111 年 國立臺灣大學植物科學系碩士班《細胞生物學（B）》

本題為名詞解釋題，主要在測驗考生對細胞生物學與分子生物學核心概念的理解。

(1) Retrotransposon:
Retrotransposons are a type of transposable element (TE) that replicate via an RNA intermediate. They are also known as "jumping genes" or "copy-and-paste" transposons because they move within the genome by being transcribed into RNA, and then reverse transcribed back into DNA, which is then inserted into a new location. This process requires enzymes like reverse transcriptase and integrase. Retrotransposons are abundant in eukaryotic genomes and can contribute to genome evolution and diversity. They are broadly classified into two main types: LTR (long terminal repeat) retrotransposons and non-LTR retrotransposons (including LINEs and SINEs).

【答案】Retrotransposon 是一種透過 RNA 中介複製的轉位子 (transposable element, TE)，又稱為「跳躍基因」或「複製貼上」轉位子。它們在基因體內移動的機制是先轉錄成 RNA，然後透過反轉錄酶 (reverse transcriptase) 反轉錄回 DNA，再將此 DNA 插入基因體的新位置。此過程需要反轉錄酶和整合酶 (integrase) 等酵素。Retrotransposons 在真核生物基因體中含量豐富，並可促成基因體的演化與多樣性。主要分為兩大類：LTR (long terminal repeat) retrotransposons 和 non-LTR retrotransposons (包含 LINEs 和 SINEs)。

(2) Spliceosome:
The spliceosome is a large and dynamic molecular machine found in the nucleus of eukaryotic cells. It is responsible for pre-mRNA splicing, a crucial step in gene expression. Splicing removes non-coding regions (introns) from the pre-mRNA and joins the coding regions (exons) together to form mature messenger RNA (mRNA). The spliceosome is composed of small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs), which are complexes of small nuclear RNAs (snRNAs) and proteins. Through a series of precise base-pairing interactions and conformational changes, the spliceosome catalyzes the removal of introns and the ligation of exons.

【答案】Spliceosome 是存在於真核細胞核內一個大型且動態的分子機器，負責前驅 mRNA (pre-mRNA) 的剪接 (splicing)。剪接是基因表現中的關鍵步驟，其作用是移除 pre-mRNA 中非編碼區域 (內含子, introns)，並將編碼區域 (外顯子, exons) 連接起來，形成成熟的信使 RNA (mRNA)。Spliceosome 由小核核糖核蛋白 (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) 組成，snRNPs 是由小核 RNA (small nuclear RNAs, snRNAs) 和蛋白質所構成的複合物。透過一系列精確的鹼基配對互動和構象改變，spliceosome 催化內含子的移除和外顯子的連接。

(3) Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP):
FRAP is a powerful microscopy technique used to measure the lateral mobility of molecules within a living cell or in vitro. In a typical FRAP experiment, a specific fluorescent molecule (e.g., a fluorescently labeled protein) within a defined region of interest (ROI) is irreversibly photobleached using a high-intensity laser beam. This bleaching permanently destroys the fluorescence in the illuminated area. After bleaching, the fluorescence intensity in the ROI is monitored over time. If the photobleached molecules are mobile, unbleached fluorescent molecules from surrounding areas will diffuse into the ROI, cau

本題考查細胞內蛋白質的降解機制，特別是針對短壽命蛋白質（如週期蛋白 cyclins）。

細胞內蛋白質的降解主要透過兩種途徑：溶酶體途徑 (lysosomal pathway) 和泛素-蛋白酶體途徑 (ubiquitin-proteasome system, UPS)。短壽命蛋白質，尤其是那些需要精確調控的蛋白質，如細胞週期中的週期蛋白 (cyclins)，主要透過泛素-蛋白酶體途徑進行降解。

機制描述：

1. 識別與標記 (Recognition and Tagging):

   • 泛素化 (Ubiquitination): 短壽命蛋白質的降解始於其被識別並連接上泛素 (ubiquitin) 分子。這個過程需要一系列酵素的協同作用：
     • E1 活化酶 (E1 ubiquitin-activating enzyme): 消耗 ATP 將泛素活化，形成高能硫酯鍵。
     • E2 結合酶 (E2 ubiquitin-conjugating enzyme): 接受活化的泛素，並將其轉移到自身半胱胺酸殘基上。
     • E3 泛素連接酶 (E3 ubiquitin ligase): 這是關鍵的識別步驟。E3 酶具有特異性，能夠識別特定的目標蛋白質（例如，週期蛋白的降解信號序列，如 destrucción box, D-box）並將泛素從 E2 酶轉移到目標蛋白質的離胺酸殘基 (lysine residues) 上。一個蛋白質通常需要連接多個泛素分子（形成泛素鏈）才能被有效識別。週期蛋白的降解通常與其 N-末端或特定序列（如 D-box）的離胺酸殘基被泛素化有關。

