108 年 國立臺灣海洋大學生命科學暨生物科技學系碩士班甲組《生物化學》

核心觀念

本題考查糖尿病患者的血糖變化，以及醣類的「還原糖」定義。

• 糖尿病患者因胰島素分泌不足或作用不良，葡萄糖無法有效進入細胞利用，導致血液中的葡萄糖濃度升高，即高血糖。
• 能夠將氧化劑還原的醣稱為還原糖（reducing sugar）。具有游離異頭碳，或能在溶液中開鏈形成醛基的醣，通常具有還原性。
• 葡萄糖在開鏈形式具有醛基，可將氧化劑還原，因此屬於還原糖。早期檢測尿糖或血糖時，常利用還原糖與氧化劑的反應進行檢測。

解題方法

先判斷糖尿病的生理變化：

$$\text{胰島素作用不足} \longrightarrow \text{細胞攝取葡萄糖減少} \longrightarrow \text{血液葡萄糖升高}$$

因此第一個空格應為 elevated glucose。

再判斷第二個空格。葡萄糖具有還原性，可使氧化劑被還原；因此檢測血液中的葡萄糖時，可從「還原糖」的性質切入。故第二個空格為 reducing sugars。

所以完整答案為：

Individuals with uncontrolled diabetes mellitus may have levels of blood elevated glucose, so they test their blood for reducing sugars.

選項分析

• (A) elevated; fructose; gluconic acid：錯誤。
  糖尿病確實會造成血糖升高，但主要升高的是葡萄糖，不是果糖。葡萄糖被氧化後可形成葡萄糖酸（gluconic acid），那是反應產物，不是糖尿病患者用來代表血糖異常的主要物質；此選項的填空內容也與題意不符。

核心觀念

本題考查醣類（carbohydrates）的基本化學特徵。醣類通常具有下列性質：

1. 分子含有多個羥基，能形成多重氫鍵。
2. 多數醣類含有一個以上的手性中心。
3. 單醣可藉由糖苷鍵形成寡醣與多醣。
4. 單醣可在線性結構與環狀結構之間互相轉換。

題幹問的是 all EXCEPT，意思是「下列皆為醣類特徵，何者除外？」因此必須逐一確認 A～D 是否都是正確的醣類特徵。

解題方法

判斷本題可依序檢查醣類的結構：

• 是否含有多個可形成氫鍵的官能基？
• 是否具有手性中心？
• 是否能透過糖苷鍵聚合？
• 是否能形成線性與環狀結構？

A～D 皆符合醣類的一般化學特性，因此沒有一個能被排除。選項 E「all are true」是總結性選項，表示 A～D 全部正確；在「EXCEPT」題型中，它即為應選答案。

選項分析

(A) the potential to form multiple hydrogen bonds

正確。

醣類通常含有多個羥基（$-OH$）。羥基中的氧原子具有孤電子對，可作為氫鍵受體；羥基上的氫則可作為氫鍵供體。因此，醣類分子彼此之間，以及醣類與水分子之間，都能形成多重氫鍵。

以葡萄糖為例，其含有多個羥基，這也是葡萄糖易溶於水的重要原因之一。

(B) the existence of one or more asymmetric centers

正確。

多數單醣含有一個以上的不對稱中心（asymmetric center，又稱手性中心）。例如，醛己糖的一般結構為：

$$\mathrm{CHO-(CHOH)_4-CH_2OH}$$

其中間的多個碳原子各自連接四種不同的基團，因此形成手性中心。

葡萄糖具有多個手性中心，能產生不同立體異構物，例如 D-glucose 與 L-glucose。雖然某些醣類可能沒有手性中心，但「one or more asymmetric centers」是醣類常見且重要的結構特徵，並非錯誤敘述。

