108 年 國立中山大學海洋生物科技暨資源學系碩士班甲組《生物化學》

此為考試說明頁，無題目

本題主要考驗學生對於蛋白質純化常用之三種層析法的原理、功能與目的之理解。

蛋白質純化是生物化學與分子生物學實驗中極為重要的一環，目的是將目標蛋白質從複雜的混合物中分離出來，並達到足夠的純度以供後續研究或應用。親合性層析、離子交換層析和膠體過濾層析是三種最常用的蛋白質純化技術，它們的原理和應用各有側重。

1. 親合性層析 (Affinity Chromatography)

• 原理: 這種方法利用目標蛋白質與固定相（管柱中的配體）之間高度特異性的生物分子相互作用來進行分離。配體可以是抗體、酵素的受質、輔因子、核酸或其他能與目標蛋白質結合的分子。
• 功能: 能夠高度特異性地捕捉目標蛋白質，即使在複雜的樣品中也能達到很高的純度。
• 目的: 主要用於分離具有特定結合能力的蛋白質，例如從細胞裂解液中純化標記蛋白質（如 His-tag, GST-tag 融合蛋白）或特定抗體。
• 繪圖說明:
  • 在一個管柱中，固定相（基質）上連接了與目標蛋白質有親和力的配體。
  • 樣品（含有目標蛋白質及其他雜質）被加入管柱。
  • 目標蛋白質與固定相上的配體結合，而其他非結合的蛋白質則流過。
  • 洗滌緩衝液將非結合的雜質沖走。
  • 加入一種特殊的洗脫緩衝液（例如，改變 pH、離子強度，或加入競爭性配體）來打破目標蛋白質與配體之間的結合，從而將純化的目標蛋白質洗脫下來。

2. 離子交換層析 (Ion Exchange Chromatography, IEX)

• 原理: 這種方法利用蛋白質表面所帶電荷的差異來進行分離。管柱的固定相帶有固定的電荷（陽離子交換劑或陰離子交換劑），它能與樣品中帶相反電荷的蛋白質發生靜電吸附。
• 功能: 能夠根據蛋白質的總淨電荷進行分離。
• 目的: 用於分離帶電蛋白質，是蛋白質純化中非常常用且有效的方法。
• 繪圖說明:
  • 陽離子交換層析 (Cation Exchange): 管柱固定相帶負電。樣品中的陽離子蛋白質（pH 低於其 pI）會與固定相結合，陰離子蛋白質則流過。
  • 陰離子交換層析 (Anion Exchange): 管柱固定相帶正電。樣品中的陰離子蛋白質（pH 高於其 pI）會與固定相結合，陽離子蛋白質則流過。

本題考驗學生對常見胺基酸側鏈性質的分類及基本命名。

胺基酸是蛋白質的基本組成單位，其結構包含一個中心碳原子（α-碳），連接一個胺基、一個羧基、一個氫原子以及一個胺基酸側鏈（R基）。側鏈的結構和性質決定了胺基酸的獨特性，並影響蛋白質的整體結構和功能。根據側鏈的極性、電荷和大小，胺基酸可以被分為幾類。

1. 帶正電荷的胺基酸 (Positively Charged Amino Acids)
這些胺基酸的側鏈在生理 pH (約 7.4) 下帶有正電荷。這通常是因為側鏈上含有額外的胺基（鹼性胺基酸）。

• Lysine:
  • 英文全名: Lysine
  • 三個字母縮寫: Lys
  • 一個字母縮寫: K
  • 側鏈結構: 含有一個額外的 α-胺基。
• Arginine:
  • 英文全名: Arginine
  • 三個字母縮寫: Arg
  • 一個字母縮寫: R
  • 側鏈結構: 含有胍基 (guanidino group)，在生理 pH 下帶有正電荷。
• Histidine:
  • 英文全名: Histidine
  • 三個字母縮寫: His
  • 一個字母縮寫: H
  • 側鏈結構: 含有咪唑環 (imidazole ring)。其 pKa 約在 6.0，在生理 pH 下部分帶正電荷，部分不帶電，使其成為一個重要的緩衝分子，尤其在蛋白質的活性中心。

2. 帶負電荷的胺基酸 (Negatively Charged Amino Acids)
這些胺基酸的側鏈在生理 pH 下帶有負電荷。這通常是因為側鏈上含有羧基（酸性胺基酸）。