2. 識別泛素化蛋白質 (Recognition of Ubiquitinated Protein):

   • 被泛素化的蛋白質（通常是多泛素鏈）會被細胞質中的蛋白酶體 (proteasome) 識別。蛋白酶體是一個大型的、ATP 依賴性的蛋白質複合物，負責降解泛素化的蛋白質。

3. 蛋白酶體降解 (Proteasomal Degradation):

   • 進入蛋白酶體 (Entry into the Proteasome): 泛素化的蛋白質被運送到蛋白酶體，並通過其開放的通道進入蛋白酶體的核心催化腔室。在進入過程中，泛素標籤通常會被移除，以便重複利用。
   • 蛋白質展開與降解 (Protein Unfolding and Degradation): 在蛋白酶體內部，ATP 驅動的蛋白質展開機制 (chaperone-like activity) 會將目標蛋白質展開，使其成為線性多肽鏈。

本題考查中心體 (centrosome) 的結構與功能。

結構 (Structure):

中心體是動物細胞和低等植物細胞中主要的微管組織中心 (Microtubule Organizing Center, MTOC)。在大多數動物細胞中，中心體位於細胞核附近，細胞質中。一個典型的中心體包含以下幾個主要組成部分：

1. 中心粒 (Centrioles):

   • 中心體通常包含兩個相互垂直排列的中心粒，稱為「母中心粒」(mother centriole) 和「子中心粒」(daughter centriole)。
   • 每個中心粒是一個圓柱狀結構，直徑約 200 nm，長度約 400 nm。
   • 中心粒的結構非常獨特：由 9 組三聯微管 (triplets of microtubules) 圍繞一個中央空腔排列而成，呈「9+0」結構（相較於纖毛或鞭毛的「9+2」結構）。每組三聯微管由 A-微管、B-微管和 C-微管組成，A-微管是完整的微管，B-微管和 C-微管是部分微管，它們共用一部分管壁。
   • 中心粒內部還可能含有一些蛋白質結構，如節點 (nodes) 或軸絲 (axis)。
   • 母中心粒通常比子中心粒更成熟，表面可能附有纖毛或鞭毛的基體 (basal body)。

2. 中心體基質 (Pericentriolar Material, PCM):

   • 中心粒被一種無定形的蛋白質基質所包圍，稱為中心體基質 (PCM)。
   • PCM 是微管成核 (nucleation) 的主要場所。它含有大量蛋白質，包括 γ-微管蛋白環複合物 (γ-tubulin ring complex, γ-TuRC)，這是啟動微管生長的關鍵組分。
   • PCM 的體積和蛋白質組成會隨著細胞週期的不同而變化，在細胞分裂前期會顯著擴張。
   • PCM 也負責中心粒的複製和組裝。

功能 (Function):

中心體在細胞的生命週期中扮演著至關重要的角色，主要包括：

1. 微管組織中心的形成 (Formation of Microtubule Organizing Centers, MTOCs):
   • 中心體是細胞內主要的微管成核位點。PCM 中的 γ-TuRC 能夠結合微管蛋白 (tubulin)，啟動微管的組裝，並決定微管的極性（負端錨定在中心體，正端向外延伸）。

本題考查溶酶體酵素在反式高基氏網 (trans-Golgi network, TGN) 的分選與運輸機制，並要求包含受體、接頭蛋白和衣被蛋白的角色。

溶酶體是細胞內的消化器官，其中含有多種水解酶。這些溶酶體酵素在內質網 (ER) 合成，進入高基氏體 (Golgi apparatus) 進行修飾和分選，最終被運送到溶酶體。反式高基氏網 (TGN) 是高基氏體最後的囊泡輸出部門，是蛋白質分選到不同細胞器（如溶酶體、細胞膜、分泌囊泡）的關鍵節點。

分選與運輸機制：

1. 酵素的識別標記 (Recognition and Tagging of Lysosomal Enzymes):