這是一題關於蛋白聚醣 (Proteoglycans) 組成的題目。蛋白聚醣是細胞外基質中的重要組成部分，它們的結構和功能與細胞黏附、信號傳導以及組織結構有關。

蛋白聚醣的結構特點是，它們的核心是一個蛋白質分子，該蛋白質分子上共價連接著一條或多條長鏈的多醣分子，這些多醣分子稱為醣胺聚醣 (glycosaminoglycans, GAGs)。

我們來分析各個選項：
(A) proteases and monosaccharides.
蛋白酶 (proteases) 是分解蛋白質的酶，單醣 (monosaccharides) 是最小的碳水化合物單位。蛋白聚醣是由蛋白質和醣胺聚醣組成的，而不是由蛋白酶和單醣組成的。

(B) proteins and glycosaminoglycans.
蛋白質 (proteins) 是核心結構，醣胺聚醣 (glycosaminoglycans) 是連接在其上的長鏈多醣。這是蛋白聚醣的正確組成部分。

這是一道關於飲食與冠狀動脈心臟疾病 (coronary heart disease, CHD) 之間關係的題目。冠狀動脈心臟疾病通常與動脈粥狀硬化有關，而動脈粥狀硬化的形成與血液中膽固醇和脂質的代謝密切相關。

科學研究表明，飲食中的某些脂肪酸對心臟健康有顯著影響。

1. 飽和脂肪酸 (Saturated fatty acids)：攝入過多的飽和脂肪酸會導致血液中低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 水平升高，LDL-C 被認為是「壞膽固醇」，容易沉積在動脈壁上，形成斑塊，增加罹患 CHD 的風險。因此，為了降低 CHD 風險，應限制飽和脂肪酸的攝入。
2. 反式脂肪酸 (Trans-fatty acids)：反式脂肪酸對心臟健康的危害尤其嚴重。它們不僅會升高 LDL-C 水平，還會降低高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C) 水平（HDL-C 被認為是「好膽固醇」，有助於清除動脈壁上的膽固醇）。因此，反式脂肪酸被認為是比飽和脂肪酸更不利於心臟健康的脂肪。應盡量避免攝入。
3. 不飽和脂肪酸 (Unsaturated fatty acids)：單元不飽和脂肪酸 (monounsaturated fatty acids) 和多元不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids) 通常對心臟健康有益。它們有助於降低 LDL-C 水平，甚至可能提高 HDL-C 水平。

基於以上原則，一個旨在降低冠狀動脈心臟疾病風險的飲食應該：

• 低反式脂肪酸 (low in trans-fatty acids)：因為反式脂肪酸對心臟健康危害最大。

這是一道關於脂質儲存形式的題目。脂質是生物體內重要的能量儲存形式，其能量密度高於碳水化合物和蛋白質。

主要的儲存脂質形式是三酸甘油酯 (triacylglycerols)，也稱為三酸甘油酯 (triglycerides)。三酸甘油酯由一個甘油分子和三個脂肪酸分子酯化而成。它們在細胞質中以脂滴 (lipid droplets) 的形式被儲存。

儲存三酸甘油酯的主要細胞類型是脂肪細胞 (adipocytes)，也稱為脂肪組織細胞。脂肪細胞高度特化，用於儲存能量。此外，肝臟 (liver) 也是合成和儲存三酸甘油酯的重要器官，尤其是在能量過剩時，肝臟會將葡萄糖轉化為三酸甘油酯並儲存或分泌。

現在我們來分析各個選項：
(A) phospholipid; liver
磷脂 (phospholipid) 是細胞膜的主要成分，而不是主要的儲存形式。肝臟確實參與脂質代謝，但磷脂不是其主要的儲存形式。

(B) cholesterol; muscles
膽固醇 (cholesterol) 是細胞膜的組成部分，也是合成類固醇激素和膽汁酸的前體，但它不是主要的儲存形式。肌肉細胞主要儲存肝醣作為能量，而不是大量的膽固醇。