• Aspartic Acid:
  • 英文全名: Aspartic Acid
  • 三個字母縮寫: Asp
  • 一個字母縮寫: D
  • 側鏈結構: 含有一個額外的羧基。
• Glutamic Acid:
  • 英文全名: Glutamic Acid
  • 三個字母縮寫: Glu
  • 一個字母縮寫: E
  • 側鏈結構: 含有一個額外的羧基。

3. 不帶電但具極性的胺基酸 (Uncharged Polar Amino Acids)
這些胺基酸的側鏈含有極性基團（如羥基、醯胺基），但這些基團在生理 pH 下不帶淨電荷。

• Serine:
  • 英文全名: Serine
  • 三個字母縮寫: Ser
  • 一個字母縮寫: S
  • 側鏈結構: 含有一個羥基 (-OH)。
• Threonine:
  • 英文全名: Threonine
  • 三個字母縮寫: Thr
  • 一個字母縮寫: T
  • 側鏈結構: 含有一個羥基 (-OH)。
• Asparagine:
  • 英文全名: Asparagine
  • 三個字母縮寫: Asn
  • 一個字母縮寫: N
  • 側鏈結構: 含有一個醯胺基 (-CONH2)。
• Glutamine:
  • 英文全名: Glutamine
  • 三個字母縮寫: Gln
  • 一個字母縮寫: Q
  • 側鏈結構: 含有一個醯胺基 (-CONH2)。
• Tyrosine:
  • 英文全名: Tyrosine
  • 三個字母縮寫: Tyr
  • 一個字母縮寫: Y
  • 側鏈結構: 含有一個酚羥基 (-OH)。

本題考驗學生對抗體 (Antibody, Immunoglobulin) 基本結構的理解與辨識能力。

抗體是免疫系統產生的一種蛋白質，主要功能是識別並結合外來抗原，進而啟動清除機制。抗體具有高度的特異性，其結構是決定其功能的關鍵。

抗體基本結構:
典型的抗體分子（如 IgG）由四條胜肽鏈組成，其中有兩條較長的「重鏈」(heavy chain, H) 和兩條較短的「輕鏈」(light chain, L)。這些鏈藉由二硫鍵 (disulfide bonds) 連接，形成一個 Y 形結構。

• 重鏈 (Heavy Chain): 每條重鏈約有 440-550 個胺基酸殘基，包含一個變異區 (Variable region, V) 和數個恆定區 (Constant region, C)。
• 輕鏈 (Light Chain): 每條輕鏈約有 220 個胺基酸殘基，包含一個變異區 (V) 和一個恆定區 (C)。
• 二硫鍵: 連接兩條重鏈之間，以及一條重鏈與一條輕鏈之間。

抗體的區域:

1. 變異區 (Variable Region, V):

   • 位於抗體的 Y 形分支頂端。
   • 每條重鏈和每條輕鏈各有一個變異區。
   • 這兩個變異區共同組成抗原結合位點 (Antigen-binding site)。
   • 變異區的胺基酸序列差異很大，這是抗體能夠識別多樣化抗原的基礎。
   • 互補決定區 (Complementarity-Determining Region, CDR): 變異區內有三個高度變異的區域，稱為 CDR。CDR 序列的變化最大，直接決定了抗體與抗原結合的特異性。輕鏈變異區有 3 個 CDR，重鏈變異區也有 3 個 CDR。這 6 個 CDR 共同構成了抗原結合位點。
   • 框架區 (Framework Region, FR): 變異區中除了 CDR 之外的部分，其序列相對保守，提供 CDR 的結構支架。

2. 恆定區 (Constant Region, C):

   • 位於抗體的 Y 形分支下方和柄部。
   • 重鏈有多個恆定區 (CH1, CH2, CH3...)，輕鏈有一個恆定區 (CL)。
   • 恆定區的結構相對保守，其功能與抗體的效應功能 (effector functions) 有關，例如啟動補體系統、與細胞表面受體結合等。

繪圖說明:

在 Y 形結構圖中，需要標示出：

本題考驗學生對抗體藥物複合體 (Antibody-Drug Conjugates, ADCs) 的基本概念與作用機制的理解。

Antibody-Drug Conjugates (ADCs) 是一種創新的治療藥物，結合了單株抗體 (monoclonal antibody) 的靶向能力與細胞毒性藥物 (cytotoxic drug) 的殺傷力，旨在提高癌症治療的療效並減少副作用。

