111 年 國立中山大學生物科學系碩士班乙組《生物化學》

本題主要在考察學生對有機物代謝氧化過程的三階段概念的理解。

有機物代謝氧化過程通常被描述為三個主要階段，旨在逐步分解有機物並釋放能量，最終產物是二氧化碳、水和 ATP。

第一階段：胺基酸、脂肪酸、葡萄糖的分解
在這個階段，大型的有機分子（如多醣、脂質、蛋白質）首先被分解成較小的單元，例如葡萄糖、脂肪酸和胺基酸。

• 葡萄糖：通過糖解作用（glycolysis）分解為丙酮酸（pyruvate）。這個過程發生在細胞質，產生少量的 ATP 和 NADH。
• 脂肪酸：通過 β-氧化（beta-oxidation）分解為乙醯輔酶 A（acetyl-CoA）。這個過程發生於粒線體基質，產生 NADH 和 FADH2。
• 胺基酸：通過脫胺作用（deamination）移除胺基，其碳骨架可以進入三羧酸循環或轉化為葡萄糖。

第二階段：丙酮酸與脂肪酸的氧化，進入三羧酸循環
在這個階段，來自第一階段的產物（主要是乙醯輔酶 A）被進一步氧化。

• 丙酮酸的轉化：丙酮酸進入粒線體，被轉化為乙醯輔酶 A，同時釋放一分子 CO2 並產生 NADH。
• 三羧酸循環（Citric Acid Cycle / Krebs Cycle）：乙醯輔酶 A 進入三羧酸循環，與草醋酸結合，經過一系列反應，最終釋放出兩分子 CO2，並產生少量的 ATP（或 GTP）、大量的 NADH 和 FADH2。這個過程發生在粒線體基質。

本題主要在考察學生對免疫球蛋白（抗體）產生巨大多樣性的機制，以應對各種抗原。

免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig），即抗體，是 B 細胞產生的蛋白質，能特異性地結合抗原。為了能夠識別幾乎無限數量的抗原，抗體分子必須具有極大的結構多樣性。這種多樣性主要通過體細胞重組（somatic recombination）機制產生，尤其是在 B 細胞發育過程中。

產生抗體多樣性的主要機制包括：

1. 基因片段的多樣性重組（V(D)J Recombination）：

   • 抗體的重鏈（heavy chain）和輕鏈（light chain）的變異區（variable region）是由多個不同的基因片段（V, D, J 基因片段）組合而成。
   • 重鏈：由 V (Variable), D (Diversity), J (Joining) 三種類型的基因片段組成。一個 B 細胞在發育過程中，會隨機選擇一個 V 片段、一個 D 片段和一個 J 片段，通過 V(D)J 重組將其連接起來。
   • 輕鏈：由 V (Variable) 和 J (Joining) 兩種基因片段組成。同樣，一個 B 細胞會隨機選擇一個 V 片段和一個 J 片段進行連接。
   • 由於每個類型的基因片段都有多個拷貝，例如人類的重鏈 V 基因有數十個，D 基因有十幾個，J 基因有數個；輕鏈 kappa 鏈有數十個 V 基因和數個 J 基因，輕鏈 lambda 鏈也有類似的多樣性。
   • V(D)J 重組的隨機組合，可以產生極其龐大的變異區胺基酸序列組合。

2. 接合點脫氧核苷酸的插入（Junctional Diversity）：

   • 在 V(D)J 重組過程中，當基因片段連接時，可能會在連接處隨機插入或刪除一些核苷酸（稱為 N-區段插入，N-nucleotides）。
   • 這種隨機的核苷酸插入和刪除，會導致連接點的序列發生變異，進一步增加了變異區胺基酸序列的多樣性。

3. 體細胞高頻突變（Somatic Hypermutation, SHM）：

本題主要考察學生對免疫檢查點（Immune Checkpoints）機制的理解，以及舉例說明。

免疫檢查點是免疫系統中的一種調節機制，主要由細胞表面的受體及其配體組成，用於抑制過度的免疫反應，防止自身免疫疾病和維持免疫耐受。這些檢查點通常在免疫反應的特定階段被激活，以關閉或減弱 T 細胞的活化和功能。

