112 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所乙組《微生物學》

本題主要考驗學生對 COVID-19 病毒診斷方法的理解，包含其原理、操作步驟以及臨床應用時機。

核心觀念：病毒診斷方法多樣，各有其原理、適用時機與優缺點。

詳解：

COVID-19 的診斷方法主要可分為以下幾種，各有其原理與應用目的：

(1) 核酸檢測 (Nucleic Acid Detection)

• 方法與原理：
  • 最常用的是 即時聚合酶鏈鎖反應 (Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)。
  • 原理： 此方法是基於偵測病毒特有的遺傳物質 (RNA)。首先，從檢體 (如鼻咽拭子) 中提取病毒的 RNA。接著，利用 反轉錄酶 (Reverse Transcriptase) 將 RNA 反轉錄為互補 DNA (complementary DNA, cDNA)。然後，以 PCR 技術對此 cDNA 進行指數級的放大。在 PCR 過程中，會加入螢光標記的探針，當目標 DNA 序列被複製時，螢光訊號會增強，透過即時監測螢光強度的變化，即可定性或定量地判斷病毒 RNA 的存在。
  • 特異性： RT-PCR 的特異性極高，因為它偵測的是病毒基因組中特定的核酸序列，能有效區分 SARS-CoV-2 與其他病毒。
  • 靈敏度： 靈敏度也很高，能偵測到極低量的病毒 RNA，因此適合在感染早期診斷。
• 適用時機與目的：
  • 早期診斷： 在感染初期，病毒在體內複製，核酸量較高時，RT-PCR 是最準確的診斷方法。
  • 確診依據： 是目前國際公認的黃金標準 (gold standard)，用於確診 COVID-19 感染。
  • 監測病毒量： 可用於監測病患體內的病毒載量變化，評估治療效果或判斷是否具有傳染性。
  • 流行病學調查： 用於追蹤病毒傳播鏈，監測病毒株的變異。

(2) 抗原檢測 (Antigen Detection)

• 方法與原理：
  • 通常是 免疫層析法 (Immuno-chromatographic assay)，類似於驗孕棒的原理。
  • 原理： 此方法是利用抗體與病毒表面的特定蛋白質抗原 (如棘蛋白 Spike protein, N蛋白 Nucleocapsid protein) 結合的原理。將檢體 (如鼻咽拭子) 塗抹在測試條上，若檢體中存在病毒抗原，則抗原會與測試條上的標記抗體結合，進而產生訊號 (通常是顏色變化)。
  • 特異性： 相較於核酸檢測，抗原檢測的特異性較低，可能會有偽陽性，但通常仍能區分出病毒。
  • 靈敏度： 靈敏度較 RT-PCR 低，需要較高濃度的病毒抗原才能偵測到。
• 適用時機與目的：
  • 快速篩檢： 檢測速度快 (約 15-30 分鐘)，適合用於大規模、快速的篩檢，如機場、車站、學校等場所。
  • 感染初期或高病毒量時期： 在感染初期或病毒量極高時 (如症狀出現前後)，抗原量足夠，檢測結果較可靠。
  • 輔助診斷： 可作為 RT-PCR 的輔助工具，或用於初步篩檢，陽性結果需進一步確認，陰性結果在症狀明顯時仍需警惕。
  • 居家快篩： 市面上常見的家用快篩試劑多為抗原檢測。

(3) 中和抗體效價分析 (Neutralizing Antibody Titer Analysis)

• 方法與原理：
  • 病毒中和試驗 (Virus Neutralization Assay, VNA) 是最常見的方法。
  • 原理： 此試驗是測量血液中是否存在能夠「中和」病毒感染細胞能力的抗體。將病患血清 (含有抗體) 與已知濃度的活病毒混合，然後將混合液接種到敏感的細胞株上。如果血清中含有足夠的中和抗體，這些抗體就能結合病毒，阻止病毒感染細胞，細胞就不會死亡或產生病毒。