   • 溶酶體酵素在內質網和順式高基氏體 (cis-Golgi) 中會經歷醣基化 (glycosylation)，特別是在特定位置的絲胺酸或離胺酸殘基上添加甘露糖 (mannose) 殘基。
   • 接著，在順式高基氏體中，這些甘露糖殘基會被一種稱為 N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶 (N-acetylglucosamine-1-phosphate transferase) 的酵素識別。
   • 該酵素催化將 N-乙醯葡糖胺-1-磷酸 (GlcNAc-1-phosphate) 轉移到甘露糖殘基上，形成一個磷酸化的醣鏈。
   • 隨後，在順式高基氏體或中間高基氏體 (medial-Golgi) 中，這個磷酸化的醣鏈會被一種專一性的 磷酸甘露糖識別酵素 (phosphomannose-recognizing enzyme)，即 UDP-N-乙醯葡糖胺：甘露糖-6-磷酸轉移酶 (UDP-N-acetylglucosamine:mannose-6-phosphate transferase)，進一步處理，在甘露糖殘基上添加一個磷酸基團，形成 甘露糖-6-磷酸 (Mannose-6-phosphate, M6P) 標籤。這個 M6P 標籤是溶酶體酵素被分選到溶酶體的關鍵信號。

2. 在反式高基氏網 (TGN) 的分選 (Sorting at the trans-Golgi Network, TGN):

   • 帶有 M6P 標籤的溶酶體酵素會從高基氏體的腔室中擴散到 TGN。
   • 在 TGN 的細胞質側，存在一種專一性的 M6P 受體 (M6P receptor)。這種受體是一種跨膜蛋白，其胞外結構域能特異性地結合帶有 M6P 標籤的溶酶體酵素。
   • 受體 (Receptors): M6P 受體扮演著「貨物拾取器」的角色，將目標溶酶體酵素從 TGN 腔室中捕獲並聚集。
   • 接頭蛋白 (Adaptor Proteins): M6P 受體與其結合的溶酶體酵素複合物，會進一步與細胞質中的接頭蛋白相互作用。

本題考查光合作用生物演化的可能事件，追溯其起源於原核生物祖先。

光合作用是將光能轉化為化學能的過程，是地球生命史上最重要的演化事件之一。現代光合作用生物（如植物、藻類）的起源可以追溯到早期原核生物，特別是藍綠菌 (cyanobacteria)。

最可能的演化事件：

1. 早期原核生物的能量獲取方式 (Energy Acquisition in Early Prokaryotes):

   • 最早的生命形式可能依賴化學合成 (chemosynthesis) 或從周圍環境吸收有機物（異營性, heterotrophy）。
   • 隨著有機物資源的消耗，演化出利用無機物獲取能量的化學自營性 (chemoautotrophy)。

2. 光合作用的起源：初級光合作用 (Origin of Photosynthesis: Primitive Photosynthesis):

   • 厭氧光合作用 (Anaerobic Photosynthesis): 最早的光合作用可能是在缺乏氧氣的環境中發生的。一些細菌（如綠硫細菌、紫硫細菌）進行厭氧光合作用，它們使用不同於水的電子供體，例如硫化氫 ($H_2S$) 或有機物，並產生硫磺 (S) 或硫酸鹽 ($SO_4^{2-}$) 等副產物，而非氧氣。它們的電子傳遞鏈和光合色素（如類胡蘿蔔素、視黃醛）可能比現代光合作用更簡單。

3. 氧氣產生光合作用的出現 (Emergence of Oxygenic Photosynthesis):

   • 藍綠菌的演化 (Evolution of Cyanobacteria): 這是關鍵的演化步驟。藍綠菌演化出了利用水 ($H_2O$) 作為電子供體進行光合作用的能力。這是一個重大的演化突破，因為水是一種豐富且可再生的資源。
   • 水的光解 (Photolysis of Water): 利用水作為電子供體，意味著需要一個能夠氧化水的複雜蛋白質複合物，即 光系統 II (Photosystem II, PSII) 中的 錳簇 (manganese cluster)。水的光解產生了質子 ($H^+$) 和電子，而副產物是氧氣 ($O_2$)。

本題考查動物與植物細胞在訊號傳遞途徑上的差異。

細胞訊號傳遞是細胞間溝通和響應環境變化的基本機制。儘管許多基本的訊號傳遞原理（如受體、第二信使）在動植物中是保守的，但存在一些獨特的訊號傳遞途徑，反映了它們不同的演化歷程和生理需求。

