108 年 國立成功大學生理學研究所《細胞及分子生物學》

本題主要考查細胞凋亡（Apoptosis）的兩大面向：形態學改變與訊號傳遞機制的定義。

**核心觀念：**細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，是維持組織穩態、清除受損或不必要細胞的重要生理過程。它涉及一系列特徵性的形態學改變和精密的分子訊號傳遞路徑。

詳解：

一、形態學改變 (Morphological Changes of Apoptosis)

細胞凋亡的過程會伴隨一系列可觀察到的形態學變化，這些變化是細胞啟動自我毀滅程序的標誌。主要包括：

1. 細胞收縮 (Cell Shrinkage): 早期細胞體積會縮小，細胞質變得更濃縮。
2. 染色質濃縮與核碎裂 (Chromatin Condensation and Nuclear Fragmentation): 細胞核內的染色質會發生緻密聚集，形成新月狀或塊狀，最終核膜破裂，將染色質分解成小塊（核碎裂）。
3. 形成凋亡小體 (Formation of Apoptotic Bodies): 細胞膜會向外形成突起，最終將細胞質和核碎裂物包裹起來，形成無膜的凋亡小體。這些小體會被吞噬細胞（如巨噬細胞）清除，避免引起發炎反應。
4. 細胞膜完整性維持 (Maintenance of Plasma Membrane Integrity): 在凋亡過程中，細胞膜在形成凋亡小體前通常保持完整，這與壞死（necrosis）細胞膜破裂導致內容物釋放不同。
5. 細胞骨架重組 (Cytoskeletal Rearrangement): 細胞骨架會發生重組，參與細胞收縮和形成凋亡小體。

二、凋亡的訊號傳遞機制 (Signal Transduction Mechanisms Leading to Apoptosis)

凋亡的啟動可以通過內源性（Intrinsic/Mitochondrial pathway）或外源性（Extrinsic/Death receptor pathway）兩種主要途徑。

1. 外源性途徑 (Extrinsic Pathway):
   • 啟動者： 由細胞外的死亡配體（如 Fas ligand, TNF-α）與細胞表面的死亡受體（如 Fas receptor, TNFR）結合引起。

本題主要考查細胞自噬作用（Autophagy）的結構性變化與分子機制。

**核心觀念：**自噬是細胞在營養缺乏或面臨壓力時，一種將細胞內受損的細胞器、蛋白質聚集體或外來入侵物等物質，通過雙層膜結構包裹，最終運送到溶酶體降解並回收利用的過程。

詳解：

一、結構性變化 (Structural Changes during Autophagy)

自噬過程涉及特定的膜結構形成與演變，主要分為以下幾個階段：

1. 吞噬體前體結構形成 (Phagophore Formation): 自噬作用的起始標誌是在細胞質中形成一個彎曲的、雙層膜的結構，稱為吞噬體前體 (phagophore) 或隔離膜 (isolation membrane)。這個結構的來源目前仍有爭議，可能來自內質網、高爾基體、細胞膜或線粒體。
2. 吞噬體形成 (Autophagosome Formation): 吞噬體前體會逐漸延伸和閉合，將目標物質（如受損細胞器、蛋白質聚集體）包裹起來，形成一個雙層膜的囊泡，稱為吞噬體 (autophagosome)。
3. 吞噬體與溶酶體融合 (Autophagosome-Lysosome Fusion): 吞噬體會移動並與溶酶體 (lysosome) 融合，形成吞噬溶酶體 (autolysosome)。
4. 內容物降解 (Degradation of Contents): 在吞噬溶酶體內，溶酶體釋放出的酸性水解酶（如蛋白酶、核酸酶、脂酶）會將吞噬體內的物質降解成單體（如胺基酸、核苷酸、脂肪酸），這些單體隨後會被轉運回細胞質中，供細胞重新利用。

二、分子機制 (Molecular Mechanisms Involved)

自噬的啟動和調控是一個複雜的過程，涉及多個蛋白質複合體的協同作用。其中，自噬相關基因 (Autophagy-related genes, Atg genes) 的產物扮演著關鍵角色。主要的分子機制包括：

1. mTORC1 的抑制： 當細胞處於營養充足狀態時，哺乳動物雷帕黴素靶蛋白複合體 1 (mTORC1) 活性高，它會抑制自噬的啟動。當營養缺乏時，mTORC1 的活性下降，解除對自噬的抑制。

本題主要考查內質網壓力 (ER stress) 的成因與後果。

**核心觀念：**內質網 (Endoplasmic Reticulum, ER) 是細胞內負責蛋白質摺疊、修飾、運輸和脂質合成的重要細胞器。當內質網的蛋白質處理能力不堪負荷時，就會產生內質網壓力，進而啟動細胞內的一系列反應。

詳解：

一、內質網壓力的成因 (Causes of ER Stress)

內質網壓力發生於內質網無法有效處理其內累積的異常蛋白質（未正確摺疊、聚集或未被及時降解）時。常見的成因包括：

1. 蛋白質合成或摺疊異常：
   • 基因突變： 導致合成的蛋白質本身結構異常，難以摺疊。
   • 營養缺乏： 如胺基酸供應不足，影響蛋白質合成。
   • 氧化還原失衡： 影響蛋白質二硫鍵的形成，這是許多蛋白質摺疊的關鍵步驟。
   • 糖基化異常： 影響蛋白質的正確摺疊和穩定性。
2. 內質網相關降解 (ER-Associated Degradation, ERAD) 系統失調：
   • ERAD 負責將內質網內錯誤摺疊的蛋白質通過內質網膜上的轉運蛋白轉運至細胞質，並由蛋白酶體 (proteasome) 降解。若 ERAD 系統功能受損，錯誤蛋白質會累積在內質網。
3. 鈣離子穩態失衡： 內質網是細胞內鈣離子的主要儲存庫。鈣離子濃度的異常會影響蛋白質的摺疊和酶的活性。
4. 內質網膜通透性改變： 影響鈣離子釋放或蛋白質的運輸。
5. 其他壓力因素：
   • 缺氧 (Hypoxia)
   • 高溫或低溫
   • 病毒感染
   • 藥物處理 (如某些抗癌藥物、化學物質)
   • 脂質代謝異常

二、內質網壓力的後果 (Outcomes of ER Stress)

當內質網壓力出現時，細胞會啟動一個稱為「未摺疊蛋白質反應」(Unfolded Protein Response, UPR) 的複雜信號傳導網絡，以應對這種壓力。UPR 的目標是恢復內質網的穩態，但如果壓力持續且過於嚴重，則可能導致細胞死亡。

本題考查細胞骨架 (cytoskeleton) 的基本組成及其與細胞剛性 (cell stiffness) 的關係。

**核心觀念：**細胞骨架是細胞質中由蛋白質纖維構成的動態網絡，它為細胞提供結構支撐、維持細胞形態、參與細胞運動、物質運輸以及細胞分裂等重要生理功能。細胞骨架的網絡結構和性質直接影響細胞的力學特性，包括其剛性。

詳解：

一、基本細胞骨架組成 (Basic Cytoskeleton)

細胞骨架主要由三種類型的蛋白質纖維構成，它們在細胞中的分佈、結構、動力學和功能上有所不同：

1. 微絲 (Microfilaments, Actin Filaments):

   • 組成： 主要由肌動蛋白 (actin) 單體聚合而成，形成雙螺旋結構。
   • 動力學： 具有高度動力學活性，可以快速聚合 (polymerization) 和解聚 (depolymerization)。
   • 結構： 通常位於細胞皮質層（細胞膜下方），形成緻密的網絡，或排列成長束、網狀結構。
   • 功能：
     • 維持細胞形態和提供機械強度（尤其是在細胞邊緣）。
     • 參與細胞運動（如細胞爬行、胞質流）。
     • 參與細胞分裂（形成收縮環）。
     • 肌肉收縮（與肌球蛋白協同作用）。
     • 細胞內物質運輸。

2. 中間絲 (Intermediate Filaments, IFs):

   • 組成： 由多種蛋白質構成，如角蛋白 (keratins)、波形蛋白 (vimentin)、神經絲蛋白 (neurofilaments)、層狀蛋白 (lamins) 等。這些蛋白質聚合形成堅韌、繩索狀的纖維結構。
   • 動力學： 相對穩定，動力學活性較低，不易快速聚合或解聚。
   • 結構： 分佈廣泛，貫穿細胞質，並附著於核膜和細胞膜。
   • 功能：
     • 提供細胞機械強度和韌性，抵抗拉伸應力。
     • 維持細胞和組織的結構完整性。
     • 細胞核的結構支持（核層蛋白）。

3. 微管 (Microtubules, MTs):

   • 組成： 由 α-和 β-微管蛋白 (tubulin) 異二聚體聚合而成，形成中空的管狀結構。

本題考查癌基因 (oncogenes) 和抑癌基因 (tumor suppressor genes) 的功能定義。

**核心觀念：**細胞的正常生長、增殖和死亡受到嚴格調控。癌基因和抑癌基因是兩類在細胞生長調控中扮演關鍵角色的基因，它們的異常活化或失活與癌症的發生密切相關。

詳解：

一、癌基因 (Oncogenes)

1. 定義： 癌基因是源自於正常基因（稱為原癌基因, proto-oncogenes）的突變形式。原癌基因在正常情況下參與細胞生長、分化和存活的調控，但一旦發生突變，其功能可能被異常增強或變得持續活化，從而促進細胞不受控制地增殖，成為癌基因。
2. 作用機制： 癌基因的獲得性功能（gain-of-function）突變，通常表現為：
   • 過度表達： 即使在正常信號不存在時，癌基因產物（通常是生長因子、受體、訊號傳導分子或轉錄因子）也能持續發出生長信號。
   • 活性增強： 癌基因產物的活性異常增強，導致下游生長訊號通路持續激活。
3. 功能： 癌基因的功能是促進細胞生長和存活。它們的異常活化會打破細胞週期的正常調控，導致細胞不受抑制地分裂，是癌症發生的驅動因素之一。
   • 例子：
     • Ras 基因：參與細胞生長和分化的訊號傳導通路，突變後持續激活下游通路。
     • Myc 基因：一種轉錄因子，調控細胞生長和分裂相關基因的表達，突變後過度表達。
     • Her2/neu (ErbB2) 基因：一種生長因子受體，突變後過度表達或活性增強，促進細胞增殖。

二、抑癌基因 (Tumor Suppressor Genes)

1. 定義： 抑癌基因是正常情況下起抑制細胞生長、促進細胞凋亡或修復 DNA 損傷作用的基因。它們的功能是防止細胞過度增殖和維持基因組穩定性。

本題考查化學致癌物暴露後，癌症發生存在長期延遲的分子與細胞機制。

**核心觀念：**癌症的發生是一個多步驟、多階段的複雜過程，而非單一事件。即使暴露於致癌物，引發基因突變，也需要經過漫長的時間，累積足夠的遺傳和表觀遺傳改變，並逃脫細胞的監控機制，才能發展成臨床可診斷的腫瘤。

詳解：

癌症發展的長期延遲（潛伏期）可以從以下幾個分子和細胞層面的機制來解釋：

1. 多步驟致癌模型 (Multi-step Carcinogenesis Model):

   • 起始 (Initiation): 致癌物（如化學致癌物）與 DNA 結合，引起基因突變（如點突變、插入、刪除）。這是一個相對快速的過程，但一次突變通常不足以引起癌症。
   • 促進 (Promotion): 突變細胞在某些促進劑（如慢性炎症、某些生長因子）的作用下，開始不受控制地增殖。此階段需要時間累積，並可能涉及表觀遺傳學改變。
   • 進展 (Progression): 隨著細胞不斷分裂，會累積更多的基因突變（包括癌基因的活化和抑癌基因的失活）。這些突變使得腫瘤細胞獲得更強的增殖能力、侵襲能力和轉移能力，最終形成惡性腫瘤。
   • 延遲解釋： 癌症的發生需要一系列關鍵基因（如癌基因、抑癌基因）的突變累積，這是一個概率事件，需要時間。

2. 基因組不穩定性與突變累積 (Genomic Instability and Mutation Accumulation):

   • DNA 修復機制： 細胞擁有複雜的 DNA 修復系統，可以在一定程度上修復致癌物引起的 DNA 損傷。然而，如果損傷過於廣泛或修復機制本身被破壞，突變就會累積。
   • 表觀遺傳學改變： 除了 DNA 序列改變，表觀遺傳學（如 DNA 甲基化、組蛋白修飾）的改變也會影響基因表達，並可能在癌症發展中起重要作用。這些改變也需要時間累積。
   • 延遲解釋： 突變的累積是一個漸進的過程，需要細胞不斷分裂和暴露於潛在的致癌環境，DNA 修復系統的效率也會隨時間和細胞狀態而變化。

3. 細胞凋亡與免疫監視 (Apoptosis and Immune Surveillance):

本題是關於免疫檢查點抑制劑 (Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs) 的應用，是 2018 年諾貝爾生理學或醫學獎的主題。題目分為三個小題，分別探討蛋白質功能研究、免疫療法設計及治療抗性。

**核心觀念：**免疫系統能夠識別並清除異常細胞（包括癌細胞），但癌細胞會利用「免疫檢查點」機制來逃避免疫系統的攻擊。抑制這些免疫檢查點可以重新激活免疫系統，使其有效攻擊癌細胞。

詳解：

(A) 研究新發現蛋白質功能的實驗設計 (12%)

**核心觀念：**研究蛋白質功能通常需要結合體外（in vitro）、細胞內（in cellulo）和體內（in vivo）的實驗方法，從結構、相互作用、表達、表型影響等多方面進行。Dr. Honjo 發現的蛋白質很可能是一個免疫檢查點分子。

實驗設計與關鍵性解釋：

1. 確定蛋白質在免疫細胞上的表達與定位：

   • 實驗： 使用免疫組織化學 (Immunohistochemistry, IHC) 或免疫螢光染色 (Immunofluorescence, IF) 技術，在各種免疫細胞（如 T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞）的切片或懸浮液上檢測該蛋白質的表達。同時，使用共聚焦顯微鏡觀察其在細胞內的定位（例如，細胞膜、細胞質、細胞核）。
   • 關鍵性： 確定該蛋白質在哪些免疫細胞類型中表達，以及其在細胞內的確切位置，是理解其潛在功能的基礎。例如，若表達在 T 細胞表面，則可能參與 T 細胞的活化或抑制。

2. 探究其與已知分子的相互作用：

   • 實驗：
     • 酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) 或體外 pull-down 實驗： 篩選與該蛋白質結合的其他蛋白質。
     • 免疫沉澱 (Co-immunoprecipitation, Co-IP) 實驗： 在細胞裂解液中，利用抗體沉澱該蛋白質，然後檢測與其一同被沉澱下來的其他蛋白質。
   • 關鍵性： 識別與該蛋白質相互作用的分子，可以揭示其所在的信號通路或複合體，進而推測其功能。例如，如果它與 T 細胞受體 (TCR) 或共刺激分子結合，則可能參與 T 細胞的活化。

3. 利用基因工程手段研究其功能（體內外）：

   • 基因敲除 (Gene Knockout) 或基因敲低 (Gene Knockdown) 實驗：
     • 在免疫細胞株中： 使用 CRISPR/Cas9 或 shRNA 技術，敲除或敲低該基因。觀察細胞的增殖、活化、分泌細胞因子等表型的改變。
     • 在小鼠模型中： 構建基因敲除小鼠，研究該蛋白質缺失對免疫系統發育、功能以及對腫瘤的抗性影響。
   • 過度表達 (Overexpression) 實驗： 將該基因導入到免疫細胞中，觀察其功能變化。
   • 關鍵性： 基因操作是確定基因功能的最直接方法。通過觀察基因缺失或過度表達後細胞行為的改變，可以直接推斷該蛋白質在免疫細胞中的作用。例如，若敲除後 T 細胞活化增強，則推測該蛋白質可能是一個抑制性分子（免疫檢查點）。

4. 功能性AddToCart實驗 (Functional Assays) 與藥物開發：

   • T 細胞活化實驗： 在已知的免疫檢查點阻斷抗體（如抗 PD-1、抗 CTLA-4）的基礎上，測試針對該新發現蛋白質的抗體是否能增強 T 細胞對抗原的反應。
   • 腫瘤模型實驗： 在腫瘤小鼠模型中，使用針對該蛋白質的抗體進行治療，觀察腫瘤生長抑制、腫瘤體積縮小以及動物存活率的改善。
   • 關鍵性： 這些實驗將蛋白質的功能與臨床應用（癌症治療）直接聯繫起來。如果針對該蛋白質的抗體能有效治療腫瘤，則證實了它是一個重要的免疫檢查點分子，並且具有作為治療靶點的潛力。

(B) 免疫治療實驗設計與原理 (12%)

**核心觀念：**免疫檢查點抑制劑（如抗 PD-1、抗 CTLA-4）通過阻斷癌細胞用來「關閉」 T 細胞的信號，從而重新激活 T 細胞，使其能夠攻擊癌細胞。

實驗設計與原理：

實驗設計：

1. 靶點選擇： 假設我們發現的蛋白質（暫稱其為 "ImmunoBlocker"）在腫瘤細胞表面的表達增加，並且與 T 細胞上的某個受體結合後，會抑制 T 細胞的活化。
2. 治療策略： 設計兩種主要的免疫治療策略：
   • 單一藥物治療： 開發針對 ImmunoBlocker 的單株抗體（如 anti-ImmunoBlocker antibody），該抗體能夠特異性地結合 ImmunoBlocker，阻止其與 T 細胞上的受體結合。
   • 聯合治療： 將 anti-ImmunoBlocker antibody 與現有的免疫檢查點抑制劑（如抗 PD-1 或抗 CTLA-4 抗體）聯合使用。
3. 實驗模型： 使用帶有腫瘤的動物模型（例如，免疫缺陷小鼠植入人類腫瘤細胞株，或基因工程小鼠模型）。
4. 實驗組別：
   • 對照組：生理鹽水注射。
   • 單藥組 1：抗 PD-1 抗體治療。
   • 單藥組 2：anti-ImmunoBlocker antibody 治療。
   • 聯合治療組：抗 PD-1 抗體 + anti-ImmunoBlocker antibody 聯合治療。
5. 評估指標：
   • 腫瘤生長抑制： 定期測量腫瘤體積。
   • 動物存活率： 記錄動物的死亡時間。
   • 免疫細胞分析： 在治療後，取脾臟、淋巴結或腫瘤組織，通過流式細胞術 (Flow cytometry) 分析 T 細胞（如 CD8+ T 細胞）的活化狀態（如 CD25, OX40, 4-1BB 表達）、增殖能力以及細胞因子（如 IFN-γ, TNF-α）的分泌水平。
   • 腫瘤微環境分析： 檢測腫瘤組織中免疫細胞的浸潤情況，以及腫瘤細胞表達的免疫檢查點分子。

原理說明：

• 抑制負向免疫調控： 免疫檢查點（如 PD-1/PD-L1, CTLA-4, 以及假定的 ImmunoBlocker）是免疫系統中的「剎車」。