組成:
一個 ADC 主要由三個部分組成：

1. 單株抗體 (Monoclonal Antibody, mAb): 這是 ADC 的靶向部分。抗體被設計成能夠特異性地識別並結合在癌細胞表面過度表達的特定抗原（腫瘤相關抗原, tumor-associated antigen, TAA）。
2. 細胞毒性藥物 (Cytotoxic Drug): 這是一種類似化療藥物的強效藥物，能夠殺死癌細胞。通常選擇的是對正常細胞毒性較小，但對癌細胞殺傷力極強的藥物。
3. 連接子 (Linker): 這是連接抗體和細胞毒性藥物的化學分子。連接子的設計非常關鍵，它需要足夠穩定，能夠在血液循環中將藥物保持在抗體上，避免藥物過早釋放而傷害正常組織；同時，在 ADC 進入癌細胞後，連接子又需要能夠被有效地裂解，釋放出細胞毒性藥物。連接子可以分為可裂解型 (cleavable linker) 和不可裂解型 (non-cleavable linker)。

本題考驗學生對單株抗體 (Monoclonal Antibodies, mAbs) 製備基本流程的理解。

單株抗體是指針對單一抗原表位 (epitope) 所產生的，具有高度特異性的抗體。其製備過程是生物製藥領域的重要技術。最經典且廣泛使用的製備方法是雜交瘤技術 (Hybridoma Technology)。

雜交瘤技術製備單株抗體的基本步驟:

1. 免疫動物 (Immunization):

   • 選擇實驗動物（通常是小鼠）。
   • 將目標抗原（純化的或含有目標表位的）注射入小鼠體內，以誘導其產生免疫反應，產生能識別該抗原的 B 細胞。
   • 重複注射幾次（稱為加強免疫），以提高抗體滴度。

2. 分離 B 細胞 (Isolation of B cells):

   • 當動物產生足夠高的抗體滴度後，將動物犧牲，並從其脾臟 (spleen) 中分離出產生抗體的 B 細胞（漿細胞, plasma cells）。B 細胞具有產生特定抗體的能力。

3. 製備骨髓瘤細胞 (Preparation of Myeloma Cells):

   • 從另一隻小鼠中獲取骨髓瘤細胞 (myeloma cells)，這些是癌化的 B 細胞，具有無限增殖的能力。
   • 選擇一種特殊的骨髓瘤細胞株，這種細胞株通常缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶 (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HGPRT)，無法在 HAT 培養基 (Hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) 中存活。HGPRT 是嘌呤合成途徑中的一個關鍵酶。

4. 細胞融合 (Cell Fusion):

   • 將分離出的 B 細胞與骨髓瘤細胞在 PEG (Polyethylene glycol) 的作用下進行融合。PEG 是一種細胞膜融合劑，能促進兩種不同細胞的細胞膜融合，形成一個雜合細胞（雜交瘤, hybridoma）。
   • 融合過程會產生三種類型的細胞：未融合的 B 細胞、未融合的骨髓瘤細胞，以及融合後的雜交瘤細胞。

本題考驗學生對酵素動力學基本概念、Michaelis-Menten 方程式、參數 Km 和 Vmax 的理解，以及不同類型抑制劑對酵素活性的影響。

Michaelis-Menten 動力學:
酵素催化的反應通常可以簡化為以下模型：
$E + S \rightleftharpoons ES \rightarrow E + P$
其中 E 為酵素，S 為基質，ES 為酵素-基質複合物，P 為產物。

Michaelis-Menten 方程式:
描述酵素反應速率 ($v$) 與基質濃度 ([S]) 之間的關係，假設酵素總濃度 ($[E]_T$) 是恆定的。
$v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]}$
其中：

• $v$ 是酵素的反應速率 (initial velocity)。
• $V_{max}$ 是酵素的最大反應速率，當所有酵素都被基質飽和時達到。
• $K_m$ (Michaelis constant) 是達到 $V_{max}$ 一半所需基質濃度。它反映了酵素對基質的親和力：$K_m$ 越小，表示酵素對基質的親和力越高。
• $[S]$ 是基質濃度。

Michaelis-Menten 曲線圖解說明:

• 圖形: 繪製一個曲線圖，橫軸為基質濃度 [S]，縱軸為反應速率 v。
• 曲線形狀: 曲線呈現一個「S」形，但隨著 [S] 增加，v 會逐漸趨近於一個最大值。
• Vmax: 曲線會漸近於一條水平線，這條水平線的縱座標值就是 $V_{max}$。
• Km: 當反應速率 $v = \frac{1}{2}V_{max}$ 時，在曲線上找到對應的基質濃度 [S]，這個濃度值就是 $K_m$。
• [S] 的影響:
  • 當 $[S] \ll K_m$ 時，分母中的 $[S]$ 可以忽略，則 $v \approx \frac{V_{max}}{K_m}[S]$。此時反應速率近似於基質濃度的線性函數，反應速率主要由基質濃度決定。
  • 當 $[S] = K_m$ 時，則 $v = \frac{V_{max}[S]}{[S] + [S]} = \frac{V_{max}[S]}{2[S]} = \frac{1}{2}V_{max}$。
  • 當 $[S] \gg K_m$ 時，分母中的 $K_m$ 可以忽略，則 $v \approx \frac{V_{max}[S]}{[S]} = V_{max}$。此時反應速率趨近於最大值，受基質濃度影響很小，酵素已接近飽和。

