109 年 國立中山大學海洋生物科技暨資源學系碩士班甲組《生物化學》

本題主要在考驗學生對酵素動力學中 Michaelis-Menten 模型及其參數的理解。Michaelis-Menten 模型是描述酵素反應速率與基質濃度之間關係的基礎模型。

Michaelis-Menten 模型描述了酵素 (E) 與基質 (S) 結合形成複合物 (ES)，進而生成產物 (P) 的過程：
$E + S \rightleftharpoons ES \rightarrow E + P$

其中，$k_1$ 是 E 與 S 結合的速率常數，$k_{-1}$ 是 ES 解離回 E 與 S 的速率常數，$k_{cat}$ (或 $k_2$) 是 ES 轉化為 P 的催化速率常數。

Michaelis-Menten 方程式為：
$v_0 = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]}$

其中：

• $v_0$ 是初始反應速率 (initial reaction velocity)。
• $[S]$ 是基質濃度 (substrate concentration)。
• $V_{max}$ 是當酵素飽和時的最高反應速率 (maximum reaction velocity)。
• $K_m$ 是 Michaelis 恆數 (Michaelis constant)，定義為當反應速率為 $V_{max}$ 的一半 ($v_0 = V_{max}/2$) 時的基質濃度。

參數詮釋：

1. $V_{max}$ (最大反應速率):

   • $V_{max}$ 代表酵素在達到飽和狀態時，所有酵素分子都與基質結合並進行催化反應所能達到的最高反應速率。
   • 它與酵素總濃度 $[E]_{total}$ 成正比 ($V_{max} = k_{cat}[E]_{total}$)，反映了酵素的總催化能力。
   • 當基質濃度 $[S]$ 遠大於 $K_m$ ($[S] \gg K_m$) 時，反應速率趨近於 $V_{max}$。

2. $K_m$ (Michaelis 恆數):

   • $K_m$ 是酵素與特定基質結合的親和力 (affinity) 的指標。
   • $K_m$ 的值越低，表示在較低的基質濃度下就能達到 $V_{max}/2$，說明酵素對該基質的親和力越高。
   • $K_m$ 的值越高，表示需要較高的基質濃度才能達到 $V_{max}/2$，說明酵素對該基質的親和力越低。

本題考查學生對轉錄後修飾 (Post-transcriptional modification) 和轉譯後修飾 (Post-translational modification) 的基本概念、目的與具體例子。這兩者都是基因表現調控的重要環節，發生在蛋白質合成的不同階段。

一、Post-transcriptional modification (轉錄後修飾)

• 定義： 指的是在 RNA 分子從 DNA 模板轉錄下來之後，到它被用於轉譯之前，所發生的一系列化學或結構上的改變。這些修飾主要發生在真核生物的 mRNA 前驅體 (pre-mRNA)。
• 目的： 提高 mRNA 的穩定性，促進其從細胞核運輸到細胞質，以及確保其能被正確地識別並轉譯成蛋白質。
• 主要修飾方式與例子：

  1. 5' 端加帽 (5' Capping):

     • 過程： 在 mRNA 分子的 5' 端加上一個特殊的結構，通常是 7-甲基鳥苷酸 (7-methylguanosine, m7G)，透過一個 5'-5' 三磷酸鍵連接。
     • 功能：
       • 保護 mRNA 免受 5' 外切核酸酶 (exonucleases) 的降解，增加 mRNA 的穩定性。
       • 識別並結合核糖體 (ribosome) 的小次單元，啟動轉譯。
       • 協助 mRNA 從細胞核運輸到細胞質。
     • 例子： 大部分真核生物的 mRNA 在轉錄完成後都會進行 5' 端加帽。

  2. 3' 端加尾 (3' Polyadenylation):

     • 過程： 在 mRNA 分子的 3' 端，透過聚腺苷酸聚合酶 (poly(A) polymerase) 添加一連串腺苷酸 (adenosine monophosphate, AMP) 單元，形成一個聚 A 尾 (poly-A tail)，長度可達數十到數百個 A。
     • 功能：
       • 增加 mRNA 的穩定性，保護其免受 3' 外切核酸酶的降解 (poly-A 尾會逐漸縮短，當縮短到一定程度時，mRNA 會被降解)。
       • 協助 mRNA 從細胞核運輸到細胞質。
       • 參與核糖體與 mRNA 的結合，促進轉譯效率。
     • 例子： 人類大多數的 mRNA 都帶有 poly-A 尾。

