112 年 國立臺灣大學植物病理與微生物學系碩士班甲組《植物病原微生物學》

此題為真菌學的基礎知識測驗，包含名詞解釋、病原菌介紹、真菌生殖與感染機制等。

1. 名詞解釋 (每小題2分,共10分)

   • a. ergotism (麥角中毒)：由麥角菌（Claviceps purpurea）產生的一種毒素（麥角生物鹼）引起的人畜中毒症狀。嚴重時可導致幻覺、抽搐、壞疽，甚至死亡。
   • b. acervulus (分生孢子盤)：一種真菌的無性繁殖結構，通常由一層或多層菌絲構成基部，其上密集成群地產生分生孢子梗和分生孢子。常見於許多子囊菌亞門的真菌，如炭疽病菌。
   • c. basidium (擔子)：擔子菌亞門真菌（Basidiomycota）特有的有性繁殖結構，通常呈棒狀，頂端或側面會長出擔孢子（basidiospore）。擔子是擔孢子萌發後形成的二倍體合子經過減數分裂產生單倍體擔孢子的場所。
   • d. endophytic fungi (內生真菌)：指寄生在植物體內，但通常不引起明顯病徵的真菌。牠們可以存在於植物的組織、細胞間隙或細胞內，並可能對寄主產生益處（如提高抗病性、抗旱性、促進生長）或有害影響。
   • e. sporangium (孢子囊)：真菌、藻類、蕨類植物等進行無性繁殖的結構，內含大量孢子（sporangiospore）。孢子囊壁破裂後，釋放出孢子，孢子萌發後可形成新的個體。

2. 樹木褐根病 (5分)

   • 病原菌：樹木褐根病（Tree root rot）的主要病原菌是擔子菌亞門的Phellinus noxius（褐根病菌）。
   • 完整學名：Phellinus noxius (Corner) C. L. Gilb. & Ryv.
   • 分類地位：
     • 界 (Kingdom): Fungi (真菌界)
     • 門 (Phylum): Basidiomycota (擔子菌亞門)
     • 綱 (Class): Agaricomycetes (傘菌綱)
     • 目 (Order): Polyporales (多孔菌目)
     • 科 (Family): Hymenochaetaceae (革革菌科)
     • 屬 (Genus): Phellinus (褐革菌屬)
     • 種 (Species): P. noxius
   • 侵染、傳播、蔓延與防治：
     • 侵染：主要透過根部接觸侵染。病菌在土壤中或藉由被污染的木材、根部殘體等存在，當健康樹木的根部與受感染的根部接觸，或土壤中帶有病菌時，病菌會從根部傷口侵入。
     • 傳播：
       • 水平傳播：透過根部直接接觸，是主要傳播方式。
       • 土壤傳播：病菌可在土壤中存活，透過雨水、灌溉水或人為活動（如機械操作）傳播。
       • 木材傳播：被病菌感染的木材（如腐木、被污染的工具）也是傳播媒介。
       • 氣流傳播：擔子菌門的真菌常產生擔孢子，這些孢子可以透過氣流傳播，但P. noxius較少以孢子作為主要的傳播方式，根部接觸更為關鍵。
     • 蔓延：病菌在土壤中或樹木根系中緩慢蔓延，形成菌網，逐步侵蝕健康的根部組織。
     • 防治：
       • 移除病株與根系：發現病株後，應立即將整株連同根系徹底移除並銷毀，以防止根部接觸傳播。
       • 土壤消毒：對受感染區域進行土壤處理，如翻耕、日曬、化學藥劑處理（效果有限）。
       • 建立隔離帶：在病區周圍挖掘隔離溝，阻斷根部接觸傳播。
       • 種植抗病樹種：選擇對褐根病有抗性的樹種。
       • 避免傷口：減少不必要的根部修剪，避免機械傷害。
       • 健康苗木：確保使用的苗木沒有帶菌。

3. 玉米黑穗病菌（Ustilago maydis）有性生殖四大步驟 (6分)
   玉米黑穗菌屬於擔子菌亞門的偽銹菌綱（Ustilaginomycetes）。其有性生殖遵循擔子菌的基本法則，主要有四大步驟，其細胞、基因體倍體數變化及與感染過程的關聯性如下：