1. 在動物中常見，但在植物中缺席的訊號傳遞途徑：

神經訊號傳遞 (Neural Signaling) / 離子通道偶聯受體 (Ion Channel-Coupled Receptors) 及其下游途徑

• 例子：神經傳導 (Neurotransmission) 中的神經遞質訊號傳遞。
  • 動物： 動物神經系統是其複雜行為和生理調控的基礎。神經元通過電化學訊號傳遞資訊。當神經衝動到達神經末梢時，會觸發電壓門控鈣離子通道 (voltage-gated Ca$^{2+}$ channels) 打開，導致細胞外 $Ca^{2+}$ 進入神經末梢。$Ca^{2+}$ 離子會觸發囊泡釋放神經遞質 (neurotransmitters) 到突觸間隙。神經遞質與突觸後膜上的離子通道偶聯受體 (ion channel-coupled receptors, 也稱為離子型受體, ionotropic receptors) 結合，引起突觸後膜離子通道的開放或關閉，改變突觸後神經元的膜電位，傳遞訊號。這是一個快速、精確且長距離的訊號傳遞方式。
  • 植物： 植物雖然也能感知和響應環境刺激，但缺乏真正意義上的神經系統和神經元。它們的訊號傳遞主要依賴於化學訊號（如植物激素、離子流、電訊號，但與動物神經傳導機制不同）和細胞壁內的連接 (plasmodesmata)。植物確實有離子通道，但它們的功能和調控方式與動物神經系統中的離子通道偶聯受體有顯著差異，不構成複雜的神經傳導網絡。

其他動物特有的訊號傳遞：

• G蛋白偶聯受體 (GPCRs) 介導的複雜訊號級聯： 雖然植物也有 GPCRs 的同源物，但動物中 GPCRs 的種類和數量極為龐大，介導了對嗅覺、視覺、味覺、激素訊號、神經遞質訊號等廣泛刺激的響應，構成複雜的生理調控網絡。
• 細胞因子訊號傳遞 (Cytokine Signaling)： 免疫系統中的細胞因子訊號傳遞在動物中非常重要，用於協調免疫反應。

2. 在植物中常見，但在動物中缺席的訊號傳遞途徑：

質外體訊號傳遞 (Apoplast Signaling) / 胞間連絲訊號傳遞 (Plasmodesmatal Signaling)

• 例子：植物激素訊號傳遞與生長響應。
  • 植物： 植物細胞之間通過胞間連絲 (plasmodesmata) 形成連續的細胞質網絡，允許小分子（如離子、

本題考查 CRISPR-Cas9 基因編輯技術的工作原理。

CRISPR-Cas9 是一種革命性的基因編輯工具，它能夠精確地在基因組的特定位點引入 DNA 斷裂，從而實現基因的敲除 (knockout)、插入 (insertion) 或修飾 (modification)。該系統最初是細菌的適應性免疫系統，用於抵抗病毒感染。

CRISPR-Cas9 系統的組成與工作原理：

CRISPR-Cas9 系統主要由兩個關鍵組件構成：

1. Cas9 酶 (Cas9 Enzyme):

   • Cas9 是一種 DNA 內切酶 (endonuclease)，能夠切割雙鏈 DNA (dsDNA)。
   • 它具有兩個核酸酶結構域 (nuclease domains)，分別是 RuvC 和 HNH 結構域，這兩個結構域負責切割 DNA 的兩條鏈。
   • Cas9 酶的切割活性需要一個引導分子來定位到特定的 DNA 位點。

2. 導引 RNA (guide RNA, gRNA):

   • 導引 RNA 是 CRISPR-Cas9 系統的核心，它是一個小分子 RNA，能夠引導 Cas9 酶到目標 DNA 序列。
   • 在基因編輯應用中，通常使用 單導引 RNA (single guide RNA, sgRNA)，它是一個人工設計的分子，結合了天然 CRISPR 系統中的兩種 RNA（crRNA 和 tracrRNA）的功能。
   • sgRNA 包含兩個主要部分：
     • 序列特異性部分 (Spacer/Targeting sequence): 這是一段約 20 個核苷酸的序列，與目標 DNA 序列互補配對。這個序列決定了 Cas9 酶將在哪個基因組位點進行切割。
     • 結構性支架部分 (Scaffold/Backbone sequence): 這部分 RNA 結構能夠與 Cas9 酶結合，並將其穩定在目標 DNA 位點。

