112 年 國立臺灣大學植物科學系碩士班《分子生物學（A）》

這題考的是大腸桿菌 (E. coli) 的錯配修復系統 (Mismatch Repair, MMR)。MMR 系統是細胞在 DNA 複製過程中，辨識並校正 DNA 鏈上錯誤配對鹼基（錯配）的重要機制。

MMR 系統的核心組成包括幾個蛋白質，在 E. coli 中主要是 MutS, MutL, 和 MutH 蛋白質。

1. 辨識錯配 (Mismatch Recognition)：MutS 蛋白質負責辨識 DNA 鏈上的鹼基錯配，例如 A:T 錯配成 A:G 或 C:T 等。MutS 會與錯配點結合。
2. 啟動修復 (Initiation of Repair)：一旦 MutS 辨識並結合了錯配，它會招募 MutL 蛋白質。MutL 接著會與 MutH 蛋白質互動。
3. 辨識未甲基化鏈 (Identification of the Unmethylated Strand)：E. coli 的 DNA 在複製時，親代鏈 (parental strand) 已經過甲基化 (methylation)，而新合成的子代鏈 (daughter strand) 在剛複製完成時是未甲基化的。這個甲基化狀態的差異是 MMR 系統區分錯配發生在哪條鏈上的關鍵。MutH 蛋白質是一個內切酶 (endonuclease)，它能辨識 DNA 上的 GATC 序列，並在該序列的未甲基化鏈上進行切割 (nick)。

這題考的是大腸桿菌 (E. coli) 中 Dam 甲基酶 (Dam methylase) 在染色體複製調控中的作用。Dam 甲基酶負責將腺嘌呤 (Adenine, A) 在 GATC 序列的 N6 位置加上甲基。這個甲基化修飾在 E. coli 的許多生理過程中扮演重要角色，其中之一就是染色體複製的起始調控。

Dam 甲基酶在染色體複製調控中的主要機制與 起始複製點 (Origin of replication, oriC) 有關。

1. oriC 的甲基化狀態：oriC 區域富含 GATC 序列。在 E. coli 細胞週期中，oriC 的甲基化狀態會週期性地變化。當 Dam 甲基酶將 oriC 區域的 GATC 序列甲基化後，oriC 就能夠與 DNA 複製起始相關的蛋白質複合物結合，從而啟動複製。
2. 抑制重複複製 (Prevention of re-replication)：在 DNA 複製完成後，oriC 區域的子代鏈是未甲基化的。此時，oriC 會與 SeqA 蛋白質結合。

SOS 響應 (SOS response) 是細菌（特別是大腸桿菌 E. coli）在面臨嚴重的 DNA 損傷時所誘導的一種複雜的基因調控網絡。當細胞暴露於紫外線、化學誘變劑等會造成 DNA 大量損傷的環境時，SOS 響應就會被啟動。

SOS 響應的主要特點和機制如下：

1. 誘導物 (Inducer)：DNA 損傷，特別是單鏈 DNA 的產生，會激活 RecA 蛋白質。RecA 蛋白質是一種重要的蛋白質，它在 DNA 重組和修復中起作用。當 RecA 結合到單鏈 DNA 上時，會觸發其構象變化，使其獲得蛋白酶活性。
2. 調控蛋白 (Regulatory Protein)：LexA 蛋白質是 SOS 響應的關鍵負調控因子。LexA 蛋白質作為一個阻遏蛋白 (repressor)，結合在 SOS 響應相關基因（包括自身 LexA 基因）的啟動子區域，抑制這些基因的轉錄。
3. RecA 的激活與 LexA 的降解：當 RecA 結合單鏈 DNA 並獲得蛋白酶活性後，它會去切割 LexA 蛋白質。LexA 被切割後，其抑制基因轉錄的功能就喪失了。
4. SOS 基因的表達：LexA 被降解後，原本被抑制的 SOS 相關基因得以表達。這些基因編碼的蛋白質在 DNA 修復、損傷檢查點控制以及突變產生等方面發揮作用。
5. SOS 基因的例子：
   • UvrA, UvrB, UvrC, UvrD: 參與核苷酸切除修復 (Nucleotide Excision Repair, NER) 的蛋白質，負責切除 DNA 損傷。