這是一道關於乳糜微粒 (Chylomicrons) 的題目。乳糜微粒是脂蛋白 (lipoprotein) 的一種，主要負責運輸從飲食中吸收的脂質。

乳糜微粒的形成與功能：

1. 形成地點：乳糜微粒主要在腸道上皮細胞 (intestinal epithelial cells) 中合成，然後分泌到淋巴系統，最後進入血液循環。
2. 運輸的脂質：它們主要運輸來自食物的甘油三酯 (dietary triacylglycerols) 和膽固醇。
3. 結構：乳糜微粒的中心是疏水性的甘油三酯和膽固醇酯。外層是親水的磷脂 (phospholipids)、游離膽固醇 (free cholesterol) 和載脂蛋白 (apolipoproteins)，其中載脂蛋白 ApoB-48 是乳糜微粒特有的標誌。
4. 功能：在血液循環中，乳糜微粒將甘油三酯運送到全身的組織（如肌肉和脂肪組織），供細胞利用或儲存。其餘的膽固醇則運送到肝臟。

現在我們來分析各個選項：
(A) are formed in adipose tissue.
脂肪組織 (adipose tissue) 是儲存脂質的場所，而不是形成乳糜微粒的地方。

這是一道關於酮體 (Ketone bodies) 合成地點的題目。酮體是脂肪酸在肝臟中分解產生的副產品，主要包括乙醯乙酸 (acetoacetate)、β-羥基丁酸 (β-hydroxybutyrate) 和丙酮 (acetone)。在飢餓、長時間運動或未控制的糖尿病等情況下，脂肪酸分解產生大量乙醯輔酶A (acetyl-CoA)，當這些乙醯輔酶A無法全部進入檸檬酸循環 (citric acid cycle) 時，就會被用於合成酮體。

酮體的合成是一個多步驟的過程，發生在肝臟的細胞質和粒線體之間。具體來說，酮體的合成主要發生在肝臟的粒線體 (mitochondria of liver) 中。

這是一道關於脂肪酸生物合成 (fatty acid biosynthesis) 的題目，詢問其中「承諾步驟」(committed step) 的催化酶。承諾步驟是指在一個代謝途徑中，一旦該步驟完成，就必然會繼續進行該途徑的後續反應，不可逆轉。

脂肪酸合成的主要途徑如下：

1. 乙醯輔酶A的轉運：乙醯輔酶A (acetyl-CoA) 是脂肪酸合成的起始原料，但它主要在粒線體中生成（來自丙酮酸脫氫酶複合物或脂肪酸氧化）。為了在細胞質中進行脂肪酸合成，乙醯輔酶A需要通過檸檬酸循環的介導轉運到細胞質（乙醯輔酶A + 草醯乙酸 → 檸檬酸 → 檸檬酸鹽進入細胞質 → 檸檬酸裂解為乙醯輔酶A + 草醯乙酸）。
2. 承諾步驟：乙醯輔酶A羧化為丙二醯輔酶A：這是脂肪酸合成途徑的關鍵起始和調節步驟。乙醯輔酶A (acetyl-CoA) 在細胞質中被乙醯輔酶A羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase, ACC) 催化，加入一個二氧化碳分子，形成丙二醯輔酶A (malonyl-CoA)。這個反應需要生物素 (biotin) 作為輔酶，並消耗 ATP。
   $\text{Acetyl-CoA} + \text{CO}_2 + \text{ATP} \xrightarrow{\text{Acetyl-CoA carboxylase}} \text{Malonyl-CoA} + \text{ADP} + P_i$
   丙二醯輔酶A是延長脂肪酸鏈的兩個碳單元的來源。

這是一道關於膽固醇生物合成 (cholesterol biosynthesis) 的題目，詢問其中「承諾步驟」(committed step) 的催化酶。膽固醇合成是一個複雜的多步驟過程，發生在細胞質和內質網中。