以下提供兩個免疫檢查點機制的例子：

1. CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4)

• 定位與配體：CTLA-4 是一種免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，主要在活化的 T 細胞表面表達。它的配體是 B7 家族的分子，包括 CD80 (B7-1) 和 CD86 (B7-2)。
• 作用機制：T 細胞活化需要兩種信號。信號一來自 T 細胞受體 (TCR) 與抗原呈遞細胞 (APC) 的主要組織相容性複合體 (MHC) 結合，信號二是來自 T 細胞表面的共刺激分子 CD28 與 APC 表面的 B7 分子結合。CTLA-4 與 B7 分子的結合親和力比 CD28 更高。當 CTLA-4 表達上調後，它會與 APC 上的 B7 分子競爭性結合，從而阻止 CD28 與 B7 的結合。
• 免疫抑制作用：通過競爭性抑制共刺激信號，CTLA-4 能夠抑制 T 細胞的增殖、活化和細胞因子產生，尤其是在免疫反應的早期階段，起到負向調節作用，防止過度的免疫反應。

2. PD-1 (Programmed cell death protein 1)

• 定位與配體：PD-1 也是一種免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，在活化的 T 細胞、B 細胞、NK 細胞等表面表達。其主要的配體是 PD-L1 (Programmed death-ligand 1) 和 PD-L2。PD-L1 在多種細胞（包括腫瘤細胞、免疫細胞）上表達，而 PD-L2 主要在 APC 上表達。

本題主要考察學生對細胞自噬（Autophagy）過程的理解。

細胞自噬是一種細胞內物質降解的過程，通過自噬體（autophagosome）將細胞質中的成分（如受損的細胞器、蛋白質聚集體、外來病原體等）包裹起來，然後與溶酶體（lysosome）融合，由溶酶體內的酶將包裹的物質降解。這是一個維持細胞穩態、細胞質重塑和能量代謝的關鍵過程。

細胞自噬的過程主要可分為三個階段：

1. 起始與成核（Initiation and Nucleation）：

   • 在細胞受到壓力（如營養缺乏、能量危機、氧化應激、內質網應激）或需要清除特定細胞組分時，自噬通路被激活。
   • 一個稱為「自噬體起始複合物」（autophagosome initiation complex）的膜結構在細胞質中形成，通常涉及一系列的蛋白質複合物，例如 ULK1/2 複合物（人源為 ULK1）、Beclin-1 (ATG6) 複合物（包含 VPS34, VPS15, ATG14L 等）。
   • 這些複合物負責招募膜組分，並啟動自噬體的形成。

2. 膜延伸與自噬體形成（Membrane Elongation and Autophagosome Formation）：

   • 起始複合物啟動後，來自不同細胞內膜來源（如內質網、高爾基體、線粒體、質膜）的膜被招募並延伸，形成一個雙層膜的囊泡，稱為吞噬體（phagophore）。
   • 這個過程依賴於兩個主要的膜脂化系統：
     • ATG12-ATG5-ATG16L1 複合物：ATG12 被共價結合到 ATG5，然後與 ATG16L1 形成一個複合物，參與膜的延伸和彎曲。

本題主要考察學生對無機氮代謝與有機氮代謝之間關係的理解。

氮是生命必需的元素，存在於蛋白質、核酸、輔酶等重要生物分子中。自然界中的氮循環涉及無機氮和有機氮化合物之間的轉化，並且這些轉化與生物的代謝活動密切相關。

無機氮：主要包括銨離子（$NH_4^+$）、硝酸根離子（$NO_3^-$）和亞硝酸根離子（$NO_2^-$）。
有機氮：主要指存在於生物體內的含氮有機化合物，如胺基酸、蛋白質、核酸、尿素等。

