114 年 國立臺灣大學植物科學系碩士班《細胞生物學（B）》

此題主要在考查細胞核的屏障結構——核孔複合體（Nuclear Pore Complex, NPC）的結構組成與其在蛋白質運輸中的功能。

核孔複合體（NPC）的結構：
核孔複合體是一個龐大、對稱的蛋白質結構，位於核膜上，負責調控分子進出細胞核。它由數百種不同的蛋白質組成，稱為核孔蛋白（nucleoporins, Nups）。這些核孔蛋白可大致分為幾類：

1. 結構性核孔蛋白（Structural Nups）： 構成 NPC 的骨架，例如組成核環（nuclear ring）和細胞質環（cytoplasmic ring）的 Nups。
2. 籠狀核孔蛋白（Cage-like Nups）： 圍繞 NPC 的通道，形成類似籠子的結構，其中富含 FG-repeat 區域。
3. FG-repeat 蛋白（FG-Nups）： 這是 NPC 功能的關鍵。這些蛋白質含有富含苯丙胺酸（Phenylalanine, F）和甘胺酸（Glycine, G）的重複序列。這些疏水性的 FG-repeat 區域形成一個可溶性的凝膠狀屏障，阻止了大多數大分子自由通過，但允許特定的小分子和需要運輸的大分子通過。
4. 核環與細胞質環蛋白（Ring and Cytoplasmic Ring Nups）： 這些蛋白位於 NPC 的兩側，分別朝向細胞核質和細胞質，它們參與招募運輸因子。
5. 核籃體（Nuclear Basket）與細胞質纖維（Cytoplasmic Filaments）： 位於 NPC 兩側的蛋白質複合物，核籃體朝向細胞核質，細胞質纖維朝向細胞質，它們參與調控運輸過程。

核孔複合體（NPC）的功能：
NPC 的主要功能是作為細胞核與細胞質之間雙向運輸的通道，但它具有高度選擇性：

1. 小分子運輸： 直徑小於約 40 kDa 的小分子（如離子、代謝物）可以通過 NPC 的中央通道進行自由擴散。

此題考查網格蛋白介導的胞吞作用（Clathrin-mediated endocytosis, CME）的機制及其在調節激素訊號傳遞中的作用。

網格蛋白介導的胞吞作用（CME）的機制：
CME 是一種重要的胞吞作用途徑，主要用於攝取細胞表面的特定分子，包括受體、離子通道、脂質等。其過程如下：

1. 信號識別與配體結合： 許多細胞表面受體在與其配體（如生長因子、神經營養因子）結合後，會募集到細胞膜的特定區域。
2. 網格蛋白籠的形成： 胞質中的網格蛋白（clathrin）分子會聚集並組裝成三腳架狀的網格蛋白三聚體（triskelions）。這些三聚體在細胞膜的內側組裝成一個由多邊形網格構成的籠子。
3. 接頭蛋白的招募： 在網格蛋白籠形成過程中，需要一系列的接頭蛋白（adaptor proteins），如 AP2 複合物，來連接細胞膜上的受體（或其細胞內結構域）與網格蛋白籠。接頭蛋白也負責將網格蛋白招募到細胞膜上。
4. 囊泡的形成與內陷： 在接頭蛋白和網格蛋白的作用下，細胞膜會向內凹陷，形成一個囊泡。這個過程還需要一些動力蛋白（如 dynamin）的參與，它們會纏繞在囊泡頸部，並通過 GTP 水解提供能量，促進囊泡的切割，使其從細胞膜上脫離，進入細胞質。
5. 囊泡的脫網格蛋白化與運輸： 脫落的網格蛋白籠隨後會被解聚，釋放網格蛋白分子回到細胞質中循環利用。囊泡則會與內體（endosome）融合，進而進行後續的處理，例如受體的降解或回收。

此題要求描述細胞骨架的三種主要類型，包括它們的組成成分、結構特點以及主要功能。

細胞骨架（Cytoskeleton）是真核細胞質中由蛋白質纖維構成的動態網絡，它為細胞提供結構支持、維持細胞形態、參與細胞運動、物質運輸以及細胞分裂等重要過程。主要有三種類型的細胞骨架：