膽固醇合成途徑的關鍵步驟和調節點：

1. 乙醯輔酶A的形成：乙醯輔酶A是合成膽固醇的起始原料，主要來自糖酵解、脂肪酸氧化和胺基酸分解。
2. 合成 HMG-CoA：兩個乙醯輔酶A分子縮合形成乙醯乙醯輔酶A (acetoacetyl-CoA)。然後，另一個乙醯輔酶A分子與乙醯乙醯輔酶A反應，生成 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA, HMG-CoA)。這個步驟由 HMG-CoA 合酶 (HMG-CoA synthase) 催化。
3. 承諾步驟：HMG-CoA 還原為 mevalonate：這是膽固醇合成途徑的關鍵調節步驟，也是承諾步驟。HMG-CoA 還原酶 (HMG-CoA reductase) 催化 HMG-CoA 被 NADPH 還原，生成 mevalonate (mevalonic acid)。這個酶是膽固醇合成途徑中的限速酶，也是藥物（如他汀類藥物 statins）的主要作用靶點。

這是一道關於細胞膜運輸速率的題目。細胞膜上的物質運輸可以通過多種機制進行，其速率受到多種因素的影響。

我們來分析各個選項的運輸速率：
(A) Channel-mediated diffusion (通道介導的擴散)
通道蛋白 (channel proteins) 形成親水性通道，允許特定離子或小分子通過細胞膜。這種運輸通常是高度選擇性的，並且速率相對較快，因為它提供了一個直接的通道。離子通道的開放和關閉受到調控，但一旦開放，離子可以快速通過。

(B) Facilitated diffusion (促進性擴散)
促進性擴散依賴於載體蛋白 (carrier proteins) 或通道蛋白來幫助物質通過細胞膜。與單純的擴散相比，它能運輸較大的分子或離子。載體蛋白通過構象變化來運輸物質，而通道蛋白則提供一個通道。促進性擴散的速率取決於載體蛋白或通道蛋白的數量和周轉率。通常比簡單擴散快，但可能比離子通道慢。

(C) Active transport (主動運輸)
主動運輸需要消耗能量（通常是 ATP），以將物質逆濃度梯度運輸。這個過程依賴於特定的載體蛋白（泵）。雖然主動運輸可以將物質運輸到高濃度區域，但其速率通常受到載體蛋白數量的限制，並且需要 ATP 的供應，因此可能不是最快的運輸方式。

核心觀念

本題考查酵素抑制作用的分類與 Michaelis–Menten 動力學參數 $K_m$、$V_{\max}$ 的變化。

酵素反應基本式為：

$$E+S\rightleftharpoons ES\rightarrow E+P$$

其中：

• $K_m$：反映酵素對受質的表觀親和力，數值越小通常表示親和力越高。
• $V_{\max}$：酵素在受質濃度足夠高時的最大反應速率。

各類抑制作用的重點如下：

抑制類型	結合對象	$K_m$	$V_{\max}$
Competitive inhibition	游離酵素 $E$	增加	不變
Non-competitive inhibition	$E$ 與 $ES$ 均可	不變（純型）	降低
Un-competitive inhibition	僅 $ES$ 複合體	降低	降低
Allosteric inhibition	活性部位以外的調節部位	視機制而定	視機制而定
Transition state inhibitor	結構模擬受質的過渡態	不以典型動力學分類	強力抑制

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解題方法

本題採「關鍵敘述對應定義」的方法：

1. 看抑制劑能與哪一種酵素形式結合。
2. 判斷是否只結合 $E$、只結合 $ES$，或兩者皆可。
3. 觀察題幹是否描述活性部位以外的調節位置。
4. 若描述化合物模擬反應過渡態，判定為 transition state inhibitor。
5. 針對 $K_m$ 是否改變，使用酵素動力學公式判斷。

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各題配對與解析

（1）答案：$(b)$ Non-competitive inhibition

題幹指出抑制劑：

binds equally well to the enzyme whether or not it has already bound the substrate

