111 年 國立成功大學藥理學研究所《生物化學》

本題主要考驗蛋白質結構與修飾的相關知識。題目提供一段蛋白質序列，並針對其中的胺基酸性質、蛋白質修飾以及偵測方法進行提問。

核心觀念：蛋白質的胺基酸組成、蛋白質的翻譯後修飾（磷酸化、醣基化）、蛋白質結構的穩定性、以及蛋白質的偵測技術。

解題步驟：

a. 磷酸化 (Phosphorylation)
磷酸化是蛋白質最常見的翻譯後修飾之一，主要發生在胺基酸側鏈上含有羥基 (-OH) 的胺基酸。在提供的胺基酸列表中，Serine (Ser, S) 和 Threonine (Thr, T) 含有羥基。Tyrosine (Tyr, Y) 也含有羥基，並且是另一種常見的磷酸化位點，尤其是在訊號傳遞中。題目要求「which amino acid could be phosphorylated」，因此 Serine, Threonine, 和 Tyrosine 都是可能的答案。

【答案】Serine (Ser), Threonine (Thr), Tyrosine (Tyr)

b. 醣基化 (Glycosylation)
醣基化是另一個重要的蛋白質修飾，通常發生在特定胺基酸殘基上。N-linked 醣基化最常見於天冬醯胺 (Asparagine, Asn, N) 殘基，通常在序列 N-X-S/T (其中 X 不是脯胺酸 Pro) 的基序中。O-linked 醣基化則通常發生在絲胺酸 (Serine, Ser, S) 或蘇胺酸 (Threonine, Thr, T) 的羥基上。題目沒有特別指明是 N-linked 或 O-linked，但 Asparagine 是 N-linked 醣基化的典型位點。

【答案】Asparagine (Asn)

c. 模擬活化或激酶-失活 (Kinase-dead) 蛋白質的模擬取代
為了模擬蛋白質被磷酸化（活化）或去磷酸化（失活）的狀態，可以引入能夠模擬磷酸基團帶負電且較大的性質的胺基酸，或者引入無法被磷酸化的胺基酸。

• 模擬磷酸化 (Activation Mimic): 帶負電且體積較大的胺基酸，例如麩胺酸 (Glutamic acid, Glu, E) 或天門冬胺酸 (Aspartic acid, Asp, D)，它們的側鏈帶負電，可以模擬磷酸基團。
• 模擬去磷酸化 (Kinase-dead Mimic): 引入無法被磷酸化的胺基酸。例如，如果蛋白質的活化狀態依賴於某個酪胺酸的磷酸化，那麼將該酪胺酸突變成苯丙胺酸 (Phenylalanine, Phe, F) 或其他無法磷酸化的胺基酸，可以模擬激酶失活的狀態。
  題目問的是「mimic the activation or kinase-dead protein」，這暗示了兩種情況的模擬。
  • 模擬活化 (Phospho-mimetic): 麩胺酸 (Glutamic acid) 或 天門冬胺酸 (Aspartic acid)。
  • 模擬失活 (Dephospho-mimetic 或 Kinase-dead): 引入無法磷酸化的胺基酸，如丙胺酸 (Alanine, Ala, A) 或 苯丙胺酸 (Phenylalanine, Phe, F)。
    更精確地說，模擬磷酸化的胺基酸需要帶負電且體積相似，常見的是 Glutamic acid 和 Aspartic acid。模擬去磷酸化則是指將可磷酸化的位點突變成不能磷酸化的胺基酸。

本題主要考驗基因調控、基因沉默機制、分子生物學實驗技術（載體選殖、基因篩選、DNA 分析）的知識。

核心觀念：基因沉默 (Gene Silencing) 的機制（如 RNA interference, DNA methylation）、基因篩選（抗生素抗性）、DNA 定向插入（限制酶切點）、DNA 分析（凝膠電泳、PCR）。

解題步驟：

a. 基因沉默機制與評估工具 (12%)

• 基因沉默的可能機制：
  如果 Y 基因在正常情況下是關閉的 (turned off)，可能的原因包括：

  1. 表觀遺傳學調控 (Epigenetic Regulation):
     • DNA 甲基化 (DNA Methylation): 啟動子區域的 CpG 島 (CpG islands) 發生過度甲基化，會抑制基因轉錄。
     • 組蛋白修飾 (Histone Modification): 例如組蛋白去乙醯化 (histone deacetylation) 和組蛋白甲基化 (histone methylation)，會導致染色質結構緊縮 (heterochromatin)，使轉錄因子難以接近 DNA，從而抑制轉錄。
  2. 轉錄因子抑制 (Transcriptional Repression): 存在抑制性的轉錄因子與基因的調控區域（如增強子或啟動子）結合，阻止 RNA 聚合酶結合或延伸。
  3. RNA 干擾 (RNA Interference, RNAi): 雖然 RNAi 通常用於誘導基因沉默，但在某些情況下，內源性的 microRNA (miRNA) 或 small interfering RNA (siRNA) 可能作用於 Y 基因的 mRNA，導致其降解或抑制轉譯。
  4. 染色質重塑 (Chromatin Remodeling): 染色質重塑複合體可以改變 DNA 與組蛋白的相互作用，使基因區域變得不活躍。

• 評估基因沉默百分比的工具 (Assays) 與原理：
  評估基因沉默的「百分比」或「效力」(potency) 通常是指在給定處理後，目標基因的表達量降低了多少。常用的方法包括：

  1. 定量聚合酶鏈式反應 (Quantitative PCR, qPCR) 或 即時定量 PCR (Real-time qPCR):
     • 原理： 測量目標基因 (Y gene) 的 mRNA 相對於一個內參基因 (housekeeping gene) 的相對含量。通過比較處理組（基因沉默）和對照組（未處理或假處理）的 mRNA 含量，可以計算沉默的百分比。
     • 評估方法： 比較處理組與對照組的 Ct 值（循環閾值），通常使用 $\Delta\Delta Ct$ 方法計算相對表達量。沉默百分比可計算為 $1 - (\text{Relative Expression}_{\text{treated}} / \text{Relative Expression}_{\text{control}}) \times 100\%$。
  2. 西方墨點法 (Western Blotting):
     • 原理： 偵測目標蛋白質的表達水平。如果基因沉默導致蛋白質產量下降，則可以通過測定處理組和對照組的蛋白質豐度來評估沉默效力。
     • 評估方法： 測定處理後蛋白質的條帶強度，並與內參蛋白（如 $\beta$-actin 或 GAPDH）的強度進行比較，計算相對蛋白質表達量。
  3. 螢光報告基因檢測 (Fluorescent Reporter Assay):
     • 原理： 如果 Y 基因的表達被一個報告基因（如 EGFP, Luciferase）取代或與之串聯，則通過測量報告基因的螢光或發光強度，可以間接評估 Y 基因的表達水平。
     • 評估方法： 比較處理組和對照組的螢光強度或發光值。

  最常用且直接評估基因表達沉默百分比的方法是 qPCR，因為它直接測量 mRNA 水平，反映了基因轉錄的抑制程度。

【答案】
基因沉默機制：DNA 甲基化、組蛋白修飾、RNA 干擾、轉錄因子抑制。
評估工具：定量 PCR (qPCR)。
原理：通過測量處理後目標基因 mRNA 的相對表達量，與對照組比較，計算基因表達降低的百分比。

b. 載體篩選抗生素 (2%)
pcDNA3.1 是一個常用的哺乳動物細胞表達載體。如圖所示，pcDNA3.1 載體通常帶有一個抗生素抗性基因，用於在細菌（如大腸桿菌 E. coli）或哺乳動物細胞中進行篩選。pcDNA3.1 載體通常帶有 氨苄青黴素 (Ampicillin, Amp) 抗性基因 (bla gene)，這使得攜帶該載體的大腸桿菌能在含有氨苄青黴素的培養基中生長。在哺乳動物細胞中，pcDNA3.1 載體通常還帶有 新黴素 (Neomycin) 抗性基因 (Neo gene)，這使得細胞在含有 G418 (一種新黴素類似物) 的培養基中能夠存活。題目問的是「what antibiotic could be used to select the clone?」，在構建重組質體時，通常是在細菌中進行質體擴增和篩選。