本題旨在比較 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 這兩種冠狀病毒的病毒學特性，並探討其造成疫情規模差異的可能原因。

核心觀念：病毒的遺傳背景、複製特性、傳播模式及宿主反應等都會影響其流行規模。

詳解：

(1) SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 的病毒學特性比較 (5%)

相似性 (Similarities):

• 病毒類別： 兩者均屬於冠狀病毒科 (Coronaviridae)，β-冠狀病毒屬 (Betacoronavirus)。
• 基因組： 均為單股正鏈 RNA 病毒，基因組大小相似，約 30kb。
• 結構蛋白： 具有相似的結構蛋白，包括刺突蛋白 (Spike protein, S)、套膜蛋白 (Envelope protein, E)、膜蛋白 (Membrane protein, M) 和核殼體蛋白 (Nucleocapsid protein, N)。其中 S 蛋白是病毒入侵宿主細胞的關鍵，負責與宿主細胞受體結合。
• 宿主受體： 兩者均主要利用 血管張力素轉化酶 2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2, ACE2) 作為進入宿主細胞的主要受體。SARS-CoV 主要通過 ACE2 進入，而 SARS-CoV-2 則利用 ACE2 作為主要受體，但其 S 蛋白與 ACE2 的結合親和力可能更高。
• 傳播途徑： 主要通過飛沫和接觸傳播，也可通過氣溶膠傳播。
• 臨床表現： 早期症狀相似，如發燒、咳嗽、呼吸困難，均可引起嚴重肺炎。

差異性 (Differences):

特性	SARS-CoV (引起 SARS)	SARS-CoV-2 (引起 COVID-19)
S 蛋白與 ACE2 結合親和力	相對較低	相對較高 (約 10-20 倍)
複製能力	在人類呼吸道上皮細胞中複製能力相對較弱	在人類呼吸道上皮細胞中複製能力強，尤其是在下呼吸道。
潛伏期	約 2-10 天，平均 5 天	約 1-14 天，平均 5-6 天，但有更長的潛伏期案例
傳播能力 (R0)	平均約 2-3	平均約 2-3，但變異株可能更高

本題考查學生對流感病毒遺傳變異機制，特別是病毒重配 (reassortment) 的理解，以及這種機制如何產生具有人類感染性的新型流感病毒。

核心觀念：流感病毒基因組為分葉狀 (segmented)，這使得病毒重配成為其重要的遺傳變異方式，進而可能產生能感染人類的新型病毒株。

詳解：

(1) 流感病毒重配 (Influenza Virus Reassortment) 的機制 (5%)

流感病毒是 RNA 病毒，其基因組由 8 個單獨的 RNA 片段組成。這些 RNA 片段分別編碼病毒的不同蛋白質。流感病毒重配，也稱為基因重配 (genetic reassortment) 或抗原轉移 (antigenic shift)，是指當兩種不同的流感病毒同時感染同一個宿主細胞時，它們各自的 RNA 片段在宿主細胞的核內進行重新組合，產生具有來自親代病毒不同 RNA 片段的新型病毒。

機制步驟：

1. 病毒感染： 兩種不同的流感病毒 (例如，一種禽流感病毒和一種人類流感病毒，或兩種不同的人類流感病毒) 同時感染同一個哺乳動物細胞 (如豬的細胞，豬被認為是重要的「混合」宿主)。
2. RNA 複製與包裝： 在宿主細胞核內，每種親代病毒的 8 個 RNA 片段會進行複製。
3. 片段交換： 當新的病毒顆粒組裝時，來自兩種親代病毒的 RNA 片段會隨機地被包裝到新的病毒顆粒中。
4. 產生重配子代： 新產生的子代病毒顆粒可能攜帶來自不同親代病毒的 RNA 片段。例如，一種新型病毒可能擁有 7 個來自親代 A 的 RNA 片段，以及 1 個來自親代 B 的 RNA 片段。