1. 微絲（Microfilaments）或稱肌動蛋白絲（Actin Filaments）

• 組成： 主要由球狀肌動蛋白（G-actin）單元聚合而成，形成雙股螺旋的纖維結構。
• 結構特點： 直徑約 7 nm，是最細的細胞骨架纖維。具有極性（plus end 和 minus end），可在兩端進行聚合或解聚，是動態結構。
• 功能：
  • 細胞形態維持： 在細胞皮質（cell cortex）形成網絡，維持細胞的形狀和剛性。
  • 細胞運動： 參與細胞爬行運動（如變形蟲運動）、肌肉收縮（與肌球蛋白結合）、細胞質流動（cytoplasmic streaming）。
  • 細胞分裂： 在動物細胞分裂過程中形成收縮環，幫助細胞質分裂。
  • 胞內運輸： 作為肌球蛋白（myosin）馬達蛋白運動的軌道，運輸囊泡或細胞器。

2. 中間纖維（Intermediate Filaments, IFs）

• 組成： 由多種不同的蛋白質組成，這些蛋白質具有共同的結構域，但序列差異很大，形成一個異質的家族。常見的類型包括角蛋白（keratins）、波形蛋白（vimentin）、神經絲蛋白（neurofilaments）、層狀蛋白（lamins）等。
• 結構特點： 直徑約 8-12 nm，比微絲粗，但不如微管粗。它們是高度穩定的、非極性的纖維，由擰繞在一起的蛋白質原纖維組成，形成強韌的束狀結構。
• 功能：
  • 機械強度與張力支持： 提供細胞和細胞核機械強度，抵抗拉伸和機械壓力，維持細胞和組織的完整性。例如，角蛋白在皮膚等上皮細胞中提供保護。

此題考查核小體（nucleosome）的組成及其在基因表達調控中的作用。

核小體（Nucleosome）的組成：
核小體是真核生物染色質的基本結構單位，是 DNA 纏繞組蛋白形成的複合物。

1. 核心組蛋白（Histone Core）： 由一組八個組蛋白分子組成，稱為組蛋白八聚體（histone octamer）。這八個組蛋白包括：
   • 兩個 H2A 分子
   • 兩個 H2B 分子
   • 兩個 H3 分子
   • 兩個 H4 分子
     這八個組蛋白形成一個圓柱狀的核心，DNA 圍繞這個核心纏繞約 1.65 圈（約 147 個鹼基對）。
2. 連接組蛋白（Linker Histone）： 在核小體之間，DNA 上會結合一個連接組蛋白，通常是 H1。H1 組蛋白有助於將核小體包裝成更緊密的結構，進一步壓縮染色質。
3. DNA： 雙股 DNA 分子，通過與組蛋白的相互作用，被緊密地纏繞在組蛋白核心上。

核小體在基因表達調控中的作用：
核小體結構對基因表達調控至關重要，主要通過兩種方式：

1. DNA 包裝與基因可及性（Accessibility）：
   • 緊密包裝（Heterochromatin）： 當 DNA 被緊密地包裝成高階結構（如 30 nm 纖維，甚至更緊密的染色質結構）時，DNA 對轉錄因子、RNA 聚合酶等調控蛋白質的接近性大大降低。這種緊密包裝的區域通常是轉錄不活躍的，稱為異染色質（heterochromatin）。
   • 鬆散包裝（Euchromatin）： 當核小體結構較為鬆散，DNA 暴露程度較高時，調控蛋白質更容易結合到 DNA 上，啟動轉錄。這種鬆散包裝的區域通常是轉錄活躍的，稱為常染色質（euchromatin）。

此題要求解釋兩個重要的細胞生物學術語：FRAP 和自噬作用。

1. 螢光恢復後光漂白（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）

• 定義： FRAP 是一種定量測量細胞內分子移動性的技術。它利用螢光顯微鏡，將細胞內某個區域的螢光分子通過高強度雷射照射而「漂白」（即破壞其螢光信號），然後監測該區域外未漂白的螢光分子向漂白區域移動，以及漂白分子向外擴散的過程。
• 原理：
  1. 標記： 細胞內的目標分子（如蛋白質、脂質）需要被螢光標記。這可以通過表達螢光蛋白融合體（如 GFP-Protein）、使用螢光抗體或螢光染料來實現。
  2. 光漂白： 使用高強度雷射束選擇性地照射細胞內的一個小區域（稱為漂白區域），該區域的螢光分子被永久性破壞，失去螢光。
  3. 監測恢復： 在漂白後，使用較低強度的雷射掃描該區域，並連續拍攝影像，監測漂白區域的螢光強度隨時間的變化。
  4. 數據分析： 如果目標分子在細胞內是可移動的（例如，在細胞質或細胞核中自由擴散，或在膜上移動），那麼未漂白的螢光分子會從周圍區域擴散進入漂白區域，導致漂白區域的螢光強度在一段時間後逐漸恢復。恢復的速率和程度可以定量分析。
• 應用： FRAP 廣泛應用於研究：
  • 蛋白質的擴散係數： 測量蛋白質在細胞質、細胞核或細胞膜上的移動速度。
  • 膜脂的流動性： 評估細胞膜的動態性。
  • 核孔複合體的動力學： 研究核孔蛋白在核膜上的交換速率。
  • 染色質的動力學： 評估組蛋白或 DNA 在細胞核中的交換率。
  • 細胞器膜的連接性： 探討細胞器膜之間的物質交換。
    通過 FRAP，可以判斷一個分子是高度移動的、局部移動的，還是相對固定的。