意思是抑制劑無論酵素尚未結合受質，或已形成 $ES$ 複合體，都能以相同程度結合：

$$E+I\rightleftharpoons EI$$ $$ES+I\rightleftharpoons ESI$$

純型 non-competitive inhibition 的特徵為抑制劑對 $E$ 與 $ES$ 的親和力相同，因此不改變 $K_m$，但會降低有效酵素量，使 $V_{\max}$ 降低。

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（2）答案：$(c)$ Un-competitive inhibition

題幹指出抑制劑：

binds only to the complex formed between the enzyme and the substrate

酵素與受質先形成 $ES$ 複合體，抑制劑才可結合：

$$E+S\rightleftharpoons ES$$ $$ES+I\rightleftharpoons ESI$$

因此抑制劑只與 $ES$ 結合，屬於 un-competitive inhibition。

其動力學特徵為：

• $K_m$ 降低
• $V_{\max}$ 降低

原因是抑制劑將 $ES$ 固定成無法產生產物的 $ESI$，使反應最大速率下降；同時，受質形成 $ES$ 後反而有利於抑制劑結合，因此表觀 $K_m$ 下降。

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（3）答案：$(e)$ Transition state inhibitor

題幹指出：

Chemical compounds with a chemical structure that resembles the transition state of a substrate

transition state inhibitor 是結構類似受質在反應過程中「過渡態」的化合物。

酵素活性部位通常對過渡態具有特別高的穩定作用，因此過渡態類似物能牢固地結合酵素，抑制反應進行。

此類抑制劑的核心不是單純依照它結合 $E$ 或 $ES$ 來分類，而是依照其「模擬過渡態結構」的特徵命名。

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（4）答案：$(d)$ Allosteric inhibition

題幹指出：

binding an effector molecule at a site other than the enzyme's active site

抑制分子結合在活性部位以外的調節位置，稱為 allosteric site。

抑制劑結合後會改變酵素的構形，使活性部位對受質的結合能力或催化能力下降：

這題考的是 Frances H. Arnold 博士的「定向演化」(directed evolution) 研究中所使用的生化技術。定向演化是一種通過模擬自然選擇的過程，在實驗室中人為地創造和篩選具有特定功能的蛋白質的技術。其核心在於「隨機突變」和「定向篩選」。

根據題幹的描述，定向演化的過程包括：

1. 產生變異 (Generate Diversity)：通過隨機突變（random mutagenesis）來產生蛋白質基因庫，進而產生具有不同序列和功能的蛋白質變異體。
2. 篩選/選擇 (Screening/Selection)：對產生的大量蛋白質變異體進行篩選，找出具有期望改進功能（例如更高的催化活性、新的底物特異性、增強的穩定性等）的蛋白質。
3. 疊代 (Iteration)：將篩選出的優良蛋白質進行進一步的突變和篩選，不斷優化其功能。

基於這些核心步驟，我們可以推斷出阿諾德博士可能使用的生化技術：

1. 基因工程與分子生物學技術 (Genetic Engineering and Molecular Biology Techniques)：

   • 基因突變技術 (Mutagenesis Techniques)：這是產生蛋白質變異的基礎。常見的方法包括：
     • 隨機點突變 (Random Point Mutagenesis)：例如使用亞硝酸鈉 (sodium nitrite)、溴化亞嘧啶 (bromouracil) 等化學誘變劑，或利用 PCR 的高錯誤率進行隨機引物擴增 (error-prone PCR)。
     • DNA 斷裂與修補 (DNA Fragmentation and Ligation)：將基因打斷後，用隨機合成的片段進行拼接，或者在斷裂處引入隨機序列。
     • DNA 掃描 (DNA Shuffling / Gene Shuffling)：將具有相似序列的基因片段隨機重組，產生嵌合基因。
   • 基因克隆與表達 (Gene Cloning and Expression)：將突變後的基因插入到合適的表達載體中，然後轉化到宿主細胞（如細菌、酵母、哺乳動物細胞）中進行表達，產生大量的目標蛋白質。這涉及到質粒 (plasmid) 的構建、轉化 (transformation)、轉染 (transfection) 等技術。
   • 基因序列分析 (DNA Sequencing)：用於確認突變的類型和位置。