這個過程之所以特別容易發生在流感病毒身上，是因為：

• 分葉狀基因組： 8 個獨立的 RNA 片段，為片段交換提供了機會。
• 在宿主細胞核內複製： 與大多數 RNA 病毒在細胞質中複製不同，流感病毒的 RNA 複製和基因組組裝發生在宿主細胞核內，這使得不同病毒基因組片段的混合和重新分配更加容易。

(2) 重配如何產生具有人類感染性的新型病毒株 (5%)

當流感病毒發生重配時，可能會產生具有嶄新遺傳組合的新型病毒株。其中，一種重要情況是，當一種原本只能感染禽類或豬類的流感病毒，透過重配獲得了能夠有效感染人類細胞並在人類之間傳播的特性時，就會產生具有人類感染性的新型病毒株

本題考查學生設計實驗的能力，以驗證一個假說：猴痘病毒 (MPV) 的 D8L 蛋白與人類細胞中的某種 A 蛋白之間增強的交互作用，可能導致病毒對人類的感染性增加。

核心觀念：病毒感染性與病毒蛋白與宿主細胞蛋白的交互作用密切相關，可透過體外和體內實驗來驗證。

詳解：

假說： 猴痘病毒 D8L 蛋白與人類細胞中的 A 蛋白之間增強的交互作用，導致 MPV 對人類的感染性增加。

為了驗證此假說，我們需要設計實驗來證明：

1. D8L 蛋白確實能與 A 蛋白發生交互作用。
2. 這種交互作用的增強確實存在。
3. 這種交互作用的增強與病毒感染性的增加相關。

以下設計兩個實驗，一個偏向體外 (in vitro)，一個偏向體內 (in vivo) 或細胞水平的綜合驗證。

實驗一：體外生物化學與細胞學驗證 D8L-A 蛋白交互作用及其增強 (In vitro Biochemical and Cell-based Interaction Assay)

目標：

• 證明 MPV D8L 蛋白與人類 A 蛋白之間存在物理性的結合。
• 比較野生型 D8L 蛋白與「變異型」D8L 蛋白 (假定變異導致與 A 蛋白交互作用增強) 的結合能力差異。
• 透過基因操作，模擬這種增強的交互作用，並觀察其對病毒感染的影響。

實驗設計：

(a) 檢測 D8L 與 A 蛋白的結合 (Co-immunoprecipitation, Co-IP)

1. 材料：
   • 表達野生型 D8L 蛋白的 MPV 病毒株 (或重組表達 D8L 的細胞)。
   • 表達變異型 D8L 蛋白 (假定變異使其與 A 蛋白結合更強) 的 MPV 病毒株 (或重組表達變異型 D8L 的細胞)。
   • 表達人類 A 蛋白的細胞系 (例如， HEK293T 細胞)。
   • 針對 D8L 蛋白和 A 蛋白的特異性抗體。
   • 免疫沉澱 (immunoprecipitation) 相關試劑 (如 Protein A/G beads)。
   • Western blot 檢測相關試劑。
2. 步驟：
   • 細胞培養與感染： 將表達人類 A 蛋白的細胞系分別用野生型 MPV 感染，或用表達野生型 D8L 的重組細胞系共培養，或用表達變異型 D8L 的重組細胞系共培養。
   • 細胞裂解： 在感染或共培養一段時間後，收集細胞，並用溫和的裂解緩衝液裂解細胞，以保留蛋白質複合物。
   • 免疫沉澱 (IP)：
     • 取裂解液，分別用抗 D8L 蛋白的抗體進行免疫沉澱。
     • 或者，取裂解液，分別用抗 A 蛋白的抗體進行免疫沉澱。
   • Western Blot (WB)：
     • 將免疫沉澱後的沉澱物進行 SDS-PAGE 和 Western blot。
     • 用抗 A 蛋白的抗體檢測沉澱物中是否存在 A 蛋白 (如果用抗 D8L 抗體 IP)。
     • 用抗 D8L 蛋白的抗體檢測沉澱物中是否存在 D8L 蛋白 (如果用抗 A 蛋白抗體 IP)。
3. 預期結果：
   • 如果 D8L 和 A 蛋白確實存在交互作用，那麼使用抗 D8L 抗體進行 IP 時，應能在 Western blot 中檢測到 A 蛋白；反之亦然。
   • 如果變異型 D8L 與 A 蛋白的交互作用增強，那麼使用抗 D8L 抗體 IP 時，應能檢測到比野生型 D8L 更多的 A 蛋白，或者使用抗 A 蛋白抗體 IP 時，應能檢測到比野生型 A 蛋白更多的 D8L 蛋白。