  3. 剪接 (Splicing):

     • 過程： 真核生物的基因通常包含編碼區 (exons) 和非編碼區 (introns)。剪接作用會移除 introns，並將 exons 連接起來，形成成熟的 mRNA。這個過程由剪接體 (spliceosome) 完成。
     • 功能：
       • 移除無用的非編碼區。
       • 允許「選擇性剪接」(alternative splicing)，即同一段 pre-mRNA 可以透過不同的剪接方式產生多種不同的成熟 mRNA，進而合成多種蛋白質。這大大增加了基因表現的多樣性。
     • 例子： 例如，人類的肌動蛋白基因 (actin gene) 就可以透過選擇性剪接產生不同形式的肌動蛋白。

二、Post-translational modification (轉譯後修飾)

• 定義： 指的是蛋白質在核糖體上合成完成（轉譯）之後，所發生的一系列化學或結構上的改變。這些修飾可以發生在細胞質、內質網、高爾基體等不同胞器中。
• 目的： 影響蛋白質的摺疊、穩定性、活性、亞細胞定位、與其他分子的交互作用，以及調節其降解速率，從而實現蛋白質功能的精細調控。
• 主要修飾方式與例子：
  1. 磷酸化 (Phosphorylation):

本題考驗學生對 Yeast Two-Hybrid (Y2H) 系統原理、組件和實驗流程的理解與繪圖能力。Y2H 是一個在酵母菌中用於偵測蛋白質-蛋白質交互作用 (protein-protein interaction, PPI) 的體外實驗技術。

Yeast Two-Hybrid 系統原理與組件：

Y2H 系統基於一個概念：將一個具有轉錄活性的蛋白質（如酵母菌的 GAL4 轉錄因子）分成兩個功能區域：

1. DNA 結合域 (DNA-Binding Domain, DBD): 負責識別並結合到目標基因的啟動子區域 (promoter) 上特定的 DNA 序列 (如 UAS, Upstream Activating Sequence)。
2. 轉錄激活域 (Activation Domain, AD): 負責招募 RNA 聚合酶 II 和其他轉錄輔助因子，啟動目標基因的轉錄。

在 Y2H 系統中，這兩個功能域被分開，並分別與待測的兩個蛋白質片段連接，形成「雙雜合」結構。

• 誘餌蛋白質 (Bait protein): 通常是已知或猜測會與目標蛋白質結合的蛋白質。它被連接到 DBD 上，形成一個「Bait-DBD」融合蛋白。
• 獵物蛋白質 (Prey protein): 通常是猜測會與誘餌蛋白質結合的蛋白質。它被連接到 AD 上，形成一個「Prey-AD」融合蛋白。

實驗流程與繪圖說明：

Y2H 實驗的目標是偵測「Bait」和「Prey」蛋白質之間是否存在交互作用。如果 Bait 和 Prey 之間確實存在交互作用，它們會將 Bait-DBD 和 Prey-AD 兩個融合蛋白拉近，使得 DBD 和 AD 能夠重新組合成一個具有完整功能的轉錄因子。這個重組的轉錄因子隨後會結合到一個報告基因 (reporter gene) 的啟動子區域，從而啟動報告基因的表達。

繪圖要素：

1. 酵母菌細胞 (Yeast cell): 作為實驗的宿主。
2. 質體 (Plasmids): 至少需要兩個質體，一個用於表達 Bait-DBD 融合蛋白，另一個用於表達 Prey-AD 融合蛋白。
3. Bait-DBD 融合蛋白： 繪製 DNA 結合域 (DBD) 與 Bait 蛋白質的連接。
4. Prey-AD 融合蛋白： 繪製轉錄激活域 (AD) 與 Prey 蛋白質的連接。
5. 報告基因 (Reporter gene): 一個對轉錄激活敏感的基因，其啟動子區域包含 DBD 結合位點 (UAS)。常見的報告基因有 HIS3 (組胺酸合成酶基因，用於篩選缺乏組胺酸的培養基上生長)、ADE2 (腺嘌呤合成酶基因，用於篩選缺乏腺嘌呤的培養基上生長) 或 LacZ (β-半乳糖苷酶基因，用於藍白斑篩選)。
6. DNA 模板： 包含報告基因及其啟動子。