2. 自噬作用（Autophagy）

• 定義： 自噬作用（字面意思是「自我吞噬」）是真核細胞內的一種基本的細胞質降解途徑。它通過形成雙層膜的自噬體（autophagosome），包裹細胞質中的受損細胞器、聚集的蛋白質、病原體等，然後與溶酶體（lysosome）融合，將包裹的內容物降解，回收其中的單體成分（如胺基酸、脂肪酸）供細胞再利用。
• 類型： 主要有三種類型：
  • 巨自噬（Macroautophagy）： 最常見和研究最多的類型。

此題要求描述肌醇三磷酸（inositol triphosphate, IP3）和二酰甘油（diacylglycerol, DAG）的形成、訊號傳遞途徑及其功能。這兩個分子是磷脂酶 C（PLC）作用的產物，在細胞內扮演重要的第二信使角色。

1. 形成 (Formation)
IP3 和 DAG 的形成與細胞膜上的磷脂酶 C（PLC）及其激活機制密切相關。PLC 是一個催化酶，它作用於細胞膜上的特定磷脂分子：磷脂醯肌醇 4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2）。

• PLC 的激活： PLC 的激活通常由細胞表面的受體介導，最常見的是 G 蛋白偶聯受體（GPCRs）或酪氨酸激酶受體（RTKs）。
  • GPCR 途徑： 當激素或神經遞質與 GPCR 結合後，激活細胞膜上的 Gq 蛋白亞型。Gq 的 α 亞基（Gαq）與 PLC 結合，激活 PLC。
  • RTK 途徑： 當生長因子與 RTK 結合後，RTK 會自身磷酸化，並募集細胞質中的 PLC isoforms（如 PLCγ）。PLCγ 的 SH2 結構域與 RTK 上的磷酸化酪氨酸殘基結合，從而被激活。
• 催化反應： 被激活的 PLC 催化 PIP2 分子水解，將其磷酸二酯鍵斷裂，產生兩個細胞內第二信使：
  • 肌醇三磷酸（IP3）： 是一個水溶性的分子，從細胞膜上釋放到細胞質中。
  • 二酰甘油（DAG）： 是一個脂溶性的分子，仍然保留在細胞膜上。

$\text{PIP}_2 \xrightarrow{\text{PLC}} \text{IP}_3 + \text{DAG}$

2. 訊號傳遞 (Signal Transduction)
IP3 和 DAG 分別通過不同的機制介導訊號傳遞：

• IP3 的訊號傳遞：
  • 作用靶點： IP3 擴散到細胞質後，會結合到內質網（endoplasmic reticulum, ER）膜上的 IP3 受體（IP3R）。IP3R 是一種鈣離子通道。
  • 細胞內鈣離子釋放： IP3 與 IP3R 結合後，會打開鈣離子通道，導致儲存在內質網腔內的鈣離子（$Ca^{2+}$）大量釋放到細胞質中。
  • 細胞質 $Ca^{2+}$ 升高： 細胞質鈣離子濃度的急劇升高是細胞內許多生理反應的關鍵觸發信號。

好的，各位同學，我們來解析這題關於各種顯微鏡的比較題。這題主要考驗大家對不同類型顯微鏡在解析度、樣本製備以及成像原理上的理解與比較能力。這類題目需要將各個顯微鏡的特性條列化，並進行系統性的比較，才能完整呈現差異。

這題總共 12 分，要求我們比較光學顯微鏡 (light microscope)、掃描式電子顯微鏡 (scanning electron microscope, SEM)、穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscope, TEM) 以及共軛焦顯微鏡 (confocal microscope) 在三個面向的差異：解析度 (resolution)、樣本製備 (sample preparation) 和成像原理 (imaging principles)。

我們將針對這三個面向，逐一比較這四種顯微鏡。

(a) Resolution of microscopes

解析度是指顯微鏡能夠分辨兩個相鄰物體之間最小距離的能力。解析度越高，能看到越精細的結構。解析度主要受光源波長 ($\lambda$) 和顯微鏡數值孔徑 (numerical aperture, NA) 的影響，通常可以用瑞利判準 (Rayleigh criterion) 或艾貝法則 (Abbe's diffraction limit) 來描述：