這題考的是 ColE1 質體 (plasmid) 的複製調控機制。ColE1 是一種常見的細菌質體，其複製不需要宿主細胞的 DNA 聚合酶 III 的 3'→5' 外切酶活性，並且可以與宿主染色體複製同時進行，具有較高的拷貝數。其複製調控機制是通過 RNA 分子和蛋白質相互作用來實現的。

ColE1 質體的複製過程涉及以下幾個關鍵組件：

1. 起始位點 (Origin of Replication, oriV)：位於質體 DNA 上，是複製起始的地方。
2. RNAII (primer RNA)：一個約 550 個核苷酸的 RNA 分子，由 oriV 啟動子啟動轉錄。RNAII 的 3' 端具有一個游離的 3'-OH 基團，可以作為 DNA 聚合酶的起始點。
3. RNAI (inhibitory RNA)：一個約 107 個核苷酸的短 RNA 分子，由另一個啟動子轉錄。RNAI 與 RNAII 在序列上有部分互補區域。
4. Rom (Replication Origin Modulator) 蛋白質：一個質體編碼的小蛋白質，它能促進 RNAI 和 RNAII 之間的雜合 (hybridization)。

複製調控機制：

• 複製起始 (Initiation of Replication)：

  • RNAII 的轉錄在 oriV 區域開始。當 RNAII 的長度達到約 300-400 個核苷酸時，它的 3' 端會暴露出來，並與宿主細胞的 DNA 聚合酶 III 結合，啟動 DNA 的合成，即 RNAII 作為引物 (primer) 開始合成 DNA。
  • 這個過程是濃度依賴性的。只有當 RNAII 的濃度足夠高，能夠與 DNA 聚合酶有效結合時，複製才會啟動。

• 複製抑制 (Inhibition of Replication)：

  • RNAI 的作用是抑制 RNAII 作為引物的形成。

這題考的是小干擾 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA) 以及 RNA 干擾 (RNAi) 的概念。這些都是在真核生物中發現的非編碼 RNA (non-coding RNA) 分子，在基因表達調控中扮演重要角色，尤其是在轉錄後水平。

1. RNAi (RNA interference)：

   • 定義：RNAi 是一種普遍存在於真核生物中的基因沉默機制，通過雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 來抑制特定基因的表達。
   • 機制：當細胞內存在外源性 dsRNA（例如病毒感染或實驗引入）或內源性 dsRNA 時，它會被一種稱為 Dicer 的酶切割成短的 dsRNA 片段（約 21-25 個核苷酸）。
   • 這些短 dsRNA 片段隨後與 RISC (RNA-induced silencing complex) 複合物結合。
   • 在 RISC 複合物內，其中一股 RNA 鏈（通常是較不穩定的一股）被降解，另一股 RNA 鏈（稱為引導鏈, guide strand）保留下來。
   • 引導鏈隨後引導 RISC 複合物識別並結合到與其序列互補的 mRNA 分子上。
   • 結合後，RISC 複合物中的 Argonaute 蛋白質（通常是 Ago2）會切割 mRNA，導致其降解，從而實現基因沉默。
   • RNAi 也可以通過影響染色質結構來調控轉錄水平（稱為 TGS, transcriptional gene silencing），但最常見的是在轉錄後水平 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)。

2. siRNA (small interfering RNA)：

   • 來源：siRNA 通常是長鏈的 dsRNA 被 Dicer 切割產生的。這些長鏈 dsRNA 可以來自外源性來源（如病毒 RNA、實驗引入的 dsRNA）或內源性來源（如轉座子、重複序列）。
   • 功能：siRNA 主要參與 RNAi 途徑，用於沉默與其序列完全互補的 mRNA。它在植物、線蟲等生物中對抵抗病毒感染和維持基因組穩定性尤為重要。

這題考的是大腸桿菌 (E. coli) 中細胞隔膜 (septum) 的形成與定位控制。細胞隔膜形成是細菌二分裂 (binary fission) 過程中的關鍵步驟，確保子細胞能夠分離。這個過程涉及複雜的蛋白質組裝和細胞骨架的協同作用。

細胞隔膜形成和定位控制的核心機制是通過一個稱為 細胞分裂複合體 (Divisome) 的蛋白質機器來實現的。這個複合體的組裝和定位受到嚴格調控。

1. 細胞分裂位點的決定 (Determination of Division Site)：

   • Min 系統：E. coli 的 Min 系統（MinC, MinD, MinE）是決定細胞分裂位點的關鍵。MinC 是一種細胞質蛋白，它能抑制 FtsZ 的聚合。MinD 是一個 ATP 結合蛋白，它與細胞膜結合，並將 MinC 招募到細胞膜上。MinE 則負責將 MinD 和 MinC 定位到細胞兩極。
   • MinD-ATP 會與細胞膜結合，並將 MinC 帶到細胞膜。MinE 則將 MinD-ATP-MinC 複合物定位到細胞的兩極。
   • 在長形細胞中，MinC 團隊在細胞兩極形成一個「巡邏」的濃度梯度，在細胞中間部位的濃度最低。
   • SlmA 蛋白質：在某些情況下，SlmA 蛋白質也會參與調控。SlmA 結合到細胞的兩端，阻止 FtsZ 在細胞兩端聚合。
   • 結果：Min 系統和 SlmA 確保了細胞分裂的起始點只會出現在細胞的中間區域，而不是兩端，從而保證了細胞能夠均勻地分裂成兩個大小相似的子細胞。

2. 細胞分裂複合體 (Divisome) 的組裝與功能：

   • FtsZ 蛋白質：FtsZ 是細菌細胞骨架中最重要的組分，類似於真核生物的微管蛋白 (tubulin)。FtsZ 在細胞分裂的中間區域聚合形成一個環狀結構，稱為 Z 環 (Z-ring)。Z 環是細胞隔膜形成的核心骨架。
   • 招募其他組分：Z 環的形成是招募其他細胞分裂相關蛋白質的第一步，這些蛋白質共同組成了細胞分裂複合體 (Divisome)。

這題考的是 DNA 複製和延伸過程中，3'-OH 基團的重要性，以及在引物反應 (priming reaction) 中提供 3'-OH 的三種不同方式。

3'-OH 基團的重要性：
DNA 聚合酶在合成新的 DNA 鏈時，總是將一個新的脫氧核苷酸 (dNTP) 加到現有 DNA 鏈的 3' 端羥基 (3'-OH) 上。這個 3'-OH 基團是親核進攻 (nucleophilic attack) 的位點，它會進攻新加入的 dNTP 的 α-磷酸鍵，形成磷酸二酯鍵 (phosphodiester bond)，並釋放出焦磷酸 (pyrophosphate, PPi)。沒有 3'-OH 基團，DNA 聚合酶就無法添加下一個核苷酸，DNA 鏈的延伸就會停止。

在引物反應中提供 3'-OH 的三種方式：
DNA 聚合酶不能從頭開始合成 DNA，它需要一個引物 (primer) 來提供起始的 3'-OH 基團。引物可以是由 RNA 或 DNA 組成。以下是三種提供 3'-OH 的方式：

1. RNA 引物 (RNA Primer)：

   • 機制：這是細菌和真核生物 DNA 複製中最常見的方式。由一種特殊的 RNA 聚合酶（在細菌中是 Primase，在真核生物中是 DNA 聚合酶 α 輔助的 Primase 複合物）合成一小段 RNA 引物。
   • 提供 3'-OH：RNA 引物的一端（通常是 3' 末端）帶有游離的 3'-OH 基團，DNA 聚合酶（如 DNA Pol III 或 Pol δ/ε）可以識別並結合到 RNA 引物的 3'-OH 上，開始合成 DNA 鏈。
   • 後續處理：在 DNA 複製過程中，RNA 引物最終會被 DNA 聚合酶 I (E. coli) 或 RNase H 和 DNA 聚合酶 δ (真核生物) 移除，並由 DNA 聚合酶填補空缺。

2. DNA 引物 (DNA Primer)：

   • 機制：在某些情況下，DNA 也可以作為引物。例如，在某些病毒的 DNA 複製中，或者在某些修復過程中，可以使用現有的 DNA 片段作為引物。
   • 提供 3'-OH：如果現有的 DNA 片段是一個獨立的分子，其 3' 末端也帶有游離的 3'-OH 基團，DNA 聚合酶就可以在此處開始合成。

這題考的是大腸桿菌 (E. coli) 如何通過鹼基切除修復 (Base Excision Repair, BER) 系統來處理氧化損傷的鳥嘌呤，即 8-氧鳥嘌呤 (8-oxoguanine, oxoG)。8-oxoG 是一種常見的氧化 DNA 損傷，它容易與腺嘌呤 (A) 配對，導致 G:C 轉變為 A:T 的突變。

