108 年 國立臺灣海洋大學食品科學系碩士班生物科技組《微生物學》

本題主要在測試學生對微生物學中幾個重要名詞的理解與定義。

a. Commercial sterilization (商業滅菌)
商業滅菌是指一種熱處理過程，旨在殺死食品中可能引起腐敗或疾病的微生物，特別是產孢菌如 Clostridium botulinum 的孢子。其目標是確保食品在室溫下能長期保存，但並非要求殺滅所有微生物，而是達到商業上可接受的無菌狀態。此過程通常在罐頭食品的生產中應用，透過精確控制溫度和時間來達成，例如使用高壓滅菌釜。

b. Operon (操縱子)
操縱子是原核生物基因調控的基本單位，由一個或多個結構基因（coding genes）及其相鄰的調控序列（如啟動子 promoter、操縱序列 operator）所組成。這些基因共同被一個調控元件（如阻遏蛋白 repressor 或激活蛋白 activator）所控制，使得它們能夠協同表達。這種結構有助於細胞在特定環境下，有效率地合成功能相關的蛋白質。

c. Intron (內含子)
內含子是真核生物基因中，在轉錄後會被剪接（splicing）去除的非編碼序列。

本題考查影響消毒效果的關鍵因素。有效的消毒不僅取決於消毒劑的選擇，還受到環境及微生物本身多種條件的影響。

影響消毒效果的關鍵因素包括：

1. 消毒劑的性質與濃度 (Nature and concentration of the disinfectant)：

   • 種類：不同消毒劑對不同類型的微生物（細菌、病毒、真菌、孢子）有不同的殺滅效率。例如，醛類對孢子有效，而酒精對無包膜病毒效果較佳。
   • 濃度：通常消毒劑濃度越高，殺滅微生物的速度越快，效果越好。但過高濃度可能產生毒性或損壞物品。
   • 作用時間：消毒劑需要足夠的作用時間才能殺死微生物。時間不足，即使濃度足夠，效果也會打折扣。

2. 微生物的種類與狀態 (Type and state of the microorganism)：

   • 種類：對消毒劑的敏感度不同。例如，革蘭氏陽性菌通常比革蘭氏陰性菌敏感；病毒的敏感度取決於是否有包膜；真菌的孢子和細菌的內孢子對消毒劑的抵抗力最強。
   • 狀態：處於生長活躍期的微生物比處於休眠狀態（如孢子）的微生物更容易被殺滅。

本題考查細菌轉錄前基因表達調控的機制。細菌的基因表達調控主要發生在轉錄起始階段，以節省能量和資源，並快速響應環境變化。

細菌的轉錄前調控主要透過以下幾種機制實現：

1. 操縱子模型 (Operon Model)：
   • 這是最經典的調控模式，如乳糖操縱子 (lac operon) 和色胺酸操縱子 (trp operon)。
   • 一個操縱子包含一個或多個結構基因、一個啟動子 (promoter) 和一個操縱序列 (operator)。
   • 負調控 (Negative regulation)：由一個調控基因編碼的阻遏蛋白 (repressor) 結合到操縱序列上，阻止 RNA 聚合酶與啟動子結合，從而抑制轉錄。當誘餌分子 (inducer) 存在時，它會與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白從操縱序列上脫落，允許轉錄進行。
   • 正調控 (Positive regulation)：由激活蛋白 (activator) 結合到啟動子附近，增強 RNA 聚合酶與啟動子結合的能力，從而促進轉錄。例如，在大腸桿菌的 cAMP-CAP 系統中，cAMP 與 Catabolite Activator Protein (CAP) 結合後，CAP-cAMP 複合物結合到啟動子附近，激活乳糖操縱子的表達。

本題考查利用 DNA 探針進行菌落雜交 (colony hybridization) 以篩選特定基因的方法。這是一種常用的分子生物學技術，用於在大量重組 DNA 轉化子中，快速找出含有目標基因的菌落。