$d = \frac{0.61\lambda}{NA}$

其中 $d$ 是最小可分辨距離。

• 光學顯微鏡 (Light Microscope, LM)：

  • 光源是可見光，波長 ($\lambda$) 大約在 400-700 nm。
  • 數值孔徑 (NA) 的上限約為 1.4 (使用油鏡時)。
  • 因此，理論上的最高解析度約為 $\frac{0.61 \times 400 \text{ nm}}{1.4} \approx 170 \text{ nm}$，實際操作上約為 200 nm (0.2 $\mu$m)。這意味著光學顯微鏡無法分辨小於 200 nm 的結構，例如病毒或細胞器內的細微結構。

• 電子顯微鏡 (Electron Microscope, EM)：

  • 電子顯微鏡使用電子束作為光源，電子的波長遠小於可見光，可以透過改變加速電壓來調整。
  • 電子顯微鏡的數值孔徑 (NA) 相對較大。
  • 穿透式電子顯微鏡 (Transmission Electron Microscope, TEM)：
    • 使用波長非常短的電子束 (約 0.004 nm)。
    • 解析度可達 0.1-0.2 nm (1-2 Å)，能夠分辨原子排列。對於生物樣品，通常能分辨到細胞器內的超微結構，例如膜的雙層結構、核糖體等。
  • 掃描式電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscope, SEM)：
    • 雖然也使用電子束，但其成像原理是偵測樣品表面反射或二次產生的電子，因此解析度通常比 TEM 差，約為 1-20 nm。
    • SEM 主要用於觀察樣品的表面形貌，提供三維立體感。

• 共軛焦顯微鏡 (Confocal Microscope, CM)：

  • 共軛焦顯微鏡是一種特殊類型的光學顯微鏡，它使用雷射作為光源，並透過一個針孔 (pinhole) 來排除來自焦平面以外的雜散光。
  • 雖然它仍然受限於可見光的波長，但透過精確的光學設計和點掃描成像，其解析度可以比傳統光學顯微鏡略有提升，約為 100-200 nm。
  • 其最大的優勢在於能夠進行光學切片，獲得清晰的斷層影像，並進行三維重構，這在觀察厚樣品或細胞內部結構時非常有用。

總結解析度差異：
TEM (0.1-0.2 nm) > SEM (1-20 nm) > Confocal Microscope (100-200 nm) $\approx$ Light Microscope (200 nm)。

(b) Sample preparation for observation by microscopes

樣本製備是決定能否成功觀察以及觀察效果的關鍵步驟。不同顯微鏡對樣本的要求差異很大。

• 光學顯微鏡 (Light Microscope, LM)：

  • 優點：樣本製備相對簡單，可以觀察活體細胞或組織。
  • 方法：
    • 活體觀察 (Live imaging)：直接將細胞或懸浮液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片即可觀察。
    • 固定 (Fixation)：使用化學固定劑 (如甲醛、戊二醛) 來保持細胞結構，防止自體分解。
    • 染色 (Staining)：使用染料 (如蘇木精伊紅 H&E, DAPI, 螢光染料) 來增加對比度，使特定結構顯現。
    • 切片 (Sectioning)：對於較厚的組織，需要將其包埋 (embedding) 在石蠟或樹脂中，然後用切片機 (microtome) 切成薄片。
    • 染色後封片 (Mounting)：將切片染色後，用封片劑封蓋玻片。

• 電子顯微鏡 (Electron Microscope, EM)：

  • 共同點：電子束與樣品相互作用，樣品必須處於高真空環境，因此不能觀察活體細胞。樣本必須經過嚴格的固定、脫水和染色處理。
  • 穿透式電子顯微鏡 (Transmission Electron Microscope, TEM)：
    • 固定 (Fixation)：通常使用化學固定劑 (戊二醛、四氧化鋨) 進行雙重固定，以最大程度保留細胞結構。
    • 脫水 (Dehydration)：使用梯度濃度的乙醇或丙酮將樣本中的水分完全去除。
    • 包埋 (Embedding)：將脫水後的樣本包埋在環氧樹脂 (epoxy resin) 中，使其硬化。
    • 超薄切片 (Ultrathin sectioning)：使用超薄切片機 (ultramicrotome) 將包埋後的樣本切成極薄的切片 (約 50-100 nm)。
    • 重金屬染色 (Heavy metal staining)：為了增加對比度，因為電子束容易被重原子散射，所以需要使用醋酸鈾 (uranyl acetate) 和檸檬酸鉛 (lead citrate) 等重金屬染料對切片進行染色。
    • 觀察：將切片放置在 TEM 的載網上進行觀察。