E. coli 的 BER 系統是一個高效的 DNA 修復通路，用於移除和修復多種 DNA 損傷，包括氧化損傷。處理 8-oxoG 的 BER 過程如下：

1. 辨識和切除 8-oxoG：

   • OxyR 系統：在 E. coli 中，對氧化損傷的應答首先由 OxyR 蛋白質調控。OxyR 是一個轉錄因子，在還原型狀態下是失活的，但在氧化壓力下被氧化，變成激活態。激活的 OxyR 會促進一系列抗氧化基因的表達，包括參與 BER 的基因。
   • 8-oxoguanine DNA glycosylase (MutM / OGG1)：在 E. coli 中，最主要的負責辨識和切除 8-oxoG 的是 MutM 蛋白質（也稱為 OGG1）。MutM 是一種 DNA 糖苷酶 (DNA glycosylase)，它能辨識 DNA 鏈上的 8-oxoG，並將其從脫氧核糖上切斷，產生一個無鹼基位點 (abasic site 或 apurinic/apyrimidinic site, AP site)。
   • 其他 DNA 糖苷酶：E. coli 還有其他的 DNA 糖苷酶，如 MutY (adenine glycosylase)，它能辨識並切除與 8-oxoG 配對的腺嘌呤 (A)，這在 8-oxoG 導致 G:C 轉 A:T 突變的過程中是重要的。MutT (8-oxo-dGTPase) 則是在核苷酸池中，預防 8-oxo-dGTP 被誤併入 DNA。

2. AP 位點的處理：

   • 一旦 MutM 切除了 8-oxoG，產生了 AP 位點，接下來需要移除這個 AP 位點並重新合成 DNA。

這題考的是真核細胞中，生長因子 (Growth Factor, GF) 信號傳導通路如何促進細胞週期進展，以及其中涉及的關鍵分子：RTK, Grb2, SOS, RAS, RAF, MEK, ERK, CNK, KSR, Rb/E2F, cyclin/CDK complex。這是一個典型的 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) 信號通路與細胞週期調控的整合。

生長因子信號傳導通路促進細胞週期進展的過程如下：

1. 信號的起始：生長因子與受體酪氨酸激酶 (RTK)

   • 生長因子 (GF) 結合到細胞膜表面的受體酪氨酸激酶 (Receptor Tyrosine Kinase, RTK)。
   • RTK 結合生長因子後，會發生二聚化 (dimerization) 並激活其細胞內區域的酪氨酸激酶活性。
   • 激活的 RTK 會對其自身以及細胞內的特定底物蛋白質進行酪氨酸磷酸化 (tyrosine phosphorylation)。

2. 信號的傳遞與放大：SH2 結構域結合與 SOS 的招募

   • 磷酸化後的 RTK 成為其他信號蛋白的結合位點。
   • Grb2 是一個含有 SH2 結構域 (Src homology 2 domain) 和兩個 SH3 結構域 (Src homology 3 domain) 的適配器蛋白質 (adaptor protein)。其 SH2 結構域能夠識別並結合到 RTK 上的特定磷酸化酪氨酸殘基。
   • Grb2 的 SH3 結構域隨後結合到 SOS (Son of Sevenless) 蛋白質。SOS 是一個鳥苷酸交換因子 (Guanine nucleotide Exchange Factor, GEF)。

3. RAS 的激活：

   • SOS 蛋白質負責促進 RAS 蛋白質（一種小 GTPase）從失活的 GDP 結合狀態轉變為激活的 GTP 結合狀態。
   • RAS-GTP 是下游信號傳遞的關鍵激活分子。

4. MAPK 信號級聯 (MAPK Cascade)：

   • 激活的 RAS-GTP 結合並激活 RAF 蛋白質（一種絲/蘇氨酸激酶, Ser/Thr kinase）。
   • RAF 隨後磷酸化並激活 MEK (MAPK/ERK Kinase) 蛋白質（一種酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸激酶）。
   • MEK 再磷酸化並激活 ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) 蛋白質（一種絲/蘇氨酸激酶）。ERK 是 MAPK 的一個主要成員。

5. 支架蛋白的作用 (Scaffolding Proteins)：

   • CNK (Cellular node kinase) 和 KSR (Kinase Suppressor of Ras) 是支架蛋白質。

這題考的是保守性非同源末端連接 (Non-Homologous End Joining, NHEJ) 機制。NHEJ 是真核細胞中修復雙鏈斷裂 DNA (Double-Strand