本身也可能阻礙藥物滲透。

二、 病理特性

黴漿菌可引起多種疾病，主要通過以下機制致病：

本題考驗的是對病毒基因體定序技術的了解，以及如何應用基因體序列進行病毒學研究。2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的出現，使得病毒基因體定序成為公共衛生和科學研究的熱點。

一、 病毒全基因體定序方法

在得到疑似變型病毒檢體後，進行全基因體定序是確定其遺傳物質、結構和演化關係的關鍵步驟。以下是幾種常用的方法及其優缺點：

1. ** Sanger 定序法 (Sanger Sequencing)**

   • 原理：基於 DNA 聚合酶鏈終止法，通過加入帶有螢光標記的鏈終止核苷酸（ddNTPs）來合成 DNA 片段，並通過電泳分離不同長度的片段，最終讀取 DNA 序列。
   • 應用於病毒定序：由於病毒基因體相對較小，可以將病毒 RNA 反轉錄為 cDNA 後，設計引物對整個基因體或部分基因體進行 PCR 擴增，然後對 PCR 產物進行 Sanger 定序。
   • 優點：
     • 準確性高，單讀長（read length）可達 500-1000 bp。
     • 相對便宜，適合定序少量樣品或驗證特定序列。
     • 技術成熟，操作相對簡單。
   • 缺點：
     • 通量低：不適合大規模、快速的定序需求。
     • 成本高：對於全基因體定序，需要大量的引物和多次 PCR，總體成本較高。
     • 無法處理複雜混合樣品：難以有效分離和定序樣品中的多種病毒或變異。
     • 需要已知序列設計引物：如果病毒變異較大，難以設計出通用引物。

2. 新一代定序技術 (Next-Generation Sequencing, NGS)

   • 原理：通過大規模平行定序（Massively Parallel Sequencing），一次可以定序數百萬到數十億個 DNA 片段。主要技術包括 Illumina、Ion Torrent 等。
   • 應用於病毒定序：
     • 文庫製備：將病毒 RNA 反轉錄為 cDNA，然後將 cDNA 打斷成小片段，連接接頭（adapters），形成定序文庫。
     • 定序：在定序儀上進行高通量定序，產生大量短讀長（short reads, 50-300 bp）或中等讀長（medium reads, 300-600 bp）的數據。
     • 數據組裝：利用生物資訊學工具，將這些短讀長數據組裝成完整的基因體序列。
   • 優點：
     • 極高的通量和速度：能夠快速完成大量樣品的基因體定序，適合突發疫情的監測。
     • 成本效益高：單個鹼基的定序成本遠低於 Sanger 定序。
     • 能夠檢測低頻率變異：可以發現樣品中存在的稀有變異或混合感染。
     • 無需預先設計引物（或部分無需）：可進行全基因體隨機打斷定序（shotgun sequencing），適用於未知或高度變異的基因體。
   • 缺點：
     • 讀長較短：短讀長在基因體組裝時可能遇到困難，尤其是在重複區域或複雜的基因體結構中。
     • 數據分析複雜：需要專業的生物資訊學知識和強大的計算資源。
     • 技術門檻相對較高。

3. 第三代定序技術 (Third-Generation Sequencing, TGS)

   • 原理：代表性技術是 PacBio（Pacific Biosciences）和 Oxford Nanopore。這些技術能夠直接對長片段的 DNA 或 RNA（無需 PCR 擴增）進行定序，產生非常長的讀長（數千到數百萬 bp）。
   • 應用於病毒定序：
     • 直接 RNA 定序：Oxford Nanopore 技術可以直接定序 RNA 分子，無需反轉錄和 PCR，大大縮短了實驗流程，並可能保留 RNA 的修飾資訊。
     • 長讀長組裝：PacBio 和 Nanopore 的長讀長能夠跨越重複區域，更輕鬆、準確地組裝完整的病毒基因體，甚至可以解析病毒基因體的結構變異。
   • 優點：
     • 超長讀長：能一次讀取完整的病毒基因體，極大簡化了組裝過程，提高了準確性。
     • 快速實驗流程：Oxford Nanopore 可實現實時定序，非常適合快速現場檢測。
     • 直接 RNA 定序：無需反轉錄，減少了引入誤差的機會。
   • 缺點：

本題主要考查對免疫細胞（特別是 NK 細胞）在抗癌免疫中的作用機制，以及免疫細胞療法的應用與挑戰。圖 4 描繪了 NK 細胞與腫瘤微環境中其他細胞（包括癌細胞、T 細胞、MDSC、DC）的交互作用。

一、 NK 細胞與癌細胞的交互影響（依圖 4 解釋）

圖 4 展示了 NK 細胞在腫瘤微環境中的多種功能和與其他細胞的互動。Campana 教授團隊可能藉此圖說明 NK 細胞如何識別、殺傷癌細胞，以及腫瘤微環境如何調節 NK 細胞的功能。

1. NK 細胞的殺傷機制：

   • 直接腫瘤細胞殺傷 (Direct tumour cell killing)：NK 細胞是「天生」的免疫細胞，能夠識別並殺傷未表現 MHC class I 分子的腫瘤細胞（「Missing-self」假說）。同時，NK 細胞也通過活化受體（Activating receptor）識別腫瘤細胞上的壓力誘導分子（stress-induced molecules）或腫瘤相關抗原，進而啟動細胞毒性殺傷。圖中顯示 NK 細胞直接殺傷癌細胞。
   • 釋放細胞因子：NK 細胞活化後可分泌干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子，這些細胞因子不僅能增強 NK 細胞自身的活性，還能激活其他免疫細胞，如巨噬細胞和 T 細胞，進一步協調抗腫瘤免疫反應。IFN-γ 的釋放也可能上調癌細胞的 MHC class I 表達，使其更容易被細胞毒性 T 細胞識別。

2. NK 細胞與腫瘤微環境的交互作用：

   • 與 T 細胞的交互：
     • NK 細胞分泌的 IFN-γ 可以促進 T 細胞的活化和分化。
     • 圖中顯示 T 細胞可能受到「Checkpoint inhibitors」的影響，這表示腫瘤微環境中存在抑制 T 細胞活性的因素，NK 細胞的介入可能需要克服這些抑制。
     • NK 細胞也可能與 T 細胞協同作用，共同殺傷腫瘤細胞。
   • 與樹突狀細胞 (DC) 的交互：
     • NK 細胞可以通過釋放 IL-2 等細胞因子，促進 DC 的招募和活化（Recruitment/activation of DCs）。
     • 被激活的 DC 能夠有效地呈現腫瘤抗原給 T 細胞，啟動適應性免疫反應。
     • DC 也可以分泌 IL-12，進一步促進 NK 細胞的活化和 IFN-γ 分泌，形成正反饋循環。
   • 與髓源性抑制細胞 (MDSC) 的交互：
     • MDSC 是一類免疫抑制細胞，在腫瘤微環境中普遍存在，它們可以抑制 NK 細胞和 T 細胞的活性。
     • 圖中顯示 NK 細胞可能受到 MDSC 的「Killing of inhibitory」作用，表明 MDSC 能夠抑制 NK 細胞的功能。
     • NK 細胞與 MDSC 的相互作用是複雜的，有時 NK 細胞也能殺傷 MDSC，或通過分泌細胞因子影響 MDSC 的分化和功能。
   • 與癌細胞的標靶分子交互：
     • NK 細胞通過活化受體（Activating receptor）與癌細胞上的配體（Activating ligand）結合，啟動殺傷。
     • NK 細胞也表達抑制性受體（Inhibitory receptor），如與 MHC class I 結合的受體。當腫瘤細胞高表達 MHC class I 時，抑制性信號會佔優勢，抑制 NK 細胞的殺傷。
     • NK 細胞表達的 PD-1 和 CTLA-4（與癌細胞上的 PD-L1 和 B7 結合）是免疫檢查點分子，其相互作用可能影響 NK 細胞的活化狀態。

總結圖 4 的交互影響：NK 細胞通過直接殺傷、釋放細胞因子來影響癌細胞和腫瘤微環境。它們與 T 細胞、DC 協同作用以增強抗癌免疫，但同時也受到 MDSC 和癌細胞自身表達的免疫抑制分子（如 PD-L1）的影響，導致其功能受損。

二、 採用 NK 細胞療法對抗癌症時需要特別注意的事項

NK 細胞療法作為一種有前景的癌症治療手段，但也面臨諸多挑戰和需要注意的事項：

1. NK 細胞的來源與製備：

   • 自身 NK 細胞：從患者自身外周血或骨髓中分離，但數量可能不足，且患者體內的 NK 細胞可能已經被腫瘤微環境所抑制或耗竭。
   • 異體 NK 細胞：從健康捐贈者（如臍帶血、外周血、骨髓）獲得。異體 NK 細胞的優勢是數量充足且活性較高。
   • CAR-NK 細胞：通過基因工程改造，使 NK 細胞表達嵌合抗原受體（CAR），增強其對特定腫瘤抗原的識別和殺傷能力。
   • 培養與擴增：需要高效的體外培養和擴增技術，以獲得足夠數量的功能性 NK 細胞。培養過程中需注意維持 NK 細胞的活性、表型和功能，避免細胞耗竭或轉化。

2. 腫瘤微環境的抑制作用：

   • 免疫抑制因子：腫瘤微環境中存在大量免疫抑制因子（如 TGF-β、IL-10、VEGF）和免疫抑制細胞（如 MDSC、調節性 T 細胞 Treg），它們會顯著抑制 NK 細胞的活化、增殖和細胞毒性。
   • 靶點表達問題：腫瘤細胞可能下調 MHC class I 分子的表達，以逃避 T 細胞識別，但這反而會使腫瘤細胞更容易被 NK 細胞識別。