109 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所乙組《微生物學》

本題主要考驗學生對蚊媒傳染病診斷方法的理解。蚊媒傳染病如登革熱、屈公熱、茲卡病毒等，初期症狀相似，鑑別診斷上需要多種方法輔助。

核心觀念：針對相似臨床症狀的疾病，需要利用分子生物學、血清學或病毒分離培養等技術來進行精確診斷。

解題思路：

1. 臨床症狀與流行病學史： 雖然初期症狀相似，但仔細詢問旅遊史、居住地、發病時間、接觸史等流行病學資訊，有助於初步判斷。例如，特定地區流行的疾病。
2. 分子生物學檢測 (Molecular Detection)：
   • RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)： 這是目前最常用且靈敏度高的方法。直接檢測病毒的核酸（RNA 或 DNA），可以在早期感染階段就偵測到病毒。針對不同的蚊媒病毒，可以設計特異性的引子 (primers) 來進行檢測。
   • Real-time PCR (qPCR)： 這是 RT-PCR 的進階形式，可以在 PCR 過程中實時監測產物量，並進行定量分析，能更快速、準確地判斷病毒量。
3. 血清學檢測 (Serological Detection)：
   • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)： 檢測病人血清中的特異性抗體（IgM 或 IgG）。IgM 通常在感染早期出現，而 IgG 則在感染後期或恢復期出現。可以通過檢測抗體類型和效價的變化來判斷是急性感染還是既往感染。

本題延續上一題，要求對所提出的診斷方法進行簡要敘述，並解釋其結果的意義。

核心觀念：理解各種診斷技術的原理、操作以及結果判讀。

解題思路：針對上一題列出的至少三種方法，逐一進行說明。

1. 分子生物學檢測 (如 RT-PCR)：

   • 敘述： 此方法利用逆轉錄酶 (reverse transcriptase) 將病毒的 RNA 反轉錄成 cDNA，然後利用 PCR 技術大量增幅特定的病毒基因片段。透過設計針對不同蚊媒病毒特有的引子 (primers)，可以專一性地偵測到目標病毒。
   • 結果與解釋： 若 PCR 產物被偵測到（例如透過膠體電泳或即時螢光訊號），則表示病患檢體中存在該病毒的遺傳物質，可診斷為該病毒感染。陽性結果通常表示急性感染，因為病毒 RNA 在發病初期最容易被偵測到。陰性結果則表示未偵測到該病毒。

2. 血清學檢測 (如 ELISA)：

   • 敘述： ELISA 是一種常見的免疫檢測方法。在診斷蚊媒病毒感染時，通常會將特定病毒的抗原固定在微盤上，然後加入病患血清。若血清中存在對應的抗體，則會與抗原結合。再加入帶有酵素標記的第二抗體，與結合的抗體反應，最後加入呈色受質，酵素會催化受質產生顏色變化，顏色深淺與抗體量成正比。
   • 結果與解釋：
     • 偵測 IgM 抗體： 若 IgM 抗體陽性，表示近期（急性）感染。
     • 偵測 IgG 抗體： 若 IgG 抗體陽性，表示曾經感染或已具備免疫力。若 IgG 陽性但 IgM 陰性，則可能為較早期的感染或過去感染。

本題考驗學生對病毒命名規則的理解，特別是流感病毒的命名。

核心觀念：流感病毒的命名包含病毒類型、分離地點、分離序號、分離年份以及病毒亞型。

解題思路：
「A/Bangkok/1/19 (H5N1)」是一個典型的流感病毒命名。我們需要逐一解析其中的每個部分：

• A： 表示病毒的類型。流感病毒主要分為 A, B, C, D 四型，其中 A 型流感病毒是唯一能感染人類和多種動物（如禽類、豬等）的，也是引起全球大流行的主要原因。
• Bangkok： 表示病毒分離的地理位置，即泰國曼谷。
• 1： 表示該地點在該年份分離出的第幾株病毒。通常是依時間順序編號，這裡指在曼谷分離出的第一株。
• 19： 表示病毒分離的年份，這裡指 2019 年。