實驗情境繪製：

• 情況一：Bait 和 Prey 不交互作用 (Negative Control / No Interaction)
  • Bait-DBD 融合蛋白在細胞內。
  • Prey-AD 融合蛋白在細胞內。
  • 由於 Bait 和 Prey 不結合，DBD 和 AD 處於分離狀態，無法形成完整的轉錄因子。
  • 報告基因的啟動子沒有被激活，報告基因不表達。
  • 在 HIS3 或 ADE2 報告基因系統中，酵母菌無法在缺乏 HIS 或 ADE 的培養基上生長。

本題主要考查學生對酵素動力學中催化常數 ($k_{cat}$) 的理解，以及催化效率 ($k_{cat}/K_m$) 與擴散速率限制之間的關係。

一、$k_{cat}$ (催化常數) 的意義

$k_{cat}$，也稱為轉化數 (turnover number)，是酵素動力學中的一個重要參數。它的意義如下：

• 定義： $k_{cat}$ 是指在基質飽和條件下 (即 $[S] \gg K_m$)，每單位時間內一個酵素分子所能轉化的基質分子數量。
• 公式： $k_{cat} = \frac{V_{max}}{[E]_{total}}$
  其中，$V_{max}$ 是最大反應速率，$[E]_{total}$ 是酵素的總濃度。
• 作用：
  • 它代表了酵素催化反應的最大效率或極限速率。
  • $k_{cat}$ 的值越高，表明該酵素在基質飽和時的催化速率越快，效率越高。
  • 它反映了從 ES 複合物形成產物 P 的步驟 ($ES \rightarrow E + P$) 的速率，是催化步驟的速率常數。

二、$k_{cat}/K_m$ (催化效率) 與 diffusion limit 之間的關係

$k_{cat}/K_m$ 是一個綜合性參數，它被稱為催化效率 (catalytic efficiency) 或特異性常數 (specificity constant)。它是在非飽和基質濃度下，酵素催化能力的一個指標。

• 定義： $k_{cat}/K_m$ 是指在基質濃度遠低於 $K_m$ ($[S] \ll K_m$) 時，酵素的反應速率 $v_0$ 與基質濃度 $[S]$ 的比值，即 $v_0 \approx (\frac{k_{cat}}{K_m})[S]$。
• 意義：
  • $k_{cat}/K_m$ 的值越高，表示酵素在低基質濃度下催化效率越高，也意味著酵素對該基質的催化特異性越強。
  • 它同時考慮了酵素的結合親和力 ($K_m$ 的倒數，1/$K_m$) 和催化速率 ($k_{cat}$)。低 $K_m$ (高親和力) 和高 $k_{cat}$ (高催化速率) 都有助於提高 $k_{cat}/K_m$ 的值。

與 diffusion limit 的關係：

本題主要考查學生對蛋白質二級結構中，coiled-coil 結構的理解，包括其形成機制、結構特點以及疏水性胺基酸在其中的排列方式，並要求繪圖說明。

Coiled-Coil 結構的形成與特點：

Coiled-coil 結構是指兩條或多條 α-螺旋 (alpha-helix) 相互纏繞，形成一個更為穩定、粗壯的超螺旋結構。這種結構在許多蛋白質中都很常見，例如肌球蛋白 (myosin)、角蛋白 (keratin) 和許多轉錄因子。

形成機制：

1. α-螺旋的形成： 首先，蛋白質鏈通過氫鍵在肽骨架之間形成穩定的 α-螺旋。
2. 螺旋的纏繞： 兩條或多條 α-螺旋在空間上相互平行或反平行排列，並沿著一個共同的軸向相互纏繞。這種纏繞通常是右手螺旋狀的。
3. 疏水性交互作用： Coiled-coil 結構的穩定性很大程度上依賴於螺旋之間疏水性胺基酸殘基的堆積。