(b) 體外結合分析 (如 Surface Plasmon Resonance, SPR)

• 目標： 定量測量野生型 D8L 與 A 蛋白、變異型 D8L 與 A 蛋白之間的結合親和力 (Kd 值)。
• 步驟： 將 A 蛋白固定在 SPR 晶片上，然後流過不同濃度的 D8L 蛋白 (野生型和變異型)，測量結合反應的動力學參數。
• 預期結果： 變異型 D8L 與 A 蛋白的結合親和力 (Kd 值) 應顯著低於野生型 D8L 與 A 蛋白的結合親和力，表明結合更強。

(c) 螢光共振能量轉移 (FRET) 或酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H)

• 目標： 在細胞內直接觀察 D8L 和 A 蛋白的交互作用。
• 步驟：
  • FRET： 將 D8L 蛋白標記為供體螢光分子，A 蛋白標記為受體螢光分子。在細胞內，如果兩者靠近，就會發生能量轉移，產生 FRET 信號。
  • Y2H： 將 D8L 蛋白構建為 DNA 結合域 (BD) 的融合蛋白，將 A 蛋白構建為激活域 (AD) 的融合蛋白。如果兩者交互作用，就會將 BD 和 AD 招募到啟動子區域，激活報告基因的表達。
• 預期結果： 觀察到更強的 FRET 信號或更強的報告基因表達，表明交互作用增強。

本題考查學生對人體正常菌群 (microbiota) 的認識，以及它們對人體健康的益處。

核心觀念：人體內共生的微生物群落 (microbiota) 不僅無害，還對宿主有多方面的益處。

詳解：

人體內存在著數量龐大且種類繁多的微生物群落，主要存在於皮膚、口腔、腸道、呼吸道、泌尿生殖道等部位，這些被稱為「正常菌群」或「微生物群落」(microbiota)。它們與人體形成複雜的共生關係，其中許多微生物對人體健康具有重要的益處。以下舉例說明：

1. 腸道菌群 (Gut Microbiota) 的益處：

腸道，尤其是結腸，是人體內微生物最密集、種類最繁多的地方。腸道菌群對人體健康扮演著至關重要的角色。

• 益處一：幫助消化與營養吸收

  • 分解膳食纖維： 人類自身的消化酶無法完全分解某些膳食纖維。腸道中的細菌 (如 Bacteroides, Prevotella 等) 可以通過發酵作用將這些複雜的碳水化合物分解成短鏈脂肪酸 (Short-Chain Fatty Acids, SCFAs)，如乙酸 (acetate)、丙酸 (propionate) 和丁酸 (butyrate)。
  • SCFA 的作用：
    • 能量來源： 丁酸是結腸上皮細胞的主要能量來源，有助於維持腸道屏障的完整性。
    • 調節免疫： SCFAs 可以調節腸道免疫系統，有助於維持免疫平衡，預防過度發炎。
    • 促進營養吸收： 腸道菌群還能合成一些維生素，如維生素 K (Vitamin K) 和某些 B 群維生素 (如生物素 biotin, 葉酸 folic acid)，這些維生素是人體必需的，可以被人體吸收利用。
  • 例子： 某些益生菌，如嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus) 和雙歧桿菌 (Bifidobacterium spp.)，被認為可以幫助消化乳糖，減輕乳糖不耐受症狀。

• 益處二：保護宿主免受病原體侵害 (定植抗性, Colonization Resistance)