本題考驗學生對流感病毒表面蛋白的瞭解。

核心觀念：H 代表血球凝集素 (Hemagglutinin)，N 代表神經胺酶 (Neuraminidase)。

解題思路：
流感病毒的表面有兩種主要的醣蛋白，對於病毒的感染和複製至關重要：

• H (Hemagglutinin)： 血球凝集素。它是一種能與宿主細胞表面的唾液酸殘基結合的蛋白質。H 的主要功能是介導病毒吸附到宿主細胞，並促進病毒與宿主細胞膜的融合，進而將病毒的遺傳物質注入細胞內。

本題考驗學生對流感病毒變異機制及其對疫情影響的理解。

核心觀念：抗原微變 (antigenic drift) 和抗原移型 (antigenic shift) 是流感病毒演變的兩種主要機制，它們會影響病毒的傳播模式和致病性，進而影響疫情的規模。

解題思路：

首先，分別定義這兩種變異機制：

1. 抗原微變 (Antigenic Drift)：

   • 意義： 指的是流感病毒基因組上發生小的、點突變 (point mutations)，主要發生在編碼血球凝集素 (H) 和神經胺酶 (N) 的基因上。這些突變會導致病毒表面蛋白的胺基酸序列發生細微改變，進而改變病毒的抗原性。
   • 機制： A 型、B 型和 C 型流感病毒都會發生抗原微變。由於流感病毒 RNA 聚合酶缺乏校對功能，複製過程中容易產生錯誤。
   • 影響：
     • 特定地區性 (Endemic) 影響： 抗原微變是流感病毒每年流行的主要原因。由於病毒抗原性的細微改變，人群之前對舊病毒株產生的免疫力會部分減弱，但通常仍能提供一定的保護，因此不會引發大規模的全球流行，而是導致季節性流感在特定地區（如國家或地區）的週期性爆發，形成地方性流行 (endemic)。
     • 較廣泛地區性 (Epidemic) 影響： 如果微變累積到一定程度，導致病毒抗原性發生較明顯的變化，且人群的免疫力普遍不足以抵抗，則可能在一個較大的區域（如洲際）或甚至全球範圍內引發較嚴重的流行，稱為流行 (epidemic)。但與移型相比，微變引起的流行通常不會像移型那樣具有毀滅性，因為人群仍保有部分免疫記憶。

2. 抗原移型 (Antigenic Shift)：

   • 意義： 指的是流感病毒基因組發生重大的、突然的改變，通常是通過基因重組 (reassortment) 產生的。當兩種不同的流感病毒（例如一種感染人類，另一種感染禽類或豬）同時感染同一個宿主細胞時，它們的基因片段（流感病毒是分節段的 RNA 病毒）可能會發生交換，產生一個全新的病毒株，其 H 或 N 蛋白（或兩者）與先前流行的病毒株有顯著差異。
   • 機制： 主要發生在 A 型流感病毒，因為 A 型流感病毒的宿主範圍廣泛（禽類、豬、人類等），容易發生基因片段交換。
   • 影響：

本題考驗學生對腸道菌群 (Gut Microbiota) 研究技術的掌握。

核心觀念：腸道菌群的研究涵蓋了從菌群組成、功能到其與宿主互動的多個層面，需要結合多種技術手段。

解題思路：
腸道菌群的研究技術可以大致分為以下幾類：

1. 菌群組成分析 (Composition Analysis)：

   • 16S rRNA 基因定序 (16S rRNA gene sequencing)：
     • 敘述： 這是目前最常用、最經典的方法。16S rRNA 基因是細菌核糖體的小亞基 RNA 的組成部分，其序列在細菌之間存在變異，但同時也包含一些保守區域。通過 PCR 擴增樣本中的 16S rRNA 基因（通常是 V3-V4 或 V4 區域），然後進行高通量定序 (High-throughput sequencing, 如 Illumina)。
     • 結果： 根據定序結果，可以識別出樣本中存在的細菌種類，並計算它們的相對豐度，從而了解菌群的組成結構。可以進行到屬 (Genus) 或種 (Species) 的水平。
   • 全基因組鳥槍法定序 (Whole Genome Shotgun Metagenomics, WGS)：
     • 敘述： 直接對樣本中的所有微生物（包括細菌、真菌、病毒等）的總 DNA 進行隨機片段化和高通量定序。
     • 結果： 這種方法不僅能提供菌群組成資訊，還能提供菌群的基因組資訊，包括功能基因，從而推測菌群的潛在功能。準確性比 16S rRNA 基因定序更高，可以達到物種甚至菌株水平。