   • 步驟一：擔孢子（basidiospore）的形成與萌發
     • 細胞/基因體倍體數：從單倍體 (n) 的擔孢子萌發。

此題主要探討植物寄生性線蟲，包含線蟲的分類、寄主、入侵機制、研究技術及生活史調控。

1. 植物線蟲舉例 (6分)

   • 屬 Meloidogyne (根瘤線蟲屬)：
     • 學名：Meloidogyne incognita (南方根瘤線蟲)
     • 中文俗名：南方根瘤線蟲
     • 重要寄主作物：番茄、棉花、大豆、菸草、瓜類、花生等，是廣泛的農業害蟲。
   • 屬 Aphelenchoides (葉 प्रवास線蟲屬)：
     • 學名：Aphelenchoides besseyi (稻草葉 प्रवास線蟲)
     • 中文俗名：稻草葉 प्रवास線蟲
     • 重要寄主作物：水稻（主要影響種子發育，造成白穗病）、觀賞植物（如菊花、鳳仙花）等。

2. 根瘤線蟲「入侵」植物根部的行為與機制 (8分)
   根瘤線蟲（Meloidogyne spp.）是植物根部最重要的內寄生線蟲之一。其入侵行為與機制如下：

   • 行為：
     1. 尋找寄主：線蟲在土壤中感知寄主的根部滲出物（如氨基酸、糖類），並朝根部移動。
     2. 附著與穿刺：當線蟲到達根尖或根毛區域時，會用其口針（stylet）刺入植物細胞，並開始攝食。
     3. 侵入：幼蟲（第二期幼蟲，J2）是主要的侵入階段。牠們利用口針刺穿根毛或表皮細胞，然後在細胞間或細胞內移動，逐漸深入根組織，通常朝向維管束區域移動。
   • 機制：
     1. 口針穿刺：線蟲擁有一個空心的口針，可以像注射器一樣刺入植物細胞，並分泌唾液。
     2. 唾液注入：線蟲會將唾液注入植物細胞。唾液中含有多種酵素（如纖維素酶、果膠酶）和生長調節物質（如細胞分裂素、生長素的類似物）。
     3. 組織重塑（誘導餵食細胞）：
        • 酵素作用：唾液中的酵素分解細胞壁，幫助線蟲在組織間移動。
        • 細胞反應：生長調節物質會誘導植物細胞發生一系列變化，最關鍵的是誘導形成「餵食細胞」（feeding cells）。這些餵食細胞通常是維管束周圍的薄壁細胞，牠們會：
          • 增大：細胞體積顯著增大。
          • 細胞核增大與倍增：細胞核增大，染色質增加，甚至發生核分裂（endoreduplication），形成多倍體細胞核。
          • 細胞質增多：細胞質增多，內質網、核糖體等細胞器增生，以提供線蟲攝食所需的養分。
          • 細胞壁變薄：細胞壁變薄，有利於線蟲的口針刺入和養分傳輸。
        • 根瘤形成：這些餵食細胞的異常增生和分化，最終導致根部形成典型的根瘤（root gall）或根瘤狀突起，線蟲則寄居在這些區域，持續從餵食細胞獲取養分。
     4. 運動與定位：線蟲在根組織內通過擺動身體和利用口針進行推進，通常會朝向高滲透壓或富含營養的區域移動，即維管束附近。

3. 研究線蟲發育的技術及原理 (6分)
   研究線蟲發育的技術多利用其生活史特性、分子生物學工具及影像學技術。

   • 技術一：連續性影像學觀察 (Continuous imaging)
     • 原理：利用顯微鏡（如光學顯微鏡、共軛焦顯微鏡）結合延時攝影（time-lapse microscopy）或活體螢光成像技術，實時或間隔拍攝線蟲在發育過程中的形態變化、細胞分裂、器官形成等。
     • 應用：觀察線蟲從卵孵化、經歷各齡期幼蟲、變態、到成蟲的過程，以及不同階段的行為、運動模式。例如，可觀察線蟲如何尋找寄主、如何形成餵食細胞、以及性發育的過程。
   • 技術二：分子標記與基因調控技術 (Molecular markers and gene regulation)

本題為植物病毒學的重點測驗，涵蓋病毒基因表達策略、cDNA clone應用、特定病毒介紹及病毒檢測方法。

1. (+)ssRNA 病毒利用次基因體 RNA (subgenomic RNA) 表達基因 (5分)
   許多(+)ssRNA 病毒在寄主細胞內能利用次基因體 RNA (sgRNA) 來有效率地調控其基因的表達。其運作機制如下：

   • 基因體 RNA 的複製：(+)ssRNA 病毒基因體 RNA 進入寄主細胞後，可直接作為 mRNA 被翻譯，產生病毒的 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp)。此 RdRp 會以基因體 RNA 為模板，合成負鏈 RNA ((-)RNA)，再以負鏈 RNA 為模板，合成大量的陽性單鏈基因體 RNA，以及一系列的次基因體 RNA。
   • 次基因體 RNA 的產生：在合成基因體 RNA 的過程中，病毒的 RdRp 會識別基因體 RNA 上特定的內部起始位點 (internal promoter) 或終止訊號，合成出比基因體 RNA 更短的 RNA 分子，這些就是次基因體 RNA (sgRNA)。sgRNA 通常帶有病毒基因體 RNA 的 5' 端序列，但缺少 3' 端的部分基因。
   • sgRNA 的功能：sgRNA 的主要功能是作為 mRNA，用於翻譯病毒結構蛋白（如衣殼蛋白、包膜蛋白）和其他非結構蛋白。
   • 優勢：
     • 精確調控表達：sgRNA 的產生和數量可以被病毒精確調控，確保在感染週期後期，結構蛋白能被大量合成，以組裝新的病毒顆粒。
     • 避免過度表達：對於一些在早期感染階段不需要大量表達的基因（如 RdRp），病毒可以不產生 sgRNA，而是依賴基因體 RNA 的翻譯。這樣可以避免某些蛋白的過度表達，維持細胞內的平衡。
     • 效率：相較於直接從長基因體 RNA 上翻譯所有蛋白，利用 sgRNA 可以更有效率地產生特定蛋白質。

2. 建立具感染力的 cDNA clone 的重要性 (6分)
   建立具感染力的病毒 cDNA clone，是指將病毒的 RNA 基因體（或其部分片段）反轉錄成 cDNA，然後將其插入載體（如質體）中，並在寄主細胞或生物體內重組出具有感染力的病毒顆粒。其重要性體現在：

   • 病毒研究的標準化工具：
     • 重現性研究：一旦獲得具感染力的 cDNA clone，就可以在實驗室中穩定地、大量地生產病毒，便於進行重複性的實驗和驗證結果。
     • 精確突變分析：可以通過在 cDNA 序列上進行定點突變，然後再轉錄成 RNA 並感染寄主，來研究特定基因或序列對病毒複製、致病性、傳播性、抗藥性等方面的影響。這是研究病毒基因功能的強大工具。
     • 病毒變異研究：可以模擬病毒的變異，觀察變異對病毒特性的影響。
   • 病毒疫苗與診斷試劑開發：
     • 疫苗開發：可以利用 cDNA clone 產生滅活疫苗、減毒疫苗，或作為載體疫苗的表達系統。
     • 診斷試劑開發：可以利用 cDNA clone 產生抗原，用於開發抗體檢測試劑（如 ELISA），或作為 PCR/RT-PCR 的陽性對照。
   • 病毒生態學與演化研究：
     • 研究病毒的擴散與演化：透過合成不同來源的病毒 cDNA clone，可以比較它們的基因序列差異，追溯病毒的演化路徑和傳播歷史。
   • 開發抗病毒策略：
     • 基因沉默研究：可以利用 cDNA clone 誘導基因沉默（如 RNAi），以研究如何抑制病毒複製。

   舉例說明：

   • 研究病毒致病機制：例如，研究 Tobacco Mosaic Virus (TMV) 的致病性。科學家可以將 TMV 的基因體 RNA 反轉錄成 cDNA，克隆到載體中，製備成具感染力的 cDNA clone。然後，通過對 cDNA 進行定點突變，例如改變某個結構蛋白或非結構蛋白的基因序列，再轉錄成 RNA 感染煙草。觀察突變株引起的病徵是否與野生型病毒不同，從而確定該基因在致病性中的作用。

3. 番茄黃化捲葉泰國病毒 (TYLCTHV) (7分)