  • 競爭： 正常菌群佔據了腸道內的生態位，與潛在的病原體競爭營養物質和附著位點，從而阻止病原體的定植和過度生長。
  • 產生抗菌物質： 許多正常菌群能夠產生 bacteriocins 等抗菌肽或有機酸，直接抑制或殺死入侵的病原體。

本題考查學生對細菌致病機制中「毒素產生」的理解，要求舉例說明細菌毒素的致病途徑。

核心觀念：細菌產生的毒素是引起疾病的重要因素，毒素可分為外毒素和內毒素，作用機制多樣。

詳解：

細菌引起疾病的機制主要有兩種：直接侵襲宿主組織，以及產生毒素。毒素是細菌分泌或釋放的物質，能夠對宿主細胞或組織造成損傷，或干擾其正常生理功能，從而導致疾病。細菌毒素主要分為外毒素 (exotoxins) 和內毒素 (endotoxins)。

外毒素 (Exotoxins)：
通常由革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌分泌到細胞外，分子量較大，通常是蛋白質，具有高度特異性。外毒素可分為三種類型：細胞毒素 (cytotoxins)、神經毒素 (neurotoxins) 和腸毒素 (enterotoxins)。

內毒素 (Endotoxins)：
主要存在於革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS) 結構中。當細菌死亡、細胞壁破裂時釋放出來。內毒素的毒性不如外毒素特異，但其引發的全身性炎症反應 (如發燒、休克) 也是非常嚴重的。

以下舉例說明兩種細菌毒素的致病途徑：

1. 破傷風梭菌 (Clostridium tetani) 的破傷風毒素 (Tetanospasmin)

• 類型： 外毒素 (神經毒素)。
• 致病機制：
  • 產生與釋放： 破傷風梭菌是一種厭氧菌，通常通過傷口進入人體，在缺氧的環境中生長繁殖並釋放破傷風毒素。
  • 作用靶點： 破傷風毒素是一種強效神經毒素，它能夠逆行性地沿著神經軸索傳遞，到達中樞神經系統 (脊髓和腦幹)。
  • 干擾神經傳遞： 在中樞神經系統，破傷風毒素會特異性地結合到神經末梢的抑制性神經元上，阻止神經遞質 (如 γ-氨基丁酸 GABA 和甘胺酸 glycine) 的釋放。
  • 引起肌肉痙攣： 由於抑制性神經傳遞被阻斷，興奮性神經信號失去了調節，導致肌肉持續收縮，引起全身性肌肉痙攣 (spasms) 和僵硬。最典型的症狀包括「牙關緊閉」(lockjaw) 和「角弓反張」(opisthotonos)。
• 總結： 破傷風毒素通過阻斷神經系統的抑制性信號傳導，導致肌肉無法放鬆，從而引起破傷風特有的肌肉痙攣。

本題考查學生對細菌抗生素抗藥性 (antibiotic resistance) 的理解，要求說明抗藥性的產生機制及其影響。

核心觀念：細菌可以透過多種機制獲得對抗生素的抗藥性，這對人類健康構成嚴峻挑戰。

詳解：

抗生素抗藥性是指細菌不再對一種或多種抗生素產生敏感反應，導致原本有效的抗生素治療失效。這種現象是細菌演化和自然選擇的結果，同時也受到人類不當使用抗生素的加速。

1-2 種抗藥性產生機制 (Mechanisms of Antibiotic Resistance):

細菌發展抗藥性的機制多樣，常見的有以下幾種：

(1) 改變抗生素的作用靶點 (Alteration of the antibiotic's target)

