113 年 國立臺灣大學生化科技系碩士班《分子生物學（D）》

RNA Interference (RNAi) 是一種存在於真核生物中的後轉錄調控機制，它利用雙股 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 來抑制特定基因的表現。此機制在生物學中扮演著重要的角色，包括基因沉默、病毒防禦、染色質重塑以及調控基因表現的複雜網絡。

生物學核心概念：
RNAi 的核心概念是「基因沉默」，即透過降解目標 mRNA 或抑制其轉譯來降低特定基因的表現量。這個過程對於維持細胞穩態、抵抗病原體以及調節發育至關重要。

分子機制：
RNAi 的主要路徑涉及幾個關鍵的蛋白質和 RNA 分子：

1. dsRNA 的產生與加工：

   • 外源性 dsRNA（例如病毒 RNA 或實驗導入的 dsRNA）或內源性 dsRNA（例如 microRNA, miRNA 的前驅體）是 RNAi 的起始信號。
   • Dicer 是一種 RNase III 核酸酶，它負責將長鏈 dsRNA 或 pre-miRNA 切割成約 21-25 個核苷酸的短鏈 dsRNA，稱為小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA) 或 microRNA (miRNA)。

2. RISC 複合體的形成與作用：

   • 加工後的 siRNA 或 miRNA 會與一系列蛋白質結合，形成 RNA 誘導的沉默複合體 (RNA-induced silencing complex, RISC)。
   • RISC 複合體的核心是 Argonaute (Ago) 蛋白家族。其中一個股的 RNA（通常是 miRNA 的成熟股或 siRNA 的反義股）會與 Ago 蛋白結合，成為引導股 (guide strand)。
   • 另一股 RNA（旅客股, passenger strand）通常會被降解。

3. 目標 mRNA 的識別與沉默：

   • 引導股會引導 RISC 複合體搜尋與其序列互補的目標 mRNA。
   • 如果引導股與目標 mRNA 的互補程度非常高（通常發生在 siRNA），Ago 蛋白（特別是具有 RNase 活性的 Ago 蛋白，如 Ago2 在哺乳動物中）會直接切割目標 mRNA，導致其快速降解。

此題主要在探討細胞重Programming（細胞重塑）的歷史性發現，以及兩位諾貝爾獎得主 Gurdon 和 Yamanaka 所使用的關鍵分子方法與實驗發現。

核心觀念：
細胞的分化是不可逆的過程，成熟的細胞（如體細胞）已經失去了分化成其他細胞類型的潛力。然而，Gurdon 和 Yamanaka 的研究證明，這種「不可逆性」是可以被打破的，即成熟的體細胞可以被「重Programming」回多潛能狀態，甚至發育成完整的個體。

John B. Gurdon 的研究 (1950s-1960s)：

• 分子方法： Gurdon 主要使用了「核移植 (nuclear transplantation)」技術。他將一個成熟的蛙類腸道上皮細胞（體細胞）的細胞核，移植到一個已經去核的蛙卵細胞中。
• 實驗發現：
  • Gurdon 發現，從腸道細胞核移植到去核卵細胞中的受精卵，能夠發育出蝌蚪，甚至成蛙。
  • 這表明，成熟的體細胞核仍然保有發育出完整個體的潛力，其 DNA 中的遺傳信息並未丟失或被不可逆地改變。
  • 然而，他發現早期發育階段的細胞核（如來自胚胎細胞）移植成功率遠高於晚期發育階段的細胞核（如來自腸道細胞），這暗示著細胞核在分化過程中經歷了某種程度的「調控」或「表觀遺傳學上的改變」，但並非完全不可逆。
  • Gurdon 的研究奠定了「體細胞核具有全能性」的基礎概念，儘管他當時對具體分子機制了解有限。

Shinya Yamanaka 的研究 (2006年)：

• 分子方法： Yamanaka 團隊使用「逆轉錄病毒載體 (retroviral vectors)」將四個特定的轉錄因子（後被稱為 Yamanaka factors）導入到小鼠的成熟的體細胞（成纖維細胞）中。這四個因子是：
  • Oct3/4
  • Sox2
  • Klf4
  • c-Myc
• 實驗發現：