2. 高通量篩選技術 (High-Throughput Screening, HTS)：

   • 由於需要篩選大量的蛋白質變異體，因此需要高效、自動化的篩選方法。這可能包括：
     • 酶活性測定 (Enzyme Activity Assays)：設計能夠靈敏檢測酶催化活性的方法，例如通過檢測產物或底物的顏色變化、螢光信號、放射性標記等。

核心觀念

本題考查 DNA 兩股與 RNA 之間的互補、反向平行關係：

• sense mRNA：序列與其基因的 coding strand DNA 相同，只需將 RNA 中的 $U$ 換成 DNA 的 $T$。
• template strand DNA：作為轉錄模板，與 mRNA 互補且反向平行。
• antisense mRNA：與 sense mRNA 互補且反向平行，可藉由鹼基互補配對與細胞內 sense mRNA 雜交。

鹼基配對規則為：

$$A\leftrightarrow U,\qquad G\leftrightarrow C$$

DNA 中則為：

$$A\leftrightarrow T,\qquad G\leftrightarrow C$$

題目給定 sense mRNA：

$$5'-\mathrm{AUG\ CGC\ UCG\ CCA\ AUA\ GCG\ UGA\ CUG}-3'$$

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解題方法

（1）antisense mRNA 序列

先逐一寫出互補鹼基。若按照原 mRNA 的 $5'\to3'$ 方向標示，互補股為：

$$3'-\mathrm{UAC\ GCG\ AGC\ GGU\ UAU\ CGC\ ACU\ GAC}-5'$$

但 RNA 序列通常以 $5'\to3'$ 方向書寫，因此將其反向排列：

$$\boxed{5'-\mathrm{CAG\ UCA\ CGC\ UAU\ UGG\ CGA\ GCG\ CAU}-3'}$$

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（2）antisense mRNA 的 coding strand DNA 序列

coding strand DNA 與其所對應的 mRNA 序列相同，差別只在於：

$$\mathrm{RNA:\ U}\longrightarrow\mathrm{DNA:\ T}$$

因此，antisense mRNA：

$$5'-\mathrm{CAG\ UCA\ CGC\ UAU\ UGG\ CGA\ GCG\ CAU}-3'$$

所對應的 coding strand DNA 為：

這是一道關於遺傳密碼和蛋白質轉譯的題目，探討了 UGA 密碼在一般生物體和果蠅粒線體中的差異，並要求解釋其原因。

核心觀念：

1. 遺傳密碼 (Genetic Code)：DNA 和 RNA 中的核苷酸序列以三個核苷酸為一個密碼子 (codon)，決定了蛋白質中氨基酸的順序。
2. 密碼子表 (Codon Table)：標準的遺傳密碼表顯示了哪些密碼子對應哪些氨基酸，以及哪些是終止密碼子 (stop codons)。
3. 終止密碼子 (Stop Codons)：在標準遺傳密碼中，有三個密碼子被指定為終止信號，它們分別是 UAA, UAG, 和 UGA。當核糖體 (ribosome) 讀取到這些密碼子時，轉譯就會終止，蛋白質合成結束。
4. 蛋白質轉譯 (Protein Translation)：在核糖體上，mRNA 的密碼子被 tRNA 上的反密碼子 (anticodon) 識別，並將對應的氨基酸添加到生長中的多肽鏈上。
5. 粒線體遺傳密碼 (Mitochondrial Genetic Code)：粒線體在基因表達上與細胞核內的基因表達有所不同，它們擁有自己獨立的基因組，並且其遺傳密碼表與標準遺傳密碼表存在差異。