進行菌落雜交的步驟如下：

1. 製備菌落篩選膜 (Preparation of colony lift filter)：

   • 將含有重組 DNA 的細菌菌落，接種到含有適當培養基的平板上，待菌落生長至一定大小。
   • 將一張浸濕的無菌濾膜（如硝酸纖維素膜或尼龍膜）輕輕地覆蓋在平板表面，確保濾膜與所有菌落充分接觸，這樣菌落上的 DNA 會黏附到濾膜上。
   • 小心地將濾膜從平板上取下，此時濾膜上保留了菌落的空間排佈信息。

2. 裂解菌落並固定核酸 (Lysis of colonies and nucleic acid fixation)：

   • 將濾膜上的菌落進行處理，通常包括：
     • 裂解：用鹼性溶液（如 NaOH）處理，使細菌細胞裂解，釋放出細胞內的 DNA。
     • 中和：用酸性或緩衝液中和，恢復 DNA 的雙鏈結構。
     • 固定：將濾膜放在紫外線或加熱的環境中，使釋放出的 DNA 永久地固定（雜交）在濾膜上。

3. 預雜交 (Pre-hybridization)：

   • 為了防止 DNA 探針與濾膜上的非特異性位點結合，需要將濾膜浸泡在預雜交液中。
   • 預雜交液通常包含變性劑（如甲醯胺 formamide）、鹽類、去污劑（如 SDS）和載體蛋白（如鮭魚精子 DNA 或 BSA）。

本題考查噬菌體（Bacteriophage）生命週期的兩種主要模式：裂解週期 (lytic cycle) 和溶原週期 (lysogenic cycle) 的區別。這兩種週期描述了噬菌體感染宿主細胞後，如何複製和增殖。

兩者主要區別在於：

1. 整合與複製方式 (Integration and Replication)：

   • 裂解週期 (Lytic cycle)：噬菌體進入宿主細胞後，立即開始大量複製其基因組和合成噬菌體蛋白質。這些組件會組裝成新的噬菌體顆粒。最終，宿主細胞會被裂解 (lysis)，釋放出大量成熟的噬菌體，感染新的細胞。在此過程中，噬菌體基因組不整合到宿主染色體中。
   • 溶原週期 (Lysogenic cycle)：噬菌體進入宿主細胞後，其基因組會與宿主細胞的染色體（或質體）進行重組，整合到宿主基因組中，形成所謂的前噬菌體 (prophage)。此時，噬菌體基因組與宿主 DNA 一起複製，並隨宿主細胞分裂傳遞給子代細胞。在這種狀態下，噬菌體通常不表達引起細胞裂解的基因，宿主細胞存活且正常生長。

2. 宿主細胞的命運 (Fate of the host cell)：

   • 裂解週期：宿主細胞最終會被裂解、死亡。
   • 溶原週期：宿主細胞存活，並將前噬菌體遺傳給下一代。

3. 噬菌體基因表達 (Phage gene expression)：

   • 裂解週期：表達所有必需的噬菌體基因，包括裂解酶等。
   • 溶原週期：通常只表達極少數基因，特別是那些維持前噬菌體整合狀態和抑制裂解基因表達的基因。

4. 誘導 (Induction)：

   • 裂解週期：一旦感染，就直接進入裂解過程。

本題要求將一段英文翻譯成中文。翻譯的重點在於準確傳達原文的科學含義，並使用中文的學術語言習慣。

原文：
In addition to properties of the organism itself, the source and habitat of a bacterial isolate are
part of the identification processes. In clinical microbiology, a physician will swab a patient's
pus or tissue surface. The swab is inserted into a tube of transport media. Transport media are
usually not nutritive and are designed to prolong viability of fastidious pathogens.

翻譯：
除了生物體本身的特性外，一個細菌分離株的來源和棲息地也是鑑定過程的一部分。在臨床微生物學中，醫師會採集患者的膿液或組織表面拭子。拭子隨後被置入一支輸送培養基的試管中。輸送培養基通常不含營養，其設計目的是為了延長對營養要求嚴苛的病原菌的存活時間。

逐句解析：

• "In addition to properties of the organism itself, the source and habitat of a bacterial isolate are part of the identification processes."
  • "In addition to"：除了...之外
  • "properties of the organism itself"：生物體本身的特性
  • "source and habitat"：來源和棲息地
  • "bacterial isolate"：細菌分離株 (指從環境或病人身上分離出來的單一細菌種類)
  • "are part of the identification processes"：是鑑定過程的一部分

本題為綜合題，涵蓋了微生物學、生物化學、細胞生物學和生物技術等多個領域的重要概念，共包含七個小題。

1A. Lactic acid fermentation and alcohol fermentation (乳酸發酵與酒精發酵)

• 乳酸發酵 (Lactic acid fermentation)：

  • 這是一種無氧代謝過程，其中糖類（如葡萄糖）被分解成乳酸。
  • 在這個過程中，NAD+ 被 NADH 還原，然後 NADH 再將電子傳遞給丙酮酸（或其衍生物），從而再生 NAD+，使糖解作用 (glycolysis) 得以繼續進行。
  • 主要產物是乳酸。根據產物不同，又可分為：
    • 同型乳酸發酵 (Homofermentative lactic acid fermentation)：主要產生乳酸，如 Lactobacillus 屬的部分菌種。
    • 異型乳酸發酵 (Heterofermentative lactic acid fermentation)：除乳酸外，還產生乙醇、乙酸、CO2 等其他產物，如 Leuconostoc 屬。
  • 應用：酸奶、起司、泡菜等發酵食品的生產。

• 酒精發酵 (Alcohol fermentation)：

  • 這是一種無氧代謝過程，其中糖類（如葡萄糖）被分解成乙醇和二氧化碳。
  • 第一步是糖解作用產生丙酮酸。
  • 丙酮酸首先被脫羧產生乙醛，並釋放 CO2。
  • 乙醛隨後被 NADH 還原成乙醇，同時再生 NAD+，使糖解作用得以繼續。
  • 主要產物是乙醇和 CO2。
  • 應用：麵包製作（CO2 使麵團膨脹）、釀酒（乙醇）。常見於酵母菌。

1B. Apoenzyme and holoenzyme (載酶蛋白與全酶)

• 載酶蛋白 (Apoenzyme)：

  • 指蛋白質部分，是酶的活性中心。
  • 它本身沒有催化活性，需要與輔因子 (cofactor) 結合後才能發揮功能。
  • 輔因子可以是金屬離子 (metal ion) 或有機小分子（輔酶 coenzyme）。

• 全酶 (Holoenzyme)：

  • 指一個具有完全催化活性的酶分子。
  • 它由載酶蛋白 (apoenzyme) 和輔因子 (cofactor) 結合而成。
  • 輔因子可以是離子（如 Mg$^{2+}$、Zn$^{2+}$）或輔酶（如 NAD$^+$, FAD, 輔酶 A）。
  • 全酶的結構和輔因子的存在是酶發揮正常催化功能的關鍵。

1C. Compound light microscopy and electron microscopy (複式光學顯微鏡與電子顯微鏡)

• 複式光學顯微鏡 (Compound light microscopy)：

  • 使用可見光作為光源，透過一系列透鏡（物鏡和目鏡）來放大標本。
  • 解析度極限約為 0.2 微米（$\mu$m），可以觀察到細菌、酵母菌、細胞器等結構。
  • 標本可以是活的或固定的。
  • 優點是操作相對簡單、成本較低，且能觀察活體細胞的動態。

• 電子顯微鏡 (Electron microscopy)：

  • 使用電子束作為光源，通過電磁透鏡來聚焦和放大標本。
  • 解析度遠高於光學顯微鏡，可達原子尺度（約 0.1 奈米，nm），能觀察到病毒、細胞器的超微結構、蛋白質分子等。
  • 標本必須經過固定、脫水、包埋、超薄切片等處理，通常觀察的是固定、非活體標本。
  • 分為透射電子顯微鏡 (TEM) 和掃描電子顯微鏡 (SEM)。TEM 用於觀察細胞內部結構，SEM 用於觀察標本表面形態。
  • 缺點是設備昂貴、操作複雜、標本製備耗時。

1D. The functions of the lysosomes and chloroplasts (溶酶體與葉綠體的功能)

• 溶酶體 (Lysosomes)：

  • 是動物細胞內的一種膜結合細胞器，含有多種酸性水解酶（如蛋白酶、核酸酶、脂酶、糖苷酶等）。
  • 主要功能：
    • 細胞內消化：分解吞噬的細菌、病毒、細胞碎片、衰老的細胞器等外源性或內源性物質。
    • 自噬 (Autophagy)：分解細胞自身衰老或受損的組分。
    • 細胞凋亡 (Apoptosis)：在某些情況下，溶酶體釋放酶可能參與細胞程序性死亡。

• 葉綠體 (Chloroplasts)：

  • 是植物細胞和藻類細胞中進行光合作用的細胞器。
  • 主要功能：
    • 光合作用 (Photosynthesis)：利用光能將二氧化碳和水轉化為葡萄糖（能量儲存）和氧氣。這是植物和許多微生物獲取能量的主要方式。

本題考查根據溫度要求對微生物進行分類的方法。微生物對溫度的適應性是其生態學和生存策略的重要指標。

微生物根據其最適生長溫度 (optimum growth temperature) 可以被分為以下幾類：

1. 嗜冷菌 (Psychrophiles)：

   • 最適生長溫度：低於 $15^\circ$C，通常在 $0^\circ$C 到 $20^\circ$C 之間。
   • 最低生長溫度：可能低至 $0^\circ$C 甚至更低。
   • 最高生長溫度：通常低於 $20^\circ$C，很少超過 $30^\circ$C。
   • 分佈：常見於寒冷的環境，如極地、高山、深海、冰箱等。

2. 嗜溫菌 (Mesophiles)：

   • 最適生長溫度：介於 $20^\circ$C 到 $45^\circ$C 之間，大多數細菌屬於此類。
   • 最低生長溫度：約 $10^\circ$C - $20^\circ$C。
   • 最高生長溫度：約 $45^\circ$C - $50^\circ$C。
   • 分佈：廣泛存在於動植物體表、土壤、水中，以及人體內。大多數致病菌也屬於此類。

本題考查微生物生長曲線的各個生長階段及其與世代時間 (generation time) 的關係。

微生物在固體培養基或液體培養基中生長時，其種群數量隨時間的變化會呈現一個典型的生長曲線，通常分為四個階段：

1. 延滯期 (Lag Phase)：

   • 描述：當微生物接種到新的培養基時，細胞數量在短時間內幾乎不變。
   • 原因：細胞正在適應新環境，合成必要的酶和代謝物質，為生長做準備。細胞的體積可能增大，但分裂數目很少。
   • 與世代時間的關係：此階段的平均世代時間非常長（接近無限大），因為細胞分裂非常緩慢或不發生。

2. 對數生長期 (Logarithmic/Exponential Phase)：

   • 描述：細胞開始快速分裂，細胞數量呈指數級增長。
   • 特徵：細胞生理狀態最活躍，對營養物質的需求量最大，對不利因素（如抗生素）最敏感。
   • 與世代時間的關係：這是世代時間 (generation time, g) 最短、最穩定的時期。世代時間定義為細胞數量增加一倍所需的時間。在此階段，細胞數量 $N$ 與時間 $t$ 的關係為 $N = N_0 \times 2^{n}$，其中 $N_0$ 是初始細胞數，$n$ 是分裂次數。由於 $n = t/g$，所以 $N = N_0 \times 2^{t/g}$。

這題主要在比較兩種重要的能量代謝途徑：有氧呼吸 (aerobic respiration) 和 發酵 (fermentation)。考生需要從四個面向深入理解這兩種途徑的差異：生長條件、最終電子接受者、ATP 生成的磷酸化方式，以及每分子葡萄糖所能產生的 ATP 數量。

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詳解

本題要求比較有氧呼吸與發酵在四個方面的差異：生長條件、最終電子接受者、產生 ATP 的磷酸化方式，以及每分子葡萄糖產生的 ATP 數量。

(a) 生長條件 (Growth Conditions)

• 有氧呼吸 (Aerobic Respiration):

  • 氧氣需求: 需要氧氣作為最終電子接受者。因此，有氧呼吸主要發生在好氧菌 (aerobes) 或兼性厭氧菌 (facultative anaerobes) 在有氧環境下進行。
  • 環境: 通常在富含營養且有充足氧氣供應的環境中進行，例如有氧培養基。

• 發酵 (Fermentation):

  • 氧氣需求: 不需要氧氣。發酵是無氧代謝途徑，可以在無氧或缺氧的環境中進行。
  • 環境: 可以在無氧培養基或缺氧環境中進行。雖然不需要氧氣，但發酵菌種對營養物質的需求仍需滿足。

(b) 最終電子接受者 (Final Hydrogen (e-) Acceptor)

• 有氧呼吸 (Aerobic Respiration):

  • 最終電子接受者: 氧氣 (O₂)。在電子傳遞鏈的末端，電子和質子 (H⁺) 與氧氣結合，形成水 (H₂O)。
  • 化學反應式簡化表示：$O₂ + 4e⁻ + 4H⁺ \rightarrow 2H₂O$

• 發酵 (Fermentation):

  • 最終電子接受者: 有機分子 (organic molecule)。發酵過程中，電子最終會轉移到一個有機分子上，這個有機分子通常是代謝的中間產物或最終產物。常見的例子包括丙酮酸 (pyruvate) 或其衍生物。
  • 例如，在乳酸發酵中，丙酮酸接受電子被還原成乳酸。在酒精發酵中，丙酮酸先脫羧產生乙醛，乙醛再接受電子被還原成乙醇。

(c) ATP 生成的磷酸化方式 (Type of Phosphorylation Used to Generate ATP)

• 有氧呼吸 (Aerobic Respiration):

  • 主要磷酸化方式: 氧化磷酸化 (Oxidative Phosphorylation)。這是 ATP 生成的主要方式。電子從還原劑 (如 NADH 和 FADH₂) 經由電子傳遞鏈傳遞，釋放的能量被用來將質子 (H⁺) 泵入膜間隙，形成質子梯度。質子順著濃度梯度通過 ATP 合成酶 (ATP synthase) 流回基質，驅動 ADP 和無機磷酸 (Pi) 合成 ATP。
  • 次要磷酸化方式: 基質層級磷酸化 (Substrate-level Phosphorylation)。在糖解作用 (glycolysis) 和克氏循環 (Krebs cycle) 過程中，也會有少量的 ATP 通過基質層級磷酸化直接生成。

• 發酵 (Fermentation):

  • 主要磷酸化方式: 基質層級磷酸化 (Substrate-level Phosphorylation)。發酵過程主要依賴糖解作用來產生 ATP。在糖解作用中，葡萄糖被分解為丙酮酸，並在此過程中通過基質層級磷酸化產生少量 ATP。
  • 注意: 發酵不涉及電子傳遞鏈和氧化磷酸化。

(d) 每分子葡萄糖產生的 ATP 數量 (ATP Molecules Produced Per Glucose Molecule)