此題旨在探討真核生物中複雜的基因表現調控，特別是「表觀遺傳學調控 (epigenetic gene regulation)」。

核心觀念：
表觀遺傳學調控是指在不改變 DNA 序列本身的基礎上，通過遺傳性的改變來調控基因表現。這些改變可以影響染色質的結構，進而影響 DNA 的可及性，最終決定基因是處於開啟（活化）還是關閉（沉默）的狀態。這種調控是可遺傳的，並且可以受到環境因素的影響。

表觀遺傳學調控的過程：
在真核細胞中，DNA 被緊密地包裝在稱為染色質 (chromatin) 的結構中。染色質由 DNA 和組蛋白 (histones) 蛋白質組成。表觀遺傳學調控主要通過改變染色質結構來實現：

1. 染色質結構的鬆緊度： 緊密的染色質（異染色質, heterochromatin）通常與基因沉默相關，因為 DNA 可及性低；而鬆散的染色質（常染色質, euchromatin）則與基因活化相關，因為 DNA 可及性高，便於轉錄因子結合。
2. DNA 甲基化： DNA 序列本身（通常是胞嘧啶, cytosine）上的化學修飾，特別是在 CpG dinucleotides 中。
3. 組蛋白修飾： 組蛋白尾端的化學修飾，如乙醯化 (acetylation)、甲基化 (methylation)、磷酸化 (phosphorylation)、泛素化 (ubiquitination) 等。

四種主要的表觀遺傳學調控機制：

1. DNA 甲基化 (DNA Methylation)：

   • 過程： 在哺乳動物中，DNA 甲基化主要發生在胞嘧啶（C）的第五個碳原子上，通常在 CpG 二核苷酸序列中（C-phosphate-G）。這種反應由 DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferases, DNMTs) 催化。
   • 調控作用：
     • CpG 島（CpG islands）位於基因的啟動子區域。當 CpG 島被高度甲基化時，通常會導致基因沉默。
     • 甲基化的 DNA 可以直接招募抑制性蛋白質，進而形成更緊密的染色質結構。
     • DNA 甲基化可以阻止轉錄因子結合到啟動子區域。

2. 組蛋白乙醯化 (Histone Acetylation)：

   • 過程： 組蛋白（特別是 H2A, H2B, H3, H4）的 N 端尾巴上的賴胺酸 (lysine) 殘基可以被乙醯化。這個過程由組蛋白乙醯轉移酶 (histone acetyltransferases, HATs) 催化，並可被組蛋白去乙醯酶 (histone deacetylases, HDACs) 去除。
   • 調控作用：
     • 乙醯化會中和組蛋白尾巴上帶正電的賴胺酸殘基，使其帶電性減弱。
     • 這會削弱組蛋白與帶負電的 DNA 之間的靜電吸引力，導致染色質結構鬆弛（euchromatin）。

此題要求解釋原核生物的轉譯過程，並列出其與真核生物轉譯的四點差異。

原核生物的轉譯過程 (Translation in Prokaryotes)：

轉譯是將 mRNA 中的遺傳信息轉化為蛋白質的過程。在原核生物中，由於沒有細胞核，轉錄和轉譯是高度偶聯的 (coupled)。這意味著，在 mRNA 分子合成的過程中，核糖體就可以開始在其上進行轉譯。

主要步驟如下：

1. 起始 (Initiation)：

   • 起始密碼子： mRNA 的起始點通常是 AUG 密碼子，它編碼 N-甲硫胺酸 (N-formylmethionine, fMet)。
   • 核醣體結合： 原核生物的 30S 核醣體亞基識別 mRNA 上的 Shine-Dalgarno 序列（一個富含嘌呤的序列，通常位於起始 AUG 前 6-12 個核苷酸處），並與其結合。
   • 起始 tRNA： 一個特殊的起始 tRNA (tRNA^fMet) 攜帶著 N-甲硫胺酸，它能與 30S 亞基和起始密碼子結合。
   • 70S 核醣體形成： 50S 核醣體亞基隨後結合，形成一個完整的 70S 起始複合物。起始 tRNA 位於 P 位點 (peptidyl site)。

2. 延伸 (Elongation)：

   • 胺醯-tRNA 的進入： 攜帶下一個胺基酸的胺醯-tRNA (aminoacyl-tRNA) 在延伸因子 (elongation factors, EF-Tu/EF-G) 和 GTP 的協助下，進入核醣體的 A 位點 (aminoacyl site)。
   • 胜肽鍵形成： 位於 P 位點的胜肽鏈（最初是 fMet）與 A 位點的胺醯-tRNA 上的胺基酸之間形成一个胜肽鍵。這個反應由 50S 亞基的 23S rRNA 催化（核醣體本身具有核酶活性, ribozyme activity）。
   • 移位 (Translocation)： 核醣體沿著 mRNA 向 3' 方向移動一個密碼子。這個過程由延伸因子 (EF-G) 和 GTP 驅動。
     • 原先位於 P 位點的 tRNA 移動到 E 位點 (exit site) 並釋放。
     • 原先位於 A 位點的胜肽鏈-tRNA 移動到 P 位點。
     • A 位點變得空置，準備接受下一個胺醯-tRNA。
   • 這個循環不斷重複，直到遇到終止密碼子。

3. 終止 (Termination)：

   • 當核醣體移動到 mRNA 上的終止密碼子（UAA, UAG, UGA）時，沒有 tRNA 能識別這些密碼子。
   • 釋放因子 (release factors, RFs) 識別終止密碼子，並結合到 A 位點。
   • 釋放因子促進水解反應，將已形成的胜肽鏈從 P 位點的 tRNA 上切下。
   • 核醣體亞基、mRNA 和釋放因子解離，完成蛋白質的合成。

原核生物與真核生物轉譯的四點差異：

| 特徵 | 原核生物轉譯 | 真核生物轉譯 |

此題探討 mRNA 在真核生物中喪失 5' 帽結構 (5' cap) 後，其性質和命運與有帽 mRNA 相比會發生哪些變化。

核心觀念：
在真核生物中，mRNA 的 5' 帽結構（一個 7-甲基鳥苷，m7G，透過 5'-5' 三磷酸鍵連接到 mRNA 的第一個核苷酸）對於 mRNA 的穩定性、轉運、以及核醣體結合和起始轉譯至關重要。喪失此結構會嚴重影響 mRNA 的功能。

喪失 5' 帽結構的 mRNA 的可能結果 (與有帽 mRNA 的差異)：

1. 降低的穩定性與快速降解：

   • 與有帽 mRNA 的差異： 有帽 mRNA 的 5' 帽結構能保護 mRNA 免受 5' 到 3' 外切核酸酶 (exonucleases) 的降解。帽結構本身可以被帽結合蛋白 (cap-binding proteins, CBP) 識別，這些蛋白質能進一步保護 mRNA。
   • 結果： 無帽 mRNA 會更容易被細胞內的 5' 到 3' 外切核酸酶識別並降解，導致其半衰期顯著縮短，在細胞內存在的時間大大減少。

2. 無法有效地結合核醣體，轉譯效率降低：

   • 與有帽 mRNA 的差異： 真核生物的起始因子 eIF4E 是 5' 帽結構的特異性結合蛋白。eIF4E 是 eIF4F 複合體 (包含 eIF4E, eIF4G, eIF4A) 的一部分。eIF4F 複合體負責招募 40S 核醣體亞基到 mRNA 的 5' 端，並開始掃描尋找起始密碼子。
   • 結果： 無帽 mRNA 無法有效地與 eIF4E 結合，因此無法形成起始複合物，轉譯起始效率會急劇下降，甚至完全無法進行轉譯。這意味著該 mRNA 無法被有效轉譯成蛋白質。

此題主要探討 2023 年諾貝爾生理學或醫學獎得主 Katalin Karikó 和 Drew Weissman 的貢獻，特別是他們關於核苷酸鹼基修飾的發現，以及這如何促成了有效的 mRNA 疫苗的開發。

核心觀念：
在 Karikó 和 Weissman 的研究之前，將體外合成的 mRNA 直接用於疫苗或治療存在一個重大障礙：外源性 mRNA 會引發強烈的免疫反應，導致細胞死亡和 mRNA 快速降解，使其無法有效發揮作用。他們的關鍵發現是，通過對 mRNA 中的特定核苷酸進行化學修飾，可以「欺騙」免疫系統，使其將外源性 mRNA 視為「自身」分子，從而避免免疫反應，並延長 mRNA 的穩定性，使其能夠有效地指導蛋白質合成。

Katalin Karikó 和 Drew Weissman 的發現：

1. 發現免疫原性問題： 他們首先認識到，體外合成的 mRNA (in vitro transcribed mRNA) 具有強烈的免疫原性。當細胞偵測到這種外源性 RNA 時，會激活先天免疫系統的模式識別受體 (Pattern Recognition Receptors, PRRs)，如 Toll-like receptors (TLRs) 3, 7, 8 和 RIG-I 樣受體 (RLRs)。這會觸發細胞因子的釋放，引起炎症反應，並導致 mRNA 被快速降解。

2. 核苷酸鹼基修飾的關鍵作用：

   • 發現： 他們發現，將 mRNA 中的某些標準核苷酸（腺苷 A, 鳥苷 G, 胞苷 C, 尿苷 U）替換為它們的修飾形式，可以顯著降低 mRNA 的免疫原性。
   • 具體修飾： 最關鍵的修飾是將尿苷 (U) 替換為 假尿苷 (pseudouridine, ψ)，以及將胞苷 (C) 替換為 N1-甲基偽尿苷 (N1-methylpseudouridine, m1ψ)。
   • 機制： 這些修飾的核苷酸能夠逃避或減弱細胞內 PRRs 的識別。例如，偽尿苷修飾的 mRNA 不再強烈激活 TLRs 和 RLRs，從而避免了強烈的免疫反應。

3. 提高 mRNA 的穩定性和轉譯效率：

   • 發現： 除了降低免疫原性，這些核苷酸修飾還能提高 mRNA 的穩定性和轉譯效率。
   • 機制：
     • 修飾後的核苷酸結構可能更穩定，不易被 RNA 酶降解。
     • 更重要的是，修飾後的 mRNA 能更有效地被細胞的轉譯機器識別和利用，從而指導產生更多的目標蛋白質。

如何引導至 mRNA 疫苗的開發：

此題要求列出 DNA 複製 (DNA replication) 和 RNA 轉錄 (RNA transcription) 之間的差異。這兩個過程都是核酸合成，但它們的目的、模板、產物、酶以及調控等方面都有顯著區別。

DNA 複製 (DNA Replication) vs. RNA 轉錄 (RNA Transcription) 的差異：

此題詢問遺傳密碼 (genetic code) 幾乎是普遍適用 (nearly universal) 所帶來的益處。

核心觀念：
遺傳密碼是指 DNA 或 RNA 中的核苷酸序列（以三聯體密碼子形式）與蛋白質中的胺基酸序列之間的對應關係。儘管在某些生物或細胞器（如粒線體）中存在一些例外，但絕大多數生物都使用同一套遺傳密碼來翻譯 mRNA。

遺傳密碼幾乎普遍適用的益處：

1. 促進跨物種基因轉殖與應用：

   • 說明： 這是最直接且最重要的益處。由於絕大多數生物共用同一套遺傳密碼，當我們將一個基因從一個物種轉殖到另一個物種（例如，將人類基因轉殖到細菌或酵母菌中進行研究或生產蛋白質）時，目標生物的核醣體能夠正確地識別外源 mRNA 的密碼子，並將其翻譯成正確的胺基酸序列。
   • 例子： 生產重組蛋白質（如胰島素、生長激素）的生物技術，就是建立在此基礎上。我們可以將人類的胰島素基因插入細菌中，細菌就能準確地合成人類胰島素。

2. 簡化生物學研究與比較：

   • 說明： 這使得研究人員能夠更容易地比較不同生物的基因序列和蛋白質序列，推斷它們的功能和演化關係。如果遺傳密碼差異很大，那麼比較基因組學和蛋白質組學將變得異常困難。
   • 例子： 研究人員可以通過比較不同物種的同源基因序列，了解它們的演化歷史和功能演變。