2. 菌群功能分析 (Functional Analysis)：

   • 宏基因組學 (Metagenomics)：
     • 敘述： 同上，透過 WGS 定序，分析樣本中所有微生物的基因，推測菌群的代謝途徑、酶活性等功能。
     • 結果： 可以了解菌群在代謝（如碳水化合物代謝、胺基酸代謝）、能量產生、抗生素抗性等方面可能扮演的角色。
   • 宏轉錄組學 (Metatranscriptomics)：
     • 敘述： 分析樣本中所有微生物的 RNA 轉錄產物，即「活性基因」。
     • 結果： 可以了解在特定時間點，哪些基因在菌群中被活躍表達，直接反映菌群的實際功能活動狀態，比基因組更能代表當前的功能。
   • 宏蛋白質組學 (Metaproteomics)：
     • 敘述： 分析樣本中所有微生物的蛋白質，確定實際存在的蛋白質及其豐度。
     • 結果： 提供最直接的功能證據，確認哪些蛋白質被合成，進而推斷菌群的實際功能。

3. 菌群代謝物分析 (Metabolomics)：

   • 敘述： 利用質譜儀 (Mass Spectrometry, MS) 或核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 等技術，分析樣本（如糞便、血液、尿液）中的小分子代謝物。

本題考驗學生對細菌毒力因子的基本認識。

核心觀念：毒力因子是微生物用來感染宿主、逃避免疫系統、獲取養分並造成組織損傷的分子或結構。

解題思路：
細菌毒力因子種類繁多，可分為幾大類。從大學微生物學課程中學習過的，至少列出三種並簡要介紹。

以下列出幾種常見且重要的毒力因子：

1. 外毒素 (Exotoxins)：

   • 意義： 由細菌分泌到細胞外的小分子蛋白質，能引起廣泛的生理效應，對宿主造成傷害。
   • 種類與介紹：
     • 細胞毒素 (Cytotoxins)： 直接破壞宿主細胞。例如：金黃色葡萄球菌的溶血素 (hemolysins) 破壞紅血球；白喉桿菌的外毒素抑制蛋白質合成。
     • 神經毒素 (Neurotoxins)： 影響神經系統。例如：肉毒桿菌的毒素 (botulinum toxin) 引起肌肉鬆弛導致麻痺；破傷風桿菌的毒素 (tetanus toxin) 引起肌肉痙攣。
     • 腸毒素 (Enterotoxins)： 影響腸道黏膜，引起腹瀉、嘔吐。例如：霍亂弧菌的腸毒素 (cholera toxin) 導致大量水分流失；金黃色葡萄球菌的腸毒素引起食物中毒。
     • 二元毒素 (Binary toxins)： 由兩部分組成，一部分負責結合宿主細胞，另一部分負責進入細胞發揮毒性。例如：炭疽桿菌的致死因子 (lethal factor) 和水腫因子 (edema factor) 構成炭疽毒素。

2. 內毒素 (Endotoxins)：

   • 意義： 主要存在於革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS) 的脂質 A 部分。當細菌死亡、細胞壁崩解時釋放出來。
   • 作用： 引起宿主強烈的免疫反應，包括發燒、炎症、休克、彌散性血管內凝血 (DIC) 等。即使是極少量內毒素，也可能引起嚴重的全身性反應。

3. 酵素 (Enzymes)：

   • 意義： 一些細菌產生特定的酵素，幫助它們入侵組織、獲取養分，或逃避免疫系統。
   • 種類與介紹：
     • 膠原酶 (Collagenase)： 分解結締組織中的膠原蛋白，幫助細菌擴散。
     • 透明質酸酶 (Hyaluronidase)： 分解結締組織中的透明質酸，降低組織的黏稠度，有利於細菌擴散，被稱為「擴散因子」。
     • 凝固酶 (Coagulase)： 由金黃色葡萄球菌產生，能使血漿中的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白，形成血栓包圍細菌，保護其免受吞噬細胞的吞噬。