工作流程：

1. ** sgRNA 與 Cas9 酶的組裝 (Assembly of sgRNA and Cas9 Enzyme):**

   • 在細胞內或體外，sgRNA 首先與 Cas9 酶結合，形成一個功能性的 RNA-蛋白質複合物 (ribonucleoprotein complex)。

2. 目標 DNA 識別 (Target DNA Recognition):

   • RNA-蛋白質複合物會在基因組中搜尋與 sgRNA 的序列特異性部分互補的 DNA 序列。
   • 為了能夠結合並切割，目標 DNA 序列旁邊必須緊鄰一個 識別序列 (Protospacer Adjacent Motif, PAM)。PAM 序列對 Cas9 酶的結合和切割至關重要。對於最常用的 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，PAM 序列通常是 5'-NGG-3'（N 代表任何核苷酸）。Cas9 酶首先識別 PAM 序列，然後 sgRNA 的 20nt 序列才能與目標 DNA 鏈進行鹼基配對。

3. DNA 雙鏈斷裂 (DNA Double-Strand Break, DSB):

本題考查即時定量聚合酶鏈式反應 (real-time PCR，又稱 quantitative PCR, qPCR) 的實驗操作與 Ct 值的意義。

即時定量 PCR (Real-time PCR / qPCR) 的實驗操作：

即時定量 PCR 是一種靈敏且精確的技術，用於偵測和定量 DNA 或 RNA 的模板量。與傳統 PCR 不同的是，qPCR 在 PCR 擴增過程中實時監測螢光信號的產生，從而推斷初始模板的量。

實驗步驟：

1. 樣品準備與 RNA 反轉錄 (Sample Preparation and RNA Reverse Transcription):

   • RNA 提取： 如果研究目標是 RNA（例如 mRNA 的表達量），首先需要從細胞或組織中提取總 RNA。
   • 反轉錄 (Reverse Transcription)： 為了 PCR 擴增 DNA，需要將提取的 RNA 反轉錄成互補 DNA (complementary DNA, cDNA)。這一步通常使用反轉錄酶 (reverse transcriptase) 和隨機引物 (random primers) 或寡核苷酸 (oligo(dT) primers) 來完成。反轉錄產生的 cDNA 將作為 PCR 擴增的模板。

2. PCR 混合液的配製 (Preparation of PCR Reaction Mix):

   • 將 cDNA 模板、DNA 聚合酶 (DNA polymerase，通常是熱穩定的 Taq 聚合酶)、dNTPs (四種脫氧核苷酸三磷酸)、引物對 (primer pair，特異性識別目標 DNA 序列的正向和反向引物)、以及螢光染料或探針 (fluorescent dye or probe) 加入到 PCR 緩衝液中。
   • 螢光偵測方法：
     • SYBR Green 染料： 這是一種廣泛使用的螢光染料，它能嵌入雙鏈 DNA (dsDNA) 中並發出螢光。當 PCR 產物增加時，結合的 SYBR Green 越多，螢光信號越強。SYBR Green 的優點是便宜且易於使用，但缺點是它會與所有 dsDNA 結合，包括非特異性產物，可能導致偽陽性結果。
     • TaqMan 探針 (TaqMan probes)： 這是一種更特異的螢光標記寡核苷酸探針，其 5' 端帶有螢光報告基團 (reporter dye)，3' 端帶有螢光猝滅基團 (quencher dye)。探針的序列設計為能與 PCR 擴增過程中的模板結合。當 DNA 聚合酶的 5'→3' 外切酶活性（例如 Taq 酶的活性）在延伸過程中將探針切斷時，報告基團與猝滅基團分離，報告基團發出螢光。每個 PCR 循環，隨著目標 DNA 的擴增，探針被切斷的次數越多，螢光信號越強。TaqMan 探針方法具有更高的特異性，能有效排除非特異性擴增。

3. PCR 循環與螢光信號監測 (PCR Cycling and Fluorescence Monitoring):

   • 將配製好的 PCR 混合液放入即時定量 PCR 儀器 (real-time PCR cycler) 中。
   • 儀器會執行標準的 PCR 循環：變性 (denaturation, ~95°C)、退火 (annealing, ~50-65°C，取決於引物)、延伸 (extension, ~72°C)。