此題要求解釋「位點特異性重組 (site-specific recombination, SSR)」和「轉座 (transposition)」之間的主要區別。這兩種都是 DNA 重組過程，但它們的機制、產物和生物學意義有所不同。

核心觀念：

• 重組 (Recombination)： 指 DNA 分子之間斷裂和重新連接的過程，可以發生在同源序列之間（同源重組）或非同源序列之間。
• 位點特異性重組 (SSR)： 是一種特殊的重組形式，它發生在特定的 DNA 序列之間，並且需要特定的重組酶 (recombinase) 來催化。這些酶識別並作用於特定的「位點」。
• 轉座 (Transposition)： 是一種 DNA 片段（稱為轉座子, transposable elements, TEs 或「跳躍基因」）在基因組內或基因組之間移動的過程。轉座子本身攜帶進行轉座所需的序列和編碼的酶（轉座酶, transposase）。

SSR 與轉座之間的主要區別：

此題要求描述大腸桿菌 (E. coli) 中 SOS 響應系統的修復機制。SOS 響應是大腸桿菌在遭受嚴重 DNA 損傷時啟動的一種複雜的基因表達調控網絡，目的是啟動多種 DNA 修復和細胞週期調控通路，以應對損傷並嘗試維持細胞存活。

核心觀念：
SOS 響應是一種「過渡時期」的 DNA 修復系統 (translesion synthesis, TLS)，它能夠在 DNA 複製叉遇到難以修復的損傷時，允許 DNA 聚合酶繞過損傷位點繼續複製，從而防止複製叉停滯和細胞死亡。然而，這種繞過損傷的機制通常是「錯誤傾向性」的 (error-prone)，可能導致突變。SOS 響應也包含一些「錯誤保守性」的修復機制。

SOS 響應的機制：

SOS 響應的調控核心是一個稱為 LexA 的阻遏蛋白 (repressor) 和一個稱為 RecA 的蛋白質。

1. 正常情況下 (無 DNA 損傷)：

   • LexA 蛋白以二聚體 (dimer) 的形式存在，它結合在 SOS 響應相關基因（包括其自身基因 lexA）的啟動子區域，作為一個阻遏蛋白，抑制這些基因的轉錄。
   • RecA 蛋白以單體形式存在於細胞質中，其主要功能是參與同源重組。

2. DNA 損傷與 RecA 的活化：

   • 當細胞遭受嚴重的 DNA 損傷（如紫外線照射、化學誘變劑處理）時，DNA 複製叉會停滯，並產生單鏈 DNA (single-stranded DNA, ssDNA)。
   • RecA 單體會識別並結合到這些 ssDNA 上，形成一個 RecA-ssDNA 絲狀結構。
   • 這個 RecA-ssDNA 複合物具有一種特殊的「自切割活性」(autocatalytic cleavage activity)。

3. LexA 阻遏蛋白的自切割與 SOS 基因的誘導：

   • 活化的 RecA-ssDNA 複合物能夠誘導 LexA 阻遏蛋白發生構象變化，使其能夠進行自切割。
   • LexA 蛋白的自切割會破壞其結合 DNA 的能力，導致 LexA 阻遏蛋白解離，從而解除對 SOS 響應基因的抑制。
   • LexA 基因自身也受到 LexA 阻遏，因此 LexA 的自切割也會導致自身基因 lexA 的表達增加，形成一個正反饋環路，進一步增強 SOS 響應。

4. SOS 響應的下游效應與修復系統：

   • 一旦 LexA 阻遏解除，SOS 響應相關的基因開始大量轉錄和轉譯。這些基因編碼的蛋白質參與多種修復和調控功能，主要包括：

     a. LexA 阻遏蛋白的自切割： 如前所述，這是 SOS 響應啟動的關鍵。
     b. RecA 蛋白的過量表達： RecA 蛋白的過量合成增強了其在 DNA 修復（特別是同源重組）中的作用。
     c. DNA 修復酶的誘導：