本題考驗學生對細菌基本細胞結構的認識。

核心觀念：細菌具有一些獨特的細胞結構，這些結構在細菌的生存、繁殖、致病等方面扮演重要角色，並與其分類和診斷有關。

解題思路：
從大學微生物學課程中，可以列出許多細菌的細胞結構。需要選擇至少三種，並簡要介紹其組成和功能。

以下是一些常見的細菌細胞結構：

1. 細胞壁 (Cell Wall)：

   • 組成： 主要由肽聚醣 (peptidoglycan) 組成。革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚，含有較多肽聚醣和磷壁酸 (teichoic acids)；革蘭氏陰性菌的細胞壁較薄，肽聚醣層在外膜 (outer membrane) 和細胞膜 (cytoplasmic membrane) 之間。
   • 功能： 維持細胞的形狀，防止細胞因滲透壓差異而破裂，是許多抗生素（如盤尼西林）的作用標的。

2. 細胞膜 (Cell Membrane / Cytoplasmic Membrane)：

   • 組成： 由磷脂雙層 (phospholipid bilayer) 和蛋白質組成，與真核細胞的細胞膜相似。
   • 功能： 控制物質進出細胞（選擇性通透），參與能量代謝（呼吸鏈）、物質合成、信號傳導等。

3. 細胞質 (Cytoplasm)：

   • 組成： 包含水、無機鹽、蛋白質、核酸、代謝中間產物等。
   • 功能： 細胞內新陳代謝的主要場所，許多生化反應在此進行。

4. 核區 / 類核 (Nucleoid / Region)：

   • 組成： 含有細菌的遺傳物質——一條環狀的雙股 DNA 分子（染色體），沒有核膜包圍。
   • 功能： 儲存遺傳資訊，控制細胞的生長和繁殖。

5. 質體 (Plasmid)：

   • 組成： 位於細胞質中，獨立於染色體之外的小型環狀 DNA 分子。
   • 功能： 通常攜帶一些非必需但對細菌有利的基因，例如抗生素抗性基因、毒力因子基因、代謝酶基因等。在細菌遺傳和演化中扮演重要角色。

本題考驗學生對臨床微生物學分離培養技術的理解，特別是針對腸道細菌的特性。

核心觀念：分離腸道細菌需要考慮其厭氧性、對特定營養的需求以及與其他菌群的競爭。

解題思路：
從臨床糞便檢體分離單一細菌種類，需要一個系統性的步驟，並且要特別注意腸道細菌的生理特性，尤其是它們多為厭氧菌，且腸道內菌群複雜，存在競爭。

以下是進行此實驗的步驟和考量：

1. 檢體處理與稀釋：

   • 步驟： 取少量糞便檢體，用無菌生理食鹽水或緩衝液進行適當稀釋。
   • 考量： 糞便檢體含有極高濃度的細菌，直接塗抹會導致菌落過密，無法分離。稀釋倍數需根據目標菌的預期濃度來調整。

2. 選擇性培養基 (Selective Media)：

   • 步驟： 使用針對腸道細菌的選擇性培養基進行培養。
   • 考量： 腸道菌群極其複雜，包含數百種甚至上千種細菌。選擇性培養基是關鍵，它能抑制部分雜菌（如革蘭氏陽性菌或非腸道細菌）的生長，同時促進目標腸道細菌（通常是革蘭氏陰性菌）的生長。
     • 常見的選擇性培養基：
       • MacConkey agar： 含有膽鹽和結晶紫，抑制革蘭氏陽性菌生長，允許革蘭氏陰性菌生長。同時含有乳糖，可區分乳糖發酵菌 (如大腸桿菌) 和非乳糖發酵菌 (如沙門氏菌、志賀氏菌)。
       • XLD agar (Xylose Lysine Deoxycholate agar)： 常用於分離沙門氏菌和志賀氏菌，抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌，並能區分發酵特性。
       • SS agar (Salmonella-Shigella agar)： 選擇性分離沙門氏菌和志賀氏菌。
     • 目標菌的特性： 如果教授有特定目標菌（例如：大腸桿菌、沙門氏菌、厭氧菌如脆弱擬桿菌），則需要選擇更具針對性的培養基。

3. 厭氧培養 (Anaerobic Culture)：

   • 考量： 大部分腸道細菌是嚴格厭氧菌 (obligate anaerobes) 或兼性厭氧菌 (facultative anaerobes)。若目標菌是厭氧菌，則必須在無氧環境下培養。
   • 方法：
     • 厭氧培養箱 (Anaerobic chamber)： 提供完全無氧的環境，通常用於分離嚴格厭氧菌。
     • 厭氧罐 (Anaerobic jar)： 含有化學藥劑，能吸收培養箱內的氧氣並產生還原劑，營造無氧環境。