• 機制說明： 抗生素通常是通過與細菌細胞內的特定分子 (靶點) 結合來發揮作用，例如抑制細胞壁合成的盤尼西林 (Penicillin) 會結合細菌細胞壁合成酶 (如青黴素結合蛋白 PBP)，或抑制蛋白質合成的四環黴素 (Tetracycline) 會結合核糖體。細菌可以透過基因突變，改變這些靶點的結構，使得抗生素無法再有效地結合，從而失去殺滅或抑制細菌的能力。
• 例子：
  • MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)： 金黃色葡萄球菌對甲氧西林 (Methicillin) 等 β-內醯胺類抗生素產生抗藥性。這是因為 MRSA 獲得了一個額外的基因 (mecA 基因)，該基因編碼一種變異的青黴素結合蛋白 (PBP2a)，其對 β-內醯胺類抗生素的親和力極低，因此即使存在抗生素，細菌也能繼續合成細胞壁。
  • 結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) 對異煙肼 (Isoniazid) 的抗藥性： 異煙肼是一種抑制分枝菌酸 (mycolic acid) 合成的抗生素，而分枝菌酸是結核分枝桿菌細胞壁的重要組成部分。產生抗藥性的結核分枝桿菌，其編碼參與分枝菌酸合成或活化異煙肼的基因 (如 katG, inhA) 可能發生突變，導致異煙肼無法被有效活化或其靶點被改變。

(2) 產生降解或修飾抗生素的酶 (Enzymatic inactivation or modification of the antibiotic)

• 機制說明： 細菌可以產生特定的酶，這些酶能夠化學修飾或破壞抗生素的結構，使其失去活性。這些產生酶的基因通常可以通過質體 (plasmid) 傳遞。
• 例子：
  • β-內醯胺酶 (β-lactamase)： 許多細菌，特別是革蘭氏陰性菌，能夠產生 β-內醯胺酶。這種酶能夠水解 β-內醯胺類抗生素 (如盤尼西林、頭孢菌素) 中的 β-內醯胺環，破壞其結構，使其無法抑制 PBP，從而產生抗藥性。例如，許多大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) 都產生 β-內醯胺酶。

本題考查學生設計實驗的能力，以評估一種新開發的抗生素的殺菌效果。

核心觀念：評估抗生素殺菌效果需要進行體外實驗，確定其最低抑菌濃度 (MIC) 和最低殺菌濃度 (MBC)，並進行體內實驗驗證其在生物體內的有效性。

詳解：

開發一種新的抗生素後，必須進行嚴謹的實驗來評估其殺菌效果，以確定其潛在的臨床應用價值。這通常包括體外 (in vitro) 和體內 (in vivo) 兩個層面的評估。

體外 (In Vitro) 實驗評估：

體外實驗是初步評估抗生素殺菌效力的關鍵步驟，主要用於確定其對特定細菌的抑制和殺滅能力。

(1) 測定最低抑菌濃度 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC)

• 目的： 確定能夠抑制細菌生長所需的最低濃度的抗生素。
• 方法：
  • 微量稀釋法 (Broth Microdilution Method)： 這是最常用的方法。
    1. 準備一系列不同濃度的抗生素溶液，從高濃度到低濃度進行倍比稀釋 (例如，256 µg/mL, 128 µg/mL, 64 µg/mL, ..., 0.5 µg/mL, 0.25 µg/mL)。
    2. 將已知數量的測試細菌 (通常以約 $5 \times 10^5$ CFU/mL 的濃度) 加入到含有不同濃度抗生素的液體培養基中 (例如，Mueller-Hinton broth)。
    3. 將這些培養物在適當的溫度和時間下 (通常是 $37^\circ\text{C}$ 孵育 18-24 小時)。
    4. 觀察哪些濃度的抗生素能夠完全抑制細菌的肉眼可見的生長。
    5. MIC 值： 被定義為能夠完全抑制細菌生長 (即培養液保持澄清，無濁度) 的最低抗生素濃度。
  • 瓊脂擴散法 (Disk Diffusion Assay) / E-test： 這些方法也可以用於初步篩檢，但微量稀釋法是確定 MIC 的標準方法。
• 意義： MIC 值反映了抗生素對特定細菌的「抑菌」效力。MIC 值越低，表示抗生素越有效。

(2) 測定最低殺菌濃度 (Minimum Bactericidal Concentration, MBC)