第一部分：解釋為何 UGA 為轉譯停止密碼

在標準遺傳密碼中，UGA 被指定為一個終止密碼子，原因如下：

• 演化上的選擇：在生命演化的過程中，這三個密碼子 (UAA, UAG, UGA) 被選擇出來作為終止信號，以確保蛋白質合成在正確的位置停止。這是為了避免產生過長或不正確的蛋白質。
• 缺乏對應的 tRNA：在細胞質中，沒有任何一個 tRNA 的反密碼子能夠與 UGA 密碼子進行有效的鹼基配對，從而攜帶一個氨基酸。
• 釋放因子 (Release Factors)：當核糖體遇到終止密碼子時，細胞質中的釋放因子 (release factors, 如 RF1, RF2, RF3) 會識別這些密碼子，並與核糖體結合。釋放因子促進水解反應，斷開多肽鏈與最後一個 tRNA 的連接，並使核糖體從 mRNA 上脫落，從而終止轉譯。

第二部分：解釋果蠅粒線體 mRNA 中 UGA 可轉譯出 tryptophan 的原因

果蠅 (Drosophila melanogaster) 的粒線體遺傳密碼表與標準遺傳密碼表不同。在果蠅的粒線體中：

• UGA 密碼子被重新分配：UGA 密碼子不再作為終止密碼子，而是被重新分配來編碼一個氨基酸。在果蠅粒線體中，UGA 被指定編碼 色胺酸 (Tryptophan, Trp)。

這是一個解釋名詞的題目，要求解釋五個生物化學和分子生物學領域的名詞及其用途。

1. CRISPR-Cas9 系統

• 名詞解釋：CRISPR-Cas9 是一種基因編輯技術，最初發現於細菌和古細菌的適應性免疫系統。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是細菌 DNA 中的重複序列，而 Cas9 是一種核酸酶 (nuclease)，能夠切割 DNA。CRISPR-Cas9 系統利用一個導向 RNA (guide RNA, gRNA)，該 RNA 包含一個識別目標 DNA 序列的區域，以及一個與 Cas9 酶結合的結構。Cas9 酶在 gRNA 的引導下，能夠精確地切割到目標 DNA 序列，從而實現基因的編輯。
• 用途：
  • 基因敲除 (Gene Knockout)：通過在目標基因位點切割 DNA，引起非同源末端連接 (NHEJ) 修復，產生插入或缺失突變，導致基因失活。
  • 基因插入/修飾 (Gene Insertion/Editing)：通過提供一個修復模板 DNA，在切割位點進行同源重組 (homologous recombination) 修復，從而精確地插入新的基因序列、修飾現有序列或糾正突變。
  • 基因調控 (Gene Regulation)：通過改造 Cas9 酶（使其失去切割活性，稱為 dCas9），並將其與轉錄激活或抑制模塊結合，可以實現對特定基因的表達調控（激活或沉默）。
  • 其他應用：如基因成像、表觀遺傳學研究等。

2. microRNA (miRNA)

• 名詞解釋：microRNA (miRNA) 是一類長度約為 21-23 個核苷酸的非編碼 RNA 分子。它們由細胞內的特定基因轉錄產生，經過進一步加工形成成熟的 miRNA。miRNA 通常與細胞內的靶標 mRNA 分子結合，通過鹼基配對來調控基因表達。
• 用途：
  • 基因表達調控 (Gene Expression Regulation)：miRNA 主要通過兩種方式調控基因表達：
    • mRNA 降解 (mRNA Degradation)：如果 miRNA 與靶標 mRNA 的結合是完美的或近乎完美的互補，則會導致靶標 mRNA 被核酸酶降解，從而降低蛋白質的合成。
    • 抑制轉譯 (Translational Repression)：如果 miRNA 與靶標 mRNA 的結合是不完美的互補（在動物細胞中較常見），則會阻止核糖體結合到 mRNA 上，或阻礙轉譯的起始，從而降低蛋白質的合成。
  • 調控多種生物學過程：miRNA 在細胞分化、增殖、凋亡、發育、免疫反應以及許多疾病（如癌症、心血管疾病）的發生發展中都起著重要作用。