   • 引起的病害：番茄黃化捲葉病 (Tomato Yellow Leaf Curl Disease)。
   • 病徵：
     • 黃化：新葉的葉脈間出現黃化，嚴重時整個葉片變黃。
     • 捲葉：葉片向內捲曲，尤其是下位葉。
     • 畸形：葉片變小、變窄、變脆，甚至呈羽狀分裂。
     • 植株矮化：植株生長受阻，植株矮小。
     • 產量下降：結果少，果實品質差。
   • 病毒顆粒型態：TYLCTHV 屬於雙生病毒科 (Geminiviridae)，其病毒顆粒為二十面體（icosahedral），直徑約 18-22 奈米，通常成對（diphtheria-like particles）或成簇存在於植物細胞核內。
   • 核酸特性：TYLCTHV 是 單鏈 DNA 病毒，其基因體是一個單一的、環狀的、陽性單鏈 DNA 分子（(+)ssDNA），大小約 2.7-2.8 kb。

本題為植物病原細菌學的內容，包含病害的病原菌鑑定、特定細菌的致病機制與病徵、細菌傳播途徑及鑑定方法。

1. 植物病害的病原菌鑑定 (6分)

   • (1) Pierce's disease of grape
     • 病原菌：Xylella fastidiosa (施氏潛伏桿菌)
   • (2) Rice bacterial leaf blight
     • 病原菌：Xanthomonas oryzae pv. oryzae (稻白葉枯病專一化細菌)
   • (3) Crown gall
     • 病原菌：Agrobacterium tumefaciens (根癌土壤桿菌) / Agrobacterium vitis (葡萄根癌土壤桿菌，專門感染葡萄) - 通常考 Agrobacterium tumefaciens。

2. 引起phyllody 和 witches' broom 的病原細菌 (7分)
   引起植物上phyllody（花葉化）和 witches' broom（掃帚病）病徵的病原細菌屬於 立克次氏體樣細菌 (Rickettsia-like bacteria, RLB) 或更準確地說是 植物體內共生細菌 (Phytoplasmas) 和 類立克次氏體樣細菌 (Candidatus Liberibacter)。其中，植物體內共生細菌 (Phytoplasmas) 是最主要的病原體。

   • 病原細菌種類：植物體內共生細菌 (Phytoplasmas)。牠們是缺乏細胞壁的、專性細胞內寄生細菌，通常寄生在植物的韌皮部組織中，並由昆蟲（如葉蟬、飛蝨）傳播。
   • 細菌特徵：
     • 缺乏細胞壁：沒有典型細菌的細胞壁，細胞膜外有一層鞘。
     • 專性細胞內寄生：只能寄生在植物的韌皮部導管細胞內，以及傳播媒介昆蟲的體內。
     • 基因體小：基因體相對較小，依賴寄主提供必需的代謝物質。
     • 形態多樣：在顯微鏡下形態多變，常呈球形、橢圓形或絲狀。
     • 難以培養：在實驗室的人工培養基上難以培養。
   • 病徵描述：
     • Phyllody (花葉化)：
       • 病害舉例：芝麻花葉病 (Sesame phyllody)。
       • 外觀描述：原本應發育成花朵的結構，轉變成類似葉片的綠色、扁平結構。花瓣、雄蕊、雌蕊等器官發育異常，失去其原有的形態和功能，表現出葉片化的特徵。整體花序可能變得叢生、畸形。
     • Witches' broom (掃帚病)：
       • 病害舉例：桑樹掃帚病 (Mulberry witches' broom)。
       • 外觀描述：植物的頂端或側芽失去頂芽優勢，大量分枝異常增生，形成叢生、細長、密集的枝條，狀似掃帚。這些增生的枝條通常較細弱，葉片可能變小、變黃。

3. 植物病原細菌的傳播方式 (6分)
   植物病原細菌的傳播方式多樣，主要包括：

   • 水：
     • 原理：雨水、灌溉水、地表水等，攜帶細菌從一個地方傳播到另一個地方。細菌可以附著在水滴上，或在水中存活一段時間。
     • 舉例：稻白葉枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）可以透過雨水或灌溉水在田間傳播。
   • 昆蟲：
     • 原理：許多細菌通過昆蟲（如蚜蟲、葉蟬、飛蝨、薊馬、象鼻蟲等）傳播。昆蟲在取食受感染植物時，將細菌帶到健康植物上，或通過其排泄物、體表污染傳播。
     • 舉例：根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）可以被多種土壤昆蟲（如某些象鼻蟲、蕈蚋）攜帶。