疏水性胺基酸的排列方式：

Coiled-coil 結構的關鍵在於其特殊的胺基酸序列排列，這種排列有利於疏水性殘基的相互作用，從而穩定整個結構。

• Heptad Repeat (七肽重複序列): Coiled-coil 結構通常具有「七肽重複序列」(heptad repeat)，即每隔七個胺基酸就會出現一組相似的胺基酸。這個七肽序列可以表示為 abcdefg。
• 疏水性核心 (Hydrophobic Core): 在這個 abcdefg 的序列中：
  • a 位置和 d 位置 通常是高度保守的疏水性胺基酸 (如丙胺酸 Ala, 纈胺酸 Val, 異白胺酸 Ile, 白胺酸 Leu, 甲硫胺酸 Met, 苯丙胺酸 Phe, 色胺酸 Trp, 酪胺酸 Tyr)。
  • 這兩個位置的疏水性殘基會朝向螺旋的內部，形成一個疏水性核心，將兩條纏繞的 α-螺旋緊密地結合在一起。
  • 想像一下，當兩條螺旋纏繞時，a 位置的殘基會與另一條螺旋的 d 位置殘基相互接觸，反之亦然。
• 其他位置的胺基酸：
  • e 和 g 位置 常常是極性胺基酸，可以參與形成界面氫鍵，進一步穩定結構。
  • b, c, f 位置 則可以是多樣化的胺基酸，提供結構的靈活性或參與其他交互作用。

繪圖說明：

繪圖應展示以下幾個關鍵點：

本題考查學生對蛋白質純化中三種常用層析技術的理解，包括它們的原理、分離機制、應用目的以及各自的優缺點。需要繪圖說明，因此重點在於清晰地展示每種技術的分離過程。

蛋白質純化技術的共同目的：

在開始討論個別技術前，需了解蛋白質純化的總體目標：

• 分離目標蛋白質： 從複雜的蛋白質混合物中分離出特定的目標蛋白質。
• 提高純度： 去除其他雜質蛋白質、核酸、脂質等，以獲得高純度的目標蛋白質。
• 保持活性： 在純化過程中盡可能保持目標蛋白質的天然結構和生物活性。

三種層析法的原理、功能與繪圖說明：

1. 親合性管柱層析法 (Affinity Chromatography, AC)

• 原理： 利用目標蛋白質與固定相（介質上的配體，ligand）之間的高度特異性結合。
• 固定相： 載體（如瓊脂糖、聚丙烯醯胺）上共價連接有能與目標蛋白質特異性結合的分子，稱為配體。配體可以是抗體、抗原、酵素的基質或抑制劑、金屬離子（用於 His-tag 蛋白質）、或特異性結合的分子。
• 分離機制：
  • 結合 (Binding): 將蛋白質混合物通過填充有配體的管柱。目標蛋白質會與固定相上的配體發生特異性結合，而其他非結合的蛋白質則隨流動相流出管柱。
  • 洗脫 (Elution): 當所有非結合的雜質蛋白質被洗出後，通過改變流動相的條件（如加入競爭性配體、改變 pH 值、改變離子強度等），打破目標蛋白質與配體之間的結合，使目標蛋白質被洗脫下來。
• 目的： 進行高度特異性的蛋白質純化，通常能獲得非常純的蛋白質，即使目標蛋白質在混合物中含量很低。
• 繪圖說明：
  • 管柱： 繪製一個填充有介質的管柱。介質上標示有「配體」(Ligand)。
  • 步驟一 (上樣與結合): 繪製蛋白質混合物 (多種不同形狀的圓圈，其中一個標示為「目標蛋白質」Target Protein) 加入管柱。標示出目標蛋白質與配體結合，其他雜質蛋白質 (Impurity) 隨流動相 (Buffer 1) 流出。
  • 步驟二 (洗脫): 繪製加入洗脫緩衝液 (Buffer 2, e.g., high salt, competitor) 後，目標蛋白質從配體上解離，隨流動相 (Buffer 2) 流出管柱，收集純化的蛋白質。

2. 離子交換樹脂層析法 (Ion Exchange Chromatography, IEC)