酵素抑制 (Enzyme Inhibition):
抑制劑是能降低酵素活性的分子。

1. 競爭性抑制 (Competitive Inhibition)

• 原理: 競爭性抑制劑的結構與基質相似，能夠與基質競爭結合到酵素的活性位點 (active site)。
• 影響:
  • Km: 增加。因為需要更高的基質濃度才能與抑制劑競爭結合，達到原來一半最大速率所需的基質濃度增加。
  • Vmax: 不變。如果基質濃度足夠高，可以完全克服抑制劑的影響，使基質飽和酵素，達到原來的 $V_{max}$。
• 圖解說明:
  • 在 Michaelis-Menten 曲線圖中，競爭性抑制劑存在時，曲線會向右上方移動，即達到相同速率所需的 [S] 增加，但最終趨近的 $V_{max}$ 不變。

本題考驗學生對細菌基因調控機制，特別是大腸桿菌 (E. coli) lac 操縱子的理解，以及葡萄糖 (glucose) 和環腺苷酸 (cAMP) 如何調節此操縱子的表達。

lac operon (乳糖操縱子):
lac 操縱子是細菌（如大腸桿菌）中一個重要的基因調控單元，負責代謝乳糖 (lactose)。它包含三個結構基因 (structural genes) 和一個調控區。

• 結構基因:

  • lacZ: 編碼 β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，負責將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。
  • lacY: 編碼乳糖滲透酶 (lactose permease)，負責將乳糖運輸到細胞內。
  • lacA: 編碼硫代半乳糖苷酶 (thiogalactoside transacetylase)，其功能在代謝乳糖方面尚不明確，但可能與解毒有關。

• 調控區:

  • 啟動子 (Promoter, P): RNA 聚合酶結合的位點，啟動基因轉錄。
  • 操縱子 (Operator, O): 阻遏蛋白 (repressor protein) 結合的位點。
  • 調控基因 (Regulatory gene): 位於操縱子結構之外，編碼阻遏蛋白。這個基因稱為 lacI。

lac 操縱子的調控機制:

lac 操縱子的表達受兩種機制調控：誘導 (induction) 和貓醛效應 (catabolite repression)。

A. 誘導 (Induction) - 乳糖的存在與否:

• 無乳糖時: lacI 基因產生的阻遏蛋白 (repressor protein) 會結合到操縱子 (Operator, O) 位點上。這會阻礙 RNA 聚合酶接近啟動子並進行轉錄，因此 lacZ, lacY, lacA 基因的表達量非常低。
• 有乳糖時: 當乳糖存在於細胞外時，它會被少量產生的 lacY 蛋白質運入細胞。在細胞內，乳糖（或其異構體，如異乳糖苷, allolactose）會作為誘導物 (inducer)，與阻遏蛋白結合。這種結合會改變阻遏蛋白的構象，使其從操縱子位點上脫離。一旦阻遏蛋白脫離，RNA 聚合酶就可以結合到啟動子，順利進行 lac 操縱子的轉錄，產生 β-半乳糖苷酶、乳糖滲透酶和硫代半乳糖苷酶，使細菌能夠代謝乳糖。

B. 貓醛效應 (Catabolite Repression) - 葡萄糖與 cAMP 的關係:

• 葡萄糖是首選能源: 細菌傾向於優先利用葡萄糖作為能源，因為葡萄糖的代謝途徑更直接、更有效率。
• cAMP 的作用: 當細胞內葡萄糖濃度高時，cAMP (cyclic AMP) 的濃度很低。cAMP 是一種第二信使。
• CAP 蛋白: cAMP 會與一種稱為 Catabolite Activator Protein (CAP，也稱為 CRP, cAMP Receptor Protein) 的蛋白質結合。
• CAP-cAMP 複合物: 當 cAMP 與 CAP 結合後，形成的 CAP-cAMP 複合物能夠結合到 lac 操縱子啟動子區域附近的一個特定位點。
• 調節作用: