114 年 國立臺灣大學植物科學系碩士班《分子生物學（A）》

這題考驗學生對細菌細胞分裂過程中，細胞壁（隔膜）形成與定位調控機制的理解，特別是 FtsZ 蛋白環和 Min 蛋白系統的功能。

細菌細胞分裂時，必須準確地在細胞中間形成細胞隔膜，將母細胞分隔成兩個子細胞。這個過程主要由 FtsZ 蛋白所組成的細胞分裂環（Z-ring）負責啟動。FtsZ 是微管蛋白（tubulin）的同源物，它會在細胞分裂的特定位置聚合形成一個環狀結構，作為細胞隔膜組裝的支架。

FtsZ 蛋白環的形成與定位受到嚴格的調控，以確保隔膜在細胞中央形成。MinCDE 系統就是其中一個關鍵的負向調控因子。MinCDE 系統包含 MinC、MinD 和 MinE 三種蛋白質。

• MinD 是一種 ATP 結合蛋白，它會與細胞膜結合，並招募 MinC。
• MinC 是一種細胞分裂抑制蛋白，它會結合 FtsZ，阻止 FtsZ 聚合形成 Z-ring。
• MinE 則會與 MinD 結合，並協助 MinD 和 MinC 在細胞膜上形成週期性的振盪分佈。

MinCDE 系統的運作機制如下：MinD 結合 ATP 後，會與細胞膜結合，並在細胞兩極（細胞壁的頂端）富集。MinC 隨後被招募到 MinD 旁邊，進而抑制細胞兩極的 FtsZ 聚合。

這題主要考查細菌質體（plasmid）在細胞分裂過程中，如何確保其穩定遺傳，即質體分配系統（partitioning system, par）的機制。此題以 P1 和 R1 質體為例。

質體是細菌細胞中獨立於染色體存在的環狀 DNA 分子。為了確保細胞分裂後，每個子細胞都能獲得至少一個質體拷貝，許多較大的質體發展出了主動的分配系統，稱為 par 系統。P1 和 R1 質體都擁有 par 系統。

P1 質體的 par 系統包含三個組分：

1. parS: 一段特定的 DNA 序列，是 par 系統的結合位點。
2. parA: 編碼一個 ATP 酶，負責將質體在細胞內進行定位和移動。
3. parB: 編碼一個與 parS 結合的蛋白質，它會與 parA 形成一個複合物。

P1 質體的分配機制如下：

1. 結合與複合物形成: 當 P1 質體複製後，parB 蛋白會識別並結合到 parS 序列上。一個 parB 分子可以結合多個 parS 序列，形成一個較大的 DNA-蛋白質複合物。
2. 定位與分離: parA 蛋白（ATP 酶）會與 parB-parS 複合物結合。在細胞分裂過程中，parA 的 ATP 水解活性會驅動這個複合物在細胞內移動。

這題考查的是農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）將一段 DNA 轉移到植物細胞中的機制，特別是與其致病性（virulence）相關的基因位點（loci）在此過程中的作用。農桿菌是植物基因工程中常用的載體，其轉移 DNA 的能力是關鍵。

農桿菌誘導的腫瘤形成（crown gall disease）是由一個稱為「致病性質體」（Ti plasmid）的質體所介導的。在 Ti 質體上，有一段稱為「轉移 DNA」（Transfer DNA, T-DNA）的區域，這段 DNA 會被農桿菌切割下來，並轉移到植物細胞的基因組中，從而引起植物細胞的無限增殖（形成腫瘤）。

DNA 轉移的整個過程主要由 Ti 質體上的一組基因所調控，這些基因被統稱為「致病性基因位點」（virulence loci, vir loci）。研究表明，有六個主要的 vir 基因簇（virA, virB, virC, virD, virE, virG）在 DNA 轉移過程中扮演關鍵角色。

這些 vir 基因的功能如下：

1. virA: 編碼一個膜結合的雙組份響應調節蛋白（two-component response regulator）。它能感知植物分泌的酚類化合物（如乙醯苯丙酮，acetosyringone），這是植物受傷時釋放的信號。
2. virG: 編碼另一個響應調節蛋白，它與 VirA 協同作用。當 VirA 感知到酚類化合物後，會磷酸化 VirG。磷酸化的 VirG 則作為轉錄因子，啟動其他 vir 基因（virB, virC, virD, virE）的表達。
3. virD1 和 virD2: virD1 是一個拓樸異構酶（topoisomerase），它與 virD2 共同作用，在 T-DNA 的邊界序列（border sequences）處切割 T-DNA。virD2 還是一個核酸酶，它能結合到 T-DNA 的一端（5' 端），形成一個「結合複合物」（T-complex），這個複合物是 T-DNA 在細胞內移動的關鍵。

這題考查的是大腸桿菌（E. coli）中，ColE1 質體複製的調控機制。ColE1 質體是一種常見的、非整合性（non-integrative）的質體，其複製方式是進行單向、滾動複製（rolling-circle replication）的一種變體，並且其拷貝數受到嚴格調控。

ColE1 質體的複製調控主要依賴於兩個關鍵的 RNA 分子和一個蛋白質：

1. RNA II (primer RNA): 這是一個較長的 RNA 分子，它會與質體 DNA 的複製起點（origin of replication, oriV）區域形成一個 RNA-DNA 雜合體。RNA II 在 oriV 區域的特定位置被切割，產生一個 3'-OH 末端，這個末端可以作為 DNA 聚合酶 III（DNA polymerase III）的起始點，開始 DNA 的合成。RNA II 的合成由細菌的 RNA 聚合酶催化，它不需要啟動子，而是由質體 DNA 自身的啟動子所驅動。
2. RNA I (inhibitor RNA): 這是一個短的 RNA 分子，與 RNA II 大小相似。RNA I 透過與 RNA II 的互補區域形成一個雙鏈 RNA-DNA 雜合體。這個雜合體的形成會阻止 RNA II 達到其在 oriV 區域的正確構象，從而阻止 RNA II 被切割，也就無法提供 DNA 合成所需的 3'-OH 末端。RNA I 的產生也由質體 DNA 的啟動子驅動，但其啟動子效率較低。
3. Rom 蛋白質 (Replication Origin Modulator): Rom 蛋白質是一種小分子蛋白質，它會與 RNA I 和 RNA II 形成的雜合體結合。

這題考查的是大腸桿菌（E. coli）中，同源重組（homologous recombination）過程中，如何修復雙鏈 DNA 斷裂（double-strand break, DSB）的機制，特別是 Rec 蛋白質複合體、chi 位點和 Ruv 蛋白質的作用。

大腸桿菌的 RecBCD 複合物是啟動同源重組修復 DSB 的關鍵酶。

1. RecBCD 複合物: 該複合物由 RecB、RecC 和 RecD 三個亞基組成。它具有解旋酶（helicase）和核酸酶（nuclease）的雙重活性。RecBCD 複合物能夠識別 DNA 斷裂處的雙鏈，並開始解開 DNA 雙螺旋。
2. Chi 位點 (χ site): Chi 位點是一個特定的 DNA 序列（通常是 5'-GCTGGTGG-3'），在 E. coli 的基因組中頻繁出現。RecBCD 複合物在解旋 DNA 的過程中，會遇到 Chi 位點。當 RecBCD 遇到 Chi 位點時，其核酸酶活性會發生改變。
   • 在 Chi 位點 之前（從 3' 到 5' 方向識別），RecBCD 主要具有外切核酸酶活性，切割掉 DNA 的兩條鏈。
   • 在 Chi 位點 之後（從 5' 到 3' 方向識別），RecBCD 的 RecB 亞基會被激活，其核酸酶活性主要變為沿著 3' 端進行切割，產生一個具有 3' 端突出的單鏈 DNA (ssDNA)。這個 3' 端突出的單鏈 DNA 是 RecA 蛋白結合的底物。
3. RecA 蛋白質: 結合到由 RecBCD 產生的 3' 端突出單鏈 DNA 上，形成一個絲狀的 RecA-ssDNA 複合物。這個複合物具有重要功能：
   • DNA 搜尋與配對: RecA-ssDNA 複合物能夠搜尋同源的 DNA 序列（來自另一個 DNA 分子，如姊妹染色單體或同源染色體）。

這題考查的是基因調控中的「增強子」（Enhancer）概念。

增強子（Enhancer）是位於基因調控區域的一種順式作用元件（cis-acting element），它可以顯著增強（或在某些情況下抑制）目標基因的轉錄活性。增強子具有以下幾個關鍵特徵：

1. 位置獨立性: 增強子可以位於目標基因的上游、下游、內含子中，甚至距離基因數十萬鹼基對之遠。
2. 方向獨立性: 增強子可以以正向或反向（相對於基因的轉錄方向）存在，其增強功能不受方向影響。
3. 增強轉錄: 增強子的主要功能是提高目標基因的轉錄起始速率。
4. 結合轉錄因子: 增強子序列通常包含許多特異性的 DNA 結合位點，能夠被特定的轉錄因子（transcription factors, TFs）所結合。這些轉錄因子，特別是活化因子（activators），能夠與增強子結合後，通過 DNA 的迴繞（looping）現象，與負責啟動轉錄的基礎轉錄機制（包括 RNA 聚合酶 II 和通用轉錄因子）在基因的啟動子區域進行相互作用，從而增強轉錄。

這題考查的是轉座子（transposons）中的一個重要類型，即玉米中的調控因子（Activator/Dissociation）元件，簡稱為 Ac/Ds 元件。這是一個經典的遺傳學和分子生物學研究案例，揭示了基因調控和基因突變的機制。

Ac/Ds 元件是玉米中發現的一類不穩定遺傳因子，由 Barbara McClintock 發現。它們屬於「跳躍基因」（jumping genes）或稱「轉座子」（transposons）。

• Ac (Activator) 元件:

  • Ac 是一個完整的、能夠自主轉座的轉座子。
  • 它自身編碼一個「轉座酶」（transposase），該酶能夠識別 Ac 元件兩端的特定序列，並催化 Ac 元件從基因組的一個位點「剪切」出來，然後插入到另一個位點。
  • Ac 元件可以誘導其自身和 Ds 元件的轉座。

• Ds (Dissociation) 元件:

  • Ds 元件本身不具有轉座酶的編碼能力，它是一個「不完整的」轉座子。
  • Ds 元件需要 Ac 元件提供的轉座酶才能進行轉座。
  • Ds 元件的結構通常是 Ac 元件的缺失或變異形式，其兩端的識別序列可能與 Ac 相似，但缺少了轉座酶的編碼基因。
  • Ds 元件的轉座會導致其插入位點的基因發生突變，例如導致基因失活（突變）或表達模式改變。

這題考查的是真核生物 mRNA 前體（pre-mRNA）剪接（splicing）過程中，負責執行剪接反應的分子機器——剪接體（Spliceosome）。

剪接體是一個龐大且複雜的蛋白質-RNA 複合物，它在真核細胞核內，負責從 pre-mRNA 中精確地移除內含子（introns），並將外顯子（exons）連接起來，形成成熟的信使 RNA（mature mRNA）。

剪接體的組成:
剪接體主要由以下幾部分組成：

1. 小核核糖核蛋白顆粒 (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs): 這是剪接體的核心組件。每個 snRNP 由一個或多個小核 RNA（small nuclear RNA, snRNA，如 U1, U2, U4, U5, U6）和一系列的蛋白質組成。snRNA 是剪接體催化功能的關鍵，它們能夠通過鹼基配對與 pre-mRNA 的特定序列（如剪接位點、分支位點）以及其他 snRNP 中的 RNA 進行相互作用。
2. 輔助蛋白質: 除了 snRNPs 中的蛋白質外，剪接體還包含許多非 snRNP 蛋白質，這些蛋白質參與 snRNPs 的組裝、剪接體的形成、催化反應以及剪接體的解體。

剪接體的形成與作用機制:
剪接體並非預先形成，而是逐步在 pre-mRNA 上組裝而成。這個過程可以分為幾個階段：

1. 初始複合物 (Commitment complex, CC) 形成: U1 snRNP 通過鹼基配對識別 pre-mRNA 的 5' 剪接位點（splice site）。同時，一些輔助蛋白質也結合到 pre-mRNA 上，例如分支位點結合蛋白（branch point binding protein, BBP）識別分支位點（branch point）。
2. 預剪接體 (Pre-spliceosome, PrS) 形成: U2 snRNP 識別並結合到分支位點，同時也與 U1 snRNP 發生相互作用。
3. 主剪接體 (Spliceosome, MS) 形成: U4/U6 snRNP 和 U5 snRNP 進入剪接體。

這題考查的是染色質（chromatin）結構中的「異染色質」（Heterochromatin）概念。異染色質是與常染色質（euchromatin）相對的概念，描述了染色質在細胞核內的不同壓縮程度和轉錄活性狀態。

異染色質 (Heterochromatin):
異染色質是指在細胞核內高度壓縮、濃縮的染色質區域。與之相對的常染色質則相對鬆散，更容易被轉錄因子接近。

異染色質的特徵:

1. 高度壓縮: 異染色質的 DNA 緊密地纏繞在組蛋白（histones）周圍，並進一步被組織成緊密的結構，使其在光學顯微鏡下呈現為濃染的區域。
2. 轉錄惰性: 由於其高度壓縮的結構，異染色質區域的 DNA 通常不容易被 RNA 聚合酶和轉錄因子接近，因此，這些區域的基因表達活性非常低，甚至完全沉默。
3. 複製遲緩: 異染色質區域的 DNA 複製通常比常染色質區域遲緩。
4. 種類: 異染色質可以分為兩種類型：
   • 組成性異染色質 (Constitutive heterochromatin): 這種異染色質在細胞週期的絕大多數時間內都保持高度壓縮狀態，並且在所有細胞類型中都存在。它通常富含重複序列 DNA，並主要存在於著絲粒（centromeres）和端粒（telomeres）等區域，這些區域在染色體結構和分離中起重要作用。

這題考查的是「表觀遺傳調控」（Epigenetic regulation）的概念及其對基因表達的影響。表觀遺傳調控是指不改變 DNA 序列本身，而是通過對 DNA 或組蛋白進行化學修飾，來影響基因的表達狀態。

什麼是表觀遺傳調控？
表觀遺傳調控是指在不改變 DNA 鹼基序列的前提下，通過影響染色質結構和 DNA 可及性，來調控基因的開啟（活化）或關閉（沉默）。這種調控是可以遺傳的（在細胞分裂時傳遞給子細胞，甚至在某些情況下可以跨代遺傳），但其基礎是化學修飾，而非 DNA 序列的改變。

主要的表觀遺傳調控機制:
表觀遺傳調控主要依賴於以下幾種機制：

1. DNA 甲基化 (DNA methylation):

   • 最常見的 DNA 甲基化發生在胞嘧啶（cytosine）的第 5 個碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）。
   • 在哺乳動物中，DNA 甲基化通常發生在 CpG 二核苷酸（cytosine-phosphate-guanine）序列中。
   • CpG 島（CpG islands）是位於基因啟動子區域富含 CpG 的區域。當 CpG 島發生甲基化時，通常會導致基因沉默。
   • 甲基化 DNA 可以直接影響轉錄因子與 DNA 的結合，或者招募甲基化 DNA 結合蛋白，這些蛋白進一步招募抑制轉錄的蛋白質複合物，從而關閉基因表達。

2. 組蛋白修飾 (Histone modification):

   • DNA 纏繞在組蛋白周圍形成核小體（nucleosome），核小體再進一步組織成染色質。組蛋白的 N 端尾巴（N-terminal tails）可以被多種化學基團修飾，包括乙醯化（acetylation）、甲基化（methylation）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等。
   • 組蛋白乙醯化 (Histone acetylation): 通常與基因活化相關。乙醯化基團會中和組蛋白尾巴上的正電荷，降低其與帶負電荷的 DNA 之間的吸引力，使得染色質結構鬆散（常染色質），從而更容易被轉錄因子接近。

這題考查的是真核生物在轉錄後，前體信使 RNA (pre-mRNA) 經過一系列的加工修飾，最終形成成熟信使 RNA (mature mRNA) 並輸出到細胞質的過程。這是一個複雜但精確的過程，對基因表達至關重要。

真核生物的基因轉錄發生在細胞核內，產生一個初始轉錄產物，稱為前體信使 RNA (pre-mRNA) 或稱為轉錄本 (primary transcript)。這個 pre-mRNA 包含了編碼蛋白質的外顯子 (exons) 和不編碼蛋白質的內含子 (introns)。在 pre-mRNA 被輸出到細胞質並翻譯成蛋白質之前，必須經過以下幾個關鍵的加工步驟：

1. 5' 端加帽 (5' Capping)

• 目的: 在 pre-mRNA 的 5' 端添加一個特殊的結構——7-甲基鳥苷 (7-methylguanosine, m7G) 帽。
• 機制: 在轉錄剛開始時，當 pre-mRNA 的長度約為 20-40 個核苷酸時，一個特殊的酶複合物會催化一個鳥苷核苷酸 (GTP) 以一個反常的 5'-5' 三磷酸鍵連接到 pre-mRNA 的 5' 端。隨後，這個鳥苷的 7 位氮原子和相鄰的核糖的 2' 位氧原子會被甲基化。
• 功能:
  - 保護: 保護 5' 端免受 5'→3' 外切核酸酶的降解。
  - 識別: 幫助核糖體識別 mRNA 的 5' 端，並啟動翻譯（作為核糖體結合位點的一部分）。
  - 運輸: 參與 mRNA 從細胞核運輸到細胞質的過程。
  - 剪接: 影響 pre-mRNA 的剪接過程。

2. 3' 端加聚腺苷酸尾 (3' Polyadenylation)

• 目的: 在 pre-mRNA 的 3' 端添加一個由約 50-250 個腺苷酸 (adenosine) 組成的聚腺苷酸尾 (poly(A) tail)。
• 機制:
  - 轉錄產物中包含一個特定的信號序列，稱為聚腺苷酸信號 (polyadenylation signal)，通常是 AAUAAA。
  - 一些蛋白質因子（如 CPSF - cleavage and polyadenylation specificity factor, CstF - cleavage stimulation factor）識別這個信號，並招募其他因子，在該信號序列下游約 10-30 個核苷酸處切割 pre-mRNA。

這題考查的是 CRISPR-Cas9 系統的工作原理，該系統已成為一種強大的基因編輯工具。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 最初是細菌和古細菌的一種適應性免疫系統，用於抵抗病毒和質粒。

CRISPR-Cas9 系統的核心是一個 Cas9 核酸酶和一個引導 RNA (guide RNA, gRNA)。這個系統能夠精確地切割 DNA，從而實現基因的敲除（knockout）、插入（insertion）或替換（replacement）。

CRISPR-Cas9 系統的工作原理:

1. Cas9 核酸酶: Cas9 是一種 DNA 內切酶，它能夠切割雙鏈 DNA。它有兩個關鍵的核酸酶結構域 (RuvC 和 HNH)，分別負責切割 DNA 的兩條鏈。Cas9 本身無法識別目標 DNA 序列，它需要一個引導 RNA 來定位。

2. 引導 RNA (guide RNA, gRNA): 在基因編輯應用中，通常使用一個人工設計的單一分子引導 RNA (single guide RNA, sgRNA)，它結合了 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA) 的功能。

   • crRNA 部分: 包含一個約 20 個核苷酸的「間隔序列」(spacer sequence)，這個序列是與目標 DNA 序列互補的。它是 CRISPR-Cas9 系統能夠識別並結合到特定 DNA 位點的關鍵。
   • tracrRNA 部分: 提供一個支架結構，能夠與 Cas9 蛋白質結合，並協助 crRNA 的定位。

3. PAM 序列 (Protospacer Adjacent Motif): Cas9 蛋白質在結合到目標 DNA 並切割之前，還需要識別一個短的、位於目標序列下游的特定 DNA 序列，稱為 PAM 序列。PAM 序列對於 Cas9 的結合和切割是必需的。不同的 Cas 蛋白識別不同的 PAM 序列（例如，最常用的 Streptococcus pyogenes Cas9 識別 5'-NGG-3' 序列，其中 N 代表任意核苷酸）。PAM 序列的存在確保了 CRISPR 系統只切割外源 DNA，而不切割自身的 CRISPR 基因座。

基因編輯過程:

1. 複合物形成: sgRNA 與 Cas9 蛋白質結合，形成一個功能性的 CRISPR-Cas9 複合物。
2. 目標識別: CRISPR-Cas9 複合物在細胞核內搜尋 DNA。