• 原理： 利用蛋白質表面電荷的差異進行分離。蛋白質的總電荷取決於其等電點 (pI) 和緩衝液的 pH 值。
• 固定相： 載體上帶有可交換的離子基團。
  • 陽離子交換樹脂 (Cation exchanger): 帶負電荷的基團 (如 -SO3-, -COO-), 能吸附帶正電荷的蛋白質 (陽離子)。
  • 陰離子交換樹脂 (Anion exchanger): 帶正電荷的基團 (如 -N+(CH3)3), 能吸附帶負電荷的蛋白質 (陰離子)。
• 分離機制：
  • 結合： 在特定 pH 值下，蛋白質與固定相上的帶相反電荷的基團發生靜電吸附。例如，若緩衝液 pH > 蛋白質的 pI，蛋白質帶負電，可被陰離子交換樹脂吸附。
  • 洗脫： 通過增加流動相的離子強度（加入高濃度的鹽，如 NaCl）或改變 pH 值，來競爭性地取代蛋白質與固定相之間的靜電作用，從而將蛋白質洗脫下來。離子強度越高，洗脫越容易。不同蛋白質由於其表面電荷分佈和總電荷量的不同，會在不同的離子強度下被洗脫。
• 目的： 根據蛋白質的淨電荷差異進行分離，是一種有效且常用的純化方法。
• 繪圖說明：
  • 管柱： 繪製一個填充有離子交換介質的管柱。介質上標示帶電基團 (如陰離子交換樹脂帶 +)。
  • 步驟一 (上樣與結合): 繪製蛋白質混合物加入管柱。假設在 pH > pI 的條件下，目標蛋白質帶負電 (標示為 Target Protein -)，並吸附在陰離子交換樹脂上。雜質蛋白質可能帶負電但電荷較弱，或帶正電，隨流動相 (Buffer 1) 流出。
  • 步驟二 (洗脫): 繪製加入高鹽濃度的洗脫緩衝液 (Buffer 2, e.g., high salt gradient) 後，目標蛋白質被鹽離子競爭性取代，從樹脂上解離，隨流動相 (Buffer 2) 流出管柱，收集純化的蛋白質。可以示意性地畫出不同蛋白質在不同鹽濃度下被洗脫的圖。

本題考查學生對真核細胞粒線體呼吸電子傳遞鏈 (ETC) 的組成、功能以及 ATP 合成機制的理解。

一、粒線體電子傳遞鏈 (ETC) 參與電子傳遞的細胞膜蛋白 (舉例)

粒線體內膜 (inner mitochondrial membrane) 上的電子傳遞鏈由一系列蛋白質複合物和移動載體組成，它們協同工作，將電子從還原型輔酶 (NADH 和 FADH2) 傳遞到最終電子受體氧氣 (O2)，並在這個過程中釋放能量。

參與電子傳遞的主要蛋白質複合物有四個，加上兩個移動載體：

1. 複合物 I (NADH 脫氫酶, NADH dehydrogenase):

   • 功能： 接收來自 NADH 的電子，將其傳遞給移動載體泛醌 (ubiquinone, Q)。
   • 位置： 鑲嵌於粒線體內膜。
   • 能量釋放： 在此過程中，複合物 I 也能將質子 (H+) 從粒線體基質 (matrix) 泵入粒線體膜間隙 (intermembrane space)。

2. 複合物 II (琥珀酸脫氫酶, Succinate dehydrogenase):

   • 功能： 接收來自琥珀酸 (succinate) 的電子（在克氏循環中產生 FADH2 後，該複合物將電子直接傳遞給泛醌），將其傳遞給泛醌 (Q)。
   • 位置： 鑲嵌於粒線體內膜，同時也是克氏循環的一部分。
   • 能量釋放： 複合物 II 不將質子泵入膜間隙，因此它對質子梯度貢獻較小。

3. 移動載體：泛醌 (Ubiquinone, Q)

   • 功能： 脂溶性小分子，能在內膜中自由移動，接收來自複合物 I 和 II 的電子，並將電子傳遞給複合物 III。

4. 複合物 III (細胞色素 bc1 複合物, Cytochrome bc1 complex):

   • 功能： 接收來自泛醌 (QH2) 的電子，將其傳遞給移動載體細胞色素 c (cytochrome c)。
   • 位置： 鑲嵌於粒線體內膜。
   • 能量釋放： 在此過程中，複合物 III 將質子 (H+) 從粒線體基質泵入膜間隙。

5. 移動載體：細胞色素 c (Cytochrome c, Cyt c)

   • 功能： 攜帶電子的可溶性蛋白質，位於粒線體膜間隙，接收來自複合物 III 的電子，並將其傳遞給複合物 IV。

6. 複合物 IV (細胞色素 c 氧化酶, Cytochrome c oxidase):

   • 功能： 接收來自細胞色素 c 的電子，並將電子傳遞給最終電子受體氧氣 (O2)，將其還原為水 (H2O)。
   • 位置： 鑲嵌於粒線體內膜。
   • 能量釋放： 在此過程中，複合物 IV 也將質子 (H+) 從粒線體基質泵入膜間隙。

舉例：
從上述列表中，可以列舉任何兩個參與電子傳遞的蛋白質複合物或移動載體。例如：

• 複合物 I (NADH 脫氫酶)
• 複合物 III (細胞色素 bc1 複合物)