本題主要考驗學生對膜脂質（磷脂質）、膜流動性、膠束形成、脂肪酸結構、脂蛋白代謝與動脈粥狀硬化，以及細胞訊號傳導中受體功能的理解。

核心觀念：磷脂質結構與兩親性 (amphipathic) 特質、膜流動性影響因素、表面活性劑作用機制、脂肪酸結構差異、脂蛋白與心血管疾病、膜受體與核受體在訊號傳導中的作用。

解題步驟：

a. 磷脂質的疏水與親水部分 (3%)
圖示的磷脂質分子通常包含一個極性的「頭部」和兩個非極性的「尾部」。

• 頭部 (Head Group): 通常包含磷酸基團 (phosphate group) 和一個連接到磷酸基團的額外基團（如膽鹼 choline，在圖示 A 中）。磷酸基團帶負電，而額外基團（如膽鹼）也可能帶電或極性。這部分與水分子能形成氫鍵或離子鍵，因此是 親水性 (hydrophilic) 的。
• 尾部 (Tail Group): 通常是兩個脂肪酸鏈 (fatty acid chains)。脂肪酸鏈由長碳氫鏈組成，缺乏極性，因此是 疏水性 (hydrophobic) 的。
  在圖示 A 中，"A" 指的是磷酸基團及連接的極性頭部，因此是親水性。圖示 B 中的脂肪酸鏈是疏水性。

【答案】
A (頭部，包含磷酸基團和額外基團) 是親水性 (hydrophilic)。
B (尾部，脂肪酸鏈) 是疏水性 (hydrophobic)。

b. 決定膜流動性的物質 (除溫度外) (3%)
膜的流動性 (membrane fluidity) 是指膜的組成成分（主要是脂質和蛋白質）在膜平面上移動的能力。除了溫度之外，影響膜流動性的主要因素包括：

1. 脂肪酸鏈的飽和度 (Degree of Saturation of Fatty Acid Tails):
   • 不飽和脂肪酸 (Unsaturated fatty acids): 含有一個或多個雙鍵 (double bonds)，這些雙鍵會導致碳鏈彎曲 (kink)，使得脂質分子之間堆積得不那麼緊密，增加膜的流動性。
   • 飽和脂肪酸 (Saturated fatty acids): 碳鏈是直的，分子之間可以堆積得更緊密，降低膜的流動性。
2. 脂肪酸鏈的長度 (Length of Fatty Acid Tails):
   • 短鏈脂肪酸： 相互作用力較弱，膜流動性較高。
   • 長鏈脂肪酸： 范德華力 (van der Waals forces) 較強，分子之間堆積緊密，膜流動性較低。
3. 膽固醇 (Cholesterol):
   • 在動物細胞膜中，膽固醇是一種重要的調節劑。在較高溫度下，膽固醇會限制磷脂質的移動，降低膜的流動性。在較低溫度下，膽固醇可以插入磷脂質之間，阻止它們過於緊密地堆積，從而防止膜變得過於僵硬，維持一定的流動性。

【答案】脂肪酸鏈的飽和度 (或雙鍵的存在)、脂肪酸鏈的長度、膽固醇。

c. 膠束 (Micelle) 形成的原理 (3%)
膠束是由兩親性分子（如單層磷脂質或脂肪酸鹽）在水溶液中自發形成的聚集體。

• 原理： 兩親性分子具有親水性頭部和疏水性尾部。在水溶液中，疏水性尾部會盡量避免與水接觸，以降低系統的自由能。同時，親水性頭部會與水分子接觸。為了解決這個矛盾，分子會自發地組織起來，使得所有疏水性尾部朝內聚集，形成一個疏水的核心；而所有親水性頭部則朝外，與周圍的水接觸。這種球狀的聚集體就稱為膠束。
• 條件： 通常發生在單層磷脂質或脂肪酸鹽在水中，且濃度超過臨界膠束濃度 (Critical Micelle Concentration, CMC) 時。

【答案】兩親性分子（有親水頭部和疏水尾部）在水溶液中，為最小化疏水尾部與水的接觸面積，會自發聚集形成球狀結構，使所有疏水尾部朝內形成核心，親水頭部朝外與水接觸。

d. 棕櫚酸 (Palmitate) 與油酸 (Oleate) 的差異 (4%)
棕櫚酸 (Palmitate) 和油酸 (Oleate) 都是常見的 16 碳脂肪酸。它們的差異在於碳鏈的飽和度：

• 棕櫚酸 (Palmitate): 是一種 飽和脂肪酸 (saturated fatty acid)，化學式為 $C_{16}H_{32}O_2$。其 16 個碳原子之間都是單鍵連接。
• 油酸 (Oleate): 是一種 單不飽和脂肪酸 (monounsaturated fatty acid)，化學式為 $C_{18}H_{34}O_2$ (這裡題目可能指 $C_{16}$ 的 Palmitoleic acid 或 $C_{18}$ 的 Oleic acid。

本題主要考驗學生對細胞能量代謝（有氧呼吸、無氧呼吸）、氧化磷酸化、檸檬酸循環、乙醯輔酶 A 的來源，以及無氧代謝產物的理解。

核心觀念：ATP 主要生成場所（粒線體）、有氧與無氧呼吸 ATP 產量差異、氧化磷酸化機制、電子傳遞鏈、質子梯度、ATP 合成酶、乙醯輔酶 A 的來源、還原性合成的電子來源、檸檬酸循環的起始反應、無氧代謝產物（乳酸、乙醇）及其對 pH 的影響。

解題步驟：

a. 製造 ATP 的細胞器 (3%)
在真核細胞中，主要產生 ATP 的細胞器是 粒線體 (Mitochondrion)。雖然細胞質中的醣解作用 (glycolysis) 也能產生少量 ATP，但絕大部分的 ATP 是通過粒線體內的有氧呼吸（檸檬酸循環和氧化磷酸化）產生的。

【答案】粒線體 (Mitochondrion)

b. 有氧與無氧呼吸的 ATP 產量 (3%)

• 有氧呼吸 (Aerobic Respiration):
  通過完整的有氧呼吸過程（包括醣解、丙酮酸氧化、檸檬酸循環和氧化磷酸化），一個葡萄糖分子理論上可以產生約 30-32 個 ATP 分子。但實際產量會因細胞類型、質子洩漏等因素而略有差異。
• 無氧呼吸 (Anaerobic Respiration / Fermentation):
  無氧呼吸（或稱發酵）僅包括醣解作用，其淨產量為 2 個 ATP 分子（每分子葡萄糖）。

【答案】
有氧呼吸：約 30-32 個 ATP。
無氧呼吸：2 個 ATP。

c. 氧化磷酸化中的受質 A (3%)
圖示顯示了氧化磷酸化過程，包括電子傳遞鏈和 ATP 合成酶。圖中的 A 位於粒線體基質 (Matrix) 和粒線體內膜 (Inner mitochondrial membrane) 之間，並且是 ATP 合成酶作用的對象。氧化磷酸化過程的能量來源是電子從 NADH 和 FADH2 傳遞到電子傳遞鏈，質子 (H+) 被泵入粒線體膜間隙 (Intermembrane space)，形成質子梯度。ATP 合成酶利用這個質子梯度，讓質子順濃度梯度流回基質，驅動 ATP 的合成。
因此，A 代表的是 質子 (Proton, H+)。

【答案】質子 (Proton, H+)

d. 氧化磷酸化中 ROS 和 ATP 的產生過程 (6%)