無機氮與有機氮代謝之間的關係主要體現在以下幾個方面：

1. 無機氮向有機氮的轉化（氮的固定與同化）：
   • 氮固定（Nitrogen Fixation）：這是將大氣中的氮氣（$N_2$）轉化為生物可利用形式（主要是銨離子 $NH_4^+$）的過程，由固氮微生物（如根瘤菌、藍綠藻）完成。這是將最穩定的無機氮形式轉化為生物可利用形式的第一步。
   • 硝化作用（Nitrification）：在好氧條件下，土壤中的氨（$NH_3$/$NH_4^+$）會被硝化細菌氧化為亞硝酸鹽（$NO_2^-$），進一步被另一類硝化細菌氧化為硝酸鹽（$NO_3^-$）。硝酸鹽是許多植物吸收氮的主要形式。
   • 硝酸鹽和銨的同化（Nitrate and Ammonium Assimilation）：植物、真菌和微生物可以通過吸收土壤中的硝酸鹽或銨離子，並將其轉化為有機氮化合物的過程。
     • 硝酸鹽同化：硝酸鹽首先被硝酸鹽還原酶（nitrate reductase）還原為亞硝酸鹽，然後亞硝酸鹽被亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase）還原為銨離子。
     • 銨同化：銨離子是最終進入有機氮化合物的形態。在植物和微生物中，銨主要通過兩種途徑與有機物結合：
       • 谷氨酸脫氫酶途徑（Glutamate Dehydrogenase pathway）：在高濃度的銨存在下，α-酮戊二酸（α-ketoglutarate）與 $NH_4^+$ 在谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase）催化下直接生成谷氨酸（glutamate）。
       • 谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶途徑（GOGAT pathway）：在較低濃度的銨存在下，α-酮戊二酸與 $NH_4^+$ 結合生成谷氨酰胺（glutamine），然後通過谷氨酰胺：α-酮戊二酸胺基轉移酶（glutamine:α-ketoglutarate aminotransferase, GOGAT）將谷氨酰胺的胺基轉移給α-酮戊二酸，生成谷氨酸。

本題主要考察學生對證明 DNA 是遺傳物質的關鍵實驗的理解。

在 20 世紀中葉，科學家們進行了一系列經典實驗，逐步證明了 DNA 是承載遺傳信息的分子。其中最為關鍵的實驗有三個：

1. Griffith 的肺炎雙球菌轉化實驗（1928 年）：

   • 實驗設計：Frederick Griffith 使用兩種肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）：一種是光滑型（S 型），有莢膜，致病；另一種是粗糙型（R 型），無莢膜，無致病性。他進行了四組實驗：
     • 活 S 型細菌注射到小鼠 → 小鼠死亡。
     • 活 R 型細菌注射到小鼠 → 小鼠存活。
     • 加熱殺死的 S 型細菌注射到小鼠 → 小鼠存活。
     • 加熱殺死的 S 型細菌 + 活 R 型細菌注射到小鼠 → 小鼠死亡。
   • 發現：在最後一組實驗中，從死亡的小鼠體內分離出了活 S 型細菌。Griffith 認為，一定有某種「轉化因子」（transforming principle）從死亡的 S 型細菌轉移到了活的 R 型細菌中，使其轉變為 S 型。他推測這個因子是遺傳物質，但當時並未確定其化學本質。

2. Avery, MacLeod, and McCarty 實驗（1944 年）：

   • 實驗目的：進一步確定 Griffith 實驗中的「轉化因子」究竟是什麼。
   • 實驗設計：Oswald Avery 及其同事以 Griffith 的實驗為基礎，對來自加熱殺死的 S 型細菌的粗提物進行了化學分析和酶處理。他們系統地分離和純化了粗提物中的主要生物分子，包括蛋白質、RNA、DNA、脂質和多醣。然後，他們分別將這些純化的組分與活的 R 型細菌混合，並觀察是否發生轉化。
   • 關鍵發現：
     • 當加入純化的蛋白質、RNA、脂質或多醣時，R 型細菌沒有轉化為 S 型。
     • 當加入純化的 DNA 時，R 型細菌成功轉化為 S 型。
     • 更重要的是，他們使用特定的酶來處理 DNA：DNase（一種能降解 DNA 的酶）會阻止轉化發生，而 RNase（降解 RNA）和蛋白酶（降解蛋白質）則不會影響轉化。
   • 結論：Avery 等人強烈證明，DNA 是那個能夠將 R 型細菌轉化為 S 型的「轉化因子」，因此 DNA 才是遺傳物質。儘管他們的結論在當時仍有爭議，但這是首次有力地將遺傳性狀的傳遞與 DNA 本身聯繫起來。