112 年 國立成功大學環境醫學研究所乙組《生物化學》

本題主要考查酵素活性調節的機制，特別是磷酸化作用。

酵素活性的調節是細胞維持正常生理功能的關鍵。磷酸化（phosphorylation）是一種常見且重要的後轉譯修飾（post-translational modification），透過將磷酸基團（phosphate group）共價連接到蛋白質上，來改變蛋白質的結構、功能、定位或與其他分子的交互作用。

(a) 哪些胺基酸可以被磷酸化？
蛋白質分子中，能夠被磷酸化（接受磷酸基團）的胺基酸主要是那些側鏈（side chain）含有羥基（hydroxyl group, -OH）的胺基酸。這三種胺基酸是：

1. 絲胺酸（Serine, Ser, S）：側鏈為 -CH₂-OH。
2. 蘇胺酸（Threonine, Thr, T）：側鏈為 -CH(OH)-CH₃。
3. 酪胺酸（Tyrosine, Tyr, Y）：側鏈為 -CH₂-C₆H₄-OH。
   在某些特殊情況下，組胺酸（Histidine, His, H）也可以被磷酸化，但這相對少見，且磷酸基團通常連接到咪唑環（imidazole ring）上的氮原子，而不是羥基。不過，在一般情況下，討論酵素磷酸化時，主要聚焦於絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸。

(b) 為何酵素分子經過磷酸化後活性會改變？
磷酸化會改變酵素活性的原因主要有以下幾點：

1. 結構改變：磷酸基團帶有負電荷（pKa 約為 2），它的加入會顯著改變蛋白質局部或整體的電荷分佈。這會影響蛋白質的摺疊（folding）和三級結構（tertiary structure），進而影響其活性位點（active site）的構象（conformation）。

本題主要考查胺基酸的分類及其生理意義。

胺基酸是構成蛋白質的基本單位，人體內約有 20 種常見的胺基酸。根據人體自身合成胺基酸的能力，可以將其分為三類：必須胺基酸、半必須胺基酸和非必須胺基酸。

(a) 必須胺基酸 (Essential Amino Acids, EAAs)
定義：人體無法自行合成，或合成量不足以滿足生理需求，必須從飲食中攝取的胺基酸。
重要性：這些胺基酸是蛋白質合成的關鍵原料，缺乏任何一種都可能導致蛋白質合成受阻，進而影響身體的生長、發育、組織修復以及許多代謝過程。
人體有九種必須胺基酸，通常縮寫為 PVT TIM HALL：

1. 苯丙胺酸 (Phenylalanine)
2. 纈胺酸 (Valine)
3. 蘇胺酸 (Threonine)
4. 色胺酸 (Tryptophan)
5. 異白胺酸 (Isoleucine)
6. 甲硫胺酸 (Methionine)
7. 組胺酸 (Histidine)
8. 白胺酸 (Leucine)
9. 離胺酸 (Lysine)
   （註：有些文獻會將組胺酸列為半必須胺基酸，特別是在嬰幼兒時期，但一般成人通常視為必須胺基酸。）

(b) 非必須胺基酸 (Non-essential Amino Acids, NEAAs)
定義：人體可以自行合成，不需要從飲食中額外攝取的胺基酸。
合成途徑：這些胺基酸的合成通常是透過其他代謝途徑（如糖解作用、檸檬酸循環、或由其他胺基酸轉化而來）的產物，經過一或多個酵素反應合成。
常見的非必須胺基酸包括：

1. 丙胺酸 (Alanine)

本題考查 DNA 損傷修補機制，重點在於辨識不同損傷類型對應的修補途徑。

DNA 在細胞分裂和複製過程中，或是受到環境因子（如紫外線、放射線、化學物質）的影響，容易產生各種損傷。細胞演化出多種 DNA 修補系統來維持基因組的完整性，避免突變累積。

(a) DNA 損傷修補的種類
DNA 修補系統主要可以分為幾大類，根據其識別損傷的方式、切除受損區域的機制以及修補的廣泛性來區分：

1. 直接修復 (Direct Reversal)：

   • 這是最直接的修補方式，酵素直接逆轉損傷過程，將 DNA 恢復到原始狀態，不涉及切除和重新合成。
   • 例子：光復癒合（photoreactivation），由光依賴性 DNA 聚合酶（photolyase）催化，直接切斷紫外線引起的嘧啶二聚體（如環丁烷嘧啶二聚體, CPDs）中的共價鍵。
   • 例子：烷基化修復，如 O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) 移除 O⁶ 位上的甲基。

2. 鹼基切除修復 (Base Excision Repair, BER)：

   • 主要修補由氧化、烷基化、脫氨基作用等引起的單鹼基損傷。
   • 步驟：
     • DNA 醣苷酶（DNA glycosylase）識別並切除受損鹼基，產生一個無鹼基的位點（AP site, apurinic/apyrimidinic site）。
     • AP 核酸內切酶（AP endonuclease）切斷磷酸二酯骨架。
     • DNA 聚合酶（DNA polymerase）填補缺口，加入正確的鹼基。
     • DNA ligados酶（DNA ligase）連接磷酸二酯骨架。

3. 核苷酸切除修復 (Nucleotide Excision Repair, NER)：

   • 主要修補體積較大、結構改變的損傷，如嘧啶二聚體、化學加合物、環丁烷嘧啶二聚體 (CPDs)、6-4 光產物等。
   • 步驟：
     • 識別損傷區域，形成一個局部解旋。
     • 核酸內切酶（endonuclease）在損傷的兩側切開 DNA 鏈，切除包含損傷在內的較長一段核苷酸（通常 12-30 個核苷酸）。
     • DNA 聚合酶填補缺口。
     • DNA ligados酶連接磷酸二酯骨架。
   • NER 又可細分為全局 NER (Global Genome NER, GG-NER) 和轉錄偶聯 NER (Transcription-Coupled NER, TC-NER)。

4. 錯配修復 (Mismatch Repair, MMR)：

   • 主要修補 DNA 複製過程中，DNA 聚合酶校對失敗所產生的鹼基錯配（mismatch）和插入/缺失（insertion/deletion）突變。
   • 步驟：
     • 識別錯配鹼基對。
     • 區分新舊鏈（通常通過 DNA 甲基化狀態，原核生物較明顯）。
     • 切除新鏈上錯誤的核苷酸及周圍區域。
     • DNA 聚合酶重新合成。
     • DNA ligados酶連接。

5. 雙鏈斷裂修復 (Double-Strand Break Repair, DSB Repair)：

   • 修補 DNA 骨架上發生的雙鏈斷裂，這是最嚴重的 DNA 損傷。
   • 主要有兩種途徑：
     • 非同源末端連接 (Non-Homologous End Joining, NHEJ)：直接將斷裂的兩端連接起來，不依賴模板，可能會有鹼基的插入或缺失，是哺乳動物中最主要的 DSB 修補途徑。

本題考查遺傳密碼的特性。

遺傳密碼是將 DNA 或 RNA 中的核苷酸序列（由 A, U/T, G, C 四種鹼基組成）轉譯為蛋白質中的胺基酸序列（由 20 種胺基酸組成）的規則。這種規則是三聯體（codon）的，即每三個核苷酸決定一個胺基酸。

(a) 退化性 (Degeneracy)
定義：指一種胺基酸可以由一個以上的密碼子（codon）所決定。
說明：20 種胺基酸，但有 64 種可能的密碼子（4³=64）。由於密碼子數量遠多於胺基酸數量，因此大多數胺基酸都對應多個密碼子。例如，白胺酸 (Leucine) 可以由 6 個不同的密碼子決定。只有甲硫胺酸 (Methionine, AUG) 和色胺酸 (Tryptophan, UGG) 各自只由一個密碼子決定。
這種退化性具有重要的生物學意義：

1. 減少突變的影響：當 DNA 發生點突變時，如果突變的鹼基是位於密碼子的第三個位置（最右邊的鹼基），而新的密碼子仍然決定相同的胺基酸，那麼這個突變就不會影響蛋白質的序列，這就是所謂的「同義突變」(synonymous mutation)。這提高了基因組的穩定性。
2. 提高翻譯效率：有多個密碼子可以決定同一種胺基酸，這可能與 tRNA 的豐度有關，使得細胞能夠更有效率地進行蛋白質合成。

(b) 搖擺性 (Wobble)
定義：指在 mRNA 與 tRNA 結合進行翻譯時，tRNA 反密碼子（anticodon）的第三個鹼基（最右邊的鹼基）與 mRNA 密碼子（codon）的第三個鹼基之間，可能存在不尋常的鹼基配對，允許非標準的配對發生。
說明：

• tRNA 的反密碼子是 5' → 3' 方向，而 mRNA 的密碼子是 5' → 3' 方向。
• 標準的鹼基配對是 A-U 和 G-C。
• 搖擺性主要發生在反密碼子的第一個鹼基（最左邊的鹼基）和密碼子的第三個鹼基（最右邊的鹼基）之間。
• 常見的搖擺配對規則（由 Francis Crick 提出）：
  • 如果反密碼子的第一個鹼基是 Inosine (I)，它可以與 U, C, A 配對。
  • 如果反密碼子的第一個鹼基是 U，它可以與 A 或 G 配對。
  • 如果反密碼子的第一個鹼基是 G，它可以與 U 或 C 配對。

本題考查蛋白質分離技術中的等焦電泳。

等焦電泳（Isoelectric Focusing, IEF）是一種基於蛋白質表面電荷差異來分離蛋白質的電泳技術。它是一種等電點電泳，利用蛋白質在不同 pH 值下的淨電荷差異進行分離。

(a) 原理 (Principle)

1. 蛋白質的淨電荷與 pH 的關係：

   • 蛋白質是由胺基酸組成的，胺基酸（除了脯胺酸和甘胺酸）都含有一個胺基（-NH₂）和一個羧基（-COOH），以及一個側鏈（R基）。
   • 在不同的 pH 環境下，蛋白質的胺基和羧基，以及某些胺基酸側鏈（如天門冬胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸、半胱胺酸、酪胺酸）的離子化狀態會發生變化，從而影響蛋白質的總淨電荷。
   • 當 pH < pI（等電點）時，溶液中的 H⁺ 濃度高，蛋白質的胺基和羧基（以及帶正電側鏈）會質子化，帶較多正電荷，淨電荷為正。
   • 當 pH > pI 時，溶液中的 H⁺ 濃度低，蛋白質的胺基和羧基（以及帶正電側鏈）會去質子化，帶較多負電荷，淨電荷為負。
   • 當 pH = pI 時，蛋白質的總正電荷和總負電荷相互抵消，蛋白質的淨電荷為零。此時蛋白質的溶解度最低，也最容易沉澱。

2. 等焦電泳的過程：

   • 在 IEF 中，會在電泳槽內建立一個穩定的 pH 梯度。這個 pH 梯度通常是通過使用一系列的兩性載體（ampholytes，是一些含有酸性和鹼性基團的低分子量化合物）在電場作用下形成的。
   • 將蛋白質樣品（通常溶解在低離子強度的緩衝液中）施加到 pH 梯度上。
   • 在外加電場的作用下，帶電的蛋白質會向著與其淨電荷相反的電極移動。
   • 當蛋白質移動到 pH 值等於其等電點（pI）的位置時，其淨電荷變為零，此時蛋白質不再受到電場力的作用，停止移動。
   • 由於不同的蛋白質具有不同的等電點（pI），它們會在 pH 梯度上的不同位置停止移動，從而實現分離。pI 值較低的蛋白質（酸性蛋白質）會移動到 pH 值較高的區域（負極附近），而 pI 值較高的蛋白質（鹼性蛋白質）會移動到 pH 值較低的區域（正極附近）。

本題為名詞解釋題，要求對五個重要的生物化學或分子生物學名詞進行簡要定義和說明。

(a) Reverse Transcriptase (反轉錄酶)

• 定義：一種特殊的 DNA 聚合酶，能夠以 RNA 為模板，合成互補的 DNA (cDNA) 鏈。
• 來源與功能：
  • 常見於反轉錄病毒（如 HIV）中，它是反轉錄病毒複製週期中的關鍵酵素，將病毒的 RNA 基因組轉錄成 DNA，然後整合到宿主細胞的基因組中。
  • 在真核生物中，也存在於某些轉位子（transposons）和端粒酶（telomerase）中，參與基因組的重組和染色體末端的維持。
  • 在分子生物學實驗中，反轉錄酶被廣泛用於合成 cDNA，這是基因克隆、基因表達分析（如 RT-PCR）等實驗的基礎。

(b) TATA box (TATA 盒)

• 定義：一種在真核生物基因的啟動子（promoter）區域，位於轉錄起始點上游約 25-35 個鹼基對處的 DNA 序列，通常具有保守的序列 TATA (或類似序列如 TATAAA)。
• 功能：
  • TATA 盒是許多基因（特別是那些由 RNA 聚合酶 II 轉錄的基因）的「核心啟動子」元件之一。
  • 它作為一個識別位點，能夠被轉錄因子（特別是 TATA 結合蛋白, TBP）識別並結合。
  • TBP 的結合是啟動子識別和 RNA 聚合酶 II 複合物組裝的關鍵步驟，有助於精確定位轉錄起始點，啟動基因的轉錄過程。
  • 並非所有基因都有 TATA 盒，有些基因的啟動子結構不同。

(c) Liposome (脂質體)

• 定義：由一個或多個脂質雙層（lipid bilayer）構成的球狀囊泡結構，其內部可以容納水溶液。
• 組成：主要由磷脂（phospholipids）組成，磷脂分子具有親水頭部和疏水尾部，在水溶液中會自發組裝成脂質雙層。
• 功能與應用：
  • 細胞膜模型：脂質體結構與細胞膜相似，常用於研究膜的性質和功能。
  • 藥物遞送載體：由於其能夠包裹水溶性或脂溶性物質，脂質體被廣泛用作藥物遞送系統。它可以將藥物封閉在囊泡內部，保護藥物免受降解，並將藥物靶向遞送到特定組織或細胞，提高藥效並降低副作用。例如，某些癌症化療藥物和疫苗（如 mRNA 疫苗）就使用了脂質體作為載體。
  • 基因遞送：也可用於將核酸（如 DNA、siRNA）遞送到細胞內。

(d) Angiogenesis (血管新生)

• 定義：指從現有的血管系統中，通過現有血管內皮細胞的增殖、遷移和重塑，形成新的血管的生理過程。
• 機制：
  • 通常由生長因子（如血管內皮生長因子, VEGF）觸發。
  • 現有血管的內皮細胞開始增殖，形成血管芽（vascular sprouts）。
  • 血管芽向前延伸，形成新的血管管道。
  • 新的血管會與現有的血管網絡連接，形成功能性的循環系統。
• 生理與病理意義：