• ATP 的產生過程：
  1. 電子傳遞 (Electron Transport): NADH 和 FADH2 將高能電子傳遞給電子傳遞鏈上的蛋白質複合物 (Complex I-IV)。電子在傳遞過程中逐漸釋放能量。
  2. 質子泵送 (Proton Pumping): 電子傳遞釋放的能量被用於將質子 (H+) 從粒線體基質泵送到膜間隙，造成膜間隙的質子濃度升高，形成電化學梯度（質子動力勢，proton motive force）。
  3. 質子流動與 ATP 合成 (Proton Flow and ATP Synthesis): 質子通過 ATP 合成酶 (ATP Synthase, Complex V) 的通道流回基質。質子流動的能量驅動 ATP 合成酶的旋轉，將 ADP 和無機磷酸 (Pi) 合成為 ATP。
• 活性氧物種 (Reactive Oxygen Species, ROS) 的產生過程：
  ROS 的產生是電子傳遞鏈的副產物。
  1. 電子洩漏 (Electron Leakage): 在電子傳遞鏈的某些複合物（特別是 Complex I 和 Complex III）處，部分電子可能會「洩漏」出來，直接與氧氣分子 ($O_2$) 反應，而不是按預期傳遞下去。
  2. 超氧化物陰離子形成 (Superoxide Anion Formation): 洩漏的電子與氧氣反應，生成超氧化物陰離子 ($O_2^-$)。

本題為名詞解釋題，要求對五個生物學術語進行定義和簡要說明。

核心觀念：細胞吞噬機制、基因編輯技術、細胞外囊泡、代謝物體學、鐵死亡。

解題步驟：

a. 內吞作用 (Endocytosis) (3%)

• 定義： 內吞作用是一種細胞通過細胞膜內陷，將細胞外物質（如大分子、顆粒、甚至其他細胞）包裹進細胞內的過程。
• 機制： 細胞膜向內凹陷，形成一個囊泡 (vesicle)，將細胞外的物質包裹在囊泡內，然後囊泡脫離細胞膜並進入細胞質。
• 類型： 主要包括吞噬作用 (phagocytosis，吞噬大顆粒物質或微生物)、胞飲作用 (pinocytosis，吞噬細胞外液體和小分子溶質)，以及受體介導的內吞作用 (receptor-mediated endocytosis，通過特異性受體結合細胞外配體，然後內吞)。
• 功能： 營養物質的攝取、病原體的清除、訊號傳導、細胞間的物質交換等。

【答案】內吞作用是細胞通過細胞膜內陷形成囊泡，將細胞外物質攝入細胞內的過程。

b. CRISPR-Cas9 (3%)

• 定義： CRISPR-Cas9 是一種強大的基因編輯技術，源自細菌的一種適應性免疫系統。它能夠精確地在基因組的特定位點切割 DNA。
• 組成： 主要由兩部分組成：
  1. Cas9 蛋白質： 一種核酸酶 (nuclease)，能夠切割雙鏈 DNA。
  2. 嚮導 RNA (guide RNA, gRNA)： 一個由實驗室設計的 RNA 分子，包含一個識別目標 DNA 序列的區域（約 20 個鹼基）和一個結合 Cas9 蛋白質的結構域。
• 機制： gRNA 引導 Cas9 蛋白質到基因組中與 gRNA 序列互補的目標 DNA 位點。Cas9 蛋白質在目標位點產生雙鏈斷裂 (double-strand break, DSB)。細胞會通過自身的 DNA 修復機制來修復這個斷裂，這個過程可以被誘導以引入基因插入、刪除或替換，從而實現基因的編輯。
• 應用： 廣泛應用於基因功能研究、疾病模型構建、基因治療等領域。

【答案】CRISPR-Cas9 是一種基因編輯技術，利用 Cas9 蛋白質和嚮導 RNA (gRNA) 精確切割 DNA，從而實現基因的修改。