• 目的： 確定能夠殺滅 99.9% (或 $3 \log_{10}$ 的細菌) 所需的最低濃度的抗生素。
• 方法：
  • 在測定 MIC 的基礎上，從所有顯示完全抑制生長的管 (MIC 及更高濃度) 中，取一定量的培養液 (例如，100 µL)。
  • 將這些樣本塗抹到不含抗生素的瓊脂培養平板上。
  • 在適當的溫度和時間下孵育平板。
  • 觀察哪些濃度的抗生素能夠導致菌落數顯著減少 (例如，從原始接種的細菌量計算，減少 $3 \log_{10}$)。
  • MBC 值： 被定義為能夠殺滅 99.9% 測試細菌的最低抗生素濃度。
• 意義： MBC 值反映了抗生素的「殺菌」效力。

本題考查學生對細菌染色方法「革蘭氏染色法」(Gram stain) 的操作步驟及結果判讀的理解，以及革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的區別。

核心觀念：革蘭氏染色法是微生物學中最基本、最重要的鑑別染色法之一，通過細胞壁結構的差異將細菌分為兩大類。

詳解：

革蘭氏染色法 (Gram Stain) 的操作步驟：

革蘭氏染色法是一個鑑別染色過程，它利用細菌細胞壁結構的差異，通過特定的染色和脫色步驟，將細菌區分為革蘭氏陽性 (Gram-positive) 和革蘭氏陰性 (Gram-negative) 兩大類。這對於初步鑑定細菌種類和指導臨床治療至關重要。

步驟如下：

1. 製備細菌塗片 (Smear Preparation)：

   • 取一乾淨的載玻片，在中央滴一滴無菌水或生理鹽水。
   • 用滅菌後的接種環 (inoculating loop) 或針，取少量待染細菌，在水滴中塗抹均勻，製成薄薄的細菌塗片。
   • 將塗片風乾。
   • 用火焰對塗片進行短暫固定 (heat fixation)，以防止細菌在染色過程中脫落，同時殺死活細菌。注意不要過度加熱，以免破壞細胞結構。

2. 初染 (Primary Staining)：

   • 將細菌塗片覆蓋上 結晶紫 (Crystal Violet) 染液，染色約 30 秒至 1 分鐘。
   • 結晶紫會進入所有細菌細胞，使其呈現紫色。

3. 媒染 (Mordanting)：

   • 小心沖洗掉多餘的結晶紫染液。
   • 將塗片覆蓋上 革蘭氏碘液 (Gram's Iodine)，作用約 30 秒至 1 分鐘。
   • 碘液作為媒染劑，會與結晶紫在細菌細胞壁內形成不溶性的結晶紫-碘複合物 (CV-I complex)。

4. 脫色 (Decolorization)：

   • 這是革蘭氏染色法中最關鍵的步驟。
   • 用 酒精 (95% 乙醇) 或酒精-丙酮混合液 作為脫色劑，從載玻片的一側緩慢滴加，直到流出的液體不再帶有紫色為止 (通常只需幾秒到十幾秒)。
   • 革蘭氏陽性菌： 由於其細胞壁較厚，含有較多的肽聚醣 (peptidoglycan) 層，在碘液作用下形成的 CV-I 複合物不易被酒精溶解和洗脫，因此細菌仍保持紫色。
   • 革蘭氏陰性菌： 其細胞壁較薄，肽聚醣層較少，外層有脂多醣 (LPS)，酒精會溶解外膜的脂質，破壞細胞壁結構，使 CV-I 複合物容易被酒精洗脫，細菌因此失去顏色，變為無色。

5. 復染 (Counterstaining)：

   • 迅速沖洗掉多餘的脫色劑。
   • 將塗片覆蓋上 複紅 (Safranin) 染液，染色約 30 秒至 1 分鐘。
   • 複紅是一種對比染料，會將脫色後的革蘭氏陰性菌染成紅色或粉紅色。
   • 革蘭氏陽性菌本身是紫色的，複紅的紅色相對較淺，通常不會掩蓋原有的紫色，但有時會使其顏色略有加深。