3. degenerate primer (for PCR):請舉例

• 名詞解釋：在聚合酶鏈式反應 (PCR) 中，引物 (primer) 是短的、單鏈的 DNA 分子，它們與模板 DNA 結合，並作為 DNA 聚合酶合成新鏈的起始點。簡併引物 (degenerate primer) 是指一組引物，它們在序列上相似，但在某些位置上可以包含多種核苷酸（通常是 IUPAC 簡併核苷酸代碼表示），以識別一系列可能但序列不完全相同的模板 DNA 序列。簡併引物用於 PCR 擴增保守區域的基因，當目標基因的序列變異較大，或者在進行基因家族的 PCR 擴增時非常有用。
• 用途：
  • 擴增保守基因家族：例如，在擴增一個基因家族的成員時，雖然不同成員的序列略有差異，但某些區域可能高度保守。使用簡併引物可以同時擴增這些保守區域，從而檢測或克隆該基因家族的成員。
  • 從多種生物中擴增特定基因：當需要從多個不同物種中 PCR 擴增同一類型的基因時，如果其序列有變異，簡併引物可以覆蓋這些變異位點。
  • 已知序列但存在變異時：例如，在病毒或細菌的基因組研究中，可能已知某個基因的大致序列，但存在已知的變異位點。
• 舉例：
  假設我們想 PCR 擴增一個基因的某個保守區域，該區域的序列如下：
  模板 DNA 序列片段： ...-ATG-CGC-TCA-CCA-TAA-GCG-TGA-CUG-...
  我們知道，在第三個密碼子 (TCA) 的最後一個鹼基（C/A/G/T）和第四個密碼子 (CCA) 的最後一個鹼基（A/G）可能存在變異。
  那麼，對應的 DNA 引物序列，在變異位點可以使用簡併核苷酸代碼。
  例如，如果我們設計一個引物，其序列是：
  5'-ATG CGC TCA CCA TAA GCG TGA CTG-3'
  如果我們知道 TCA 的第三個鹼基可能是 C 或 A，CCA 的第三個鹼基可能是 A 或 G。
  那麼，簡併引物可以表示為：
  5'-ATG CGC TCA CCA TAA GCG TGA CTG-3'
  在這個例子中，我們並沒有使用簡併核苷酸代碼，而是直接列出了可能變異的鹼基。
  更標準的簡併引物表示法會使用 IUPAC 代碼。例如，如果一個位置可以是 A, T, G, C，則用 N 表示。如果可以是 A 或 G，則用 R 表示。
  假設我們想擴增的序列是：
  ...-ATG-CGC-TCA-CCA-TAA-GCG-TGA-CUG-...
  我們知道 TCA 的第三個鹼基變異，CCA 的第三個鹼基變異。
  那麼，引物可能是：
  5'-ATG CGC TCN CCN TAA GCG TGA CTG-3'
  其中 N 代表 A, T, G, C 中的任何一種。
  或者，如果 TCA 的第三個鹼基是 C 或 A (R)，CCA 的第三個鹼基是 A 或 G (R)。
  那麼引物可能是：
  5'-ATG CGC TCR CCT AA...-3' (這裡 TCR 代表 TCA 或 TCC，CCT 代表 CCA 或 CCT)
  或者更簡單的例子：
  已知某段 DNA 序列為 ...-ATG-CGC-TCA-CCA-...，但 TCA 的第三個鹼基可能是 C 或 A，CCA 的第三個鹼基是 A 或 G。
  那麼，我們可以設計一個簡併引物：
  5'-ATG CGC TCR CCT AA...-3'
  其中 R 代表 A 或 G。
  或者，如果 TCA 的第三個鹼基是 C 或 A，CCA 的第三個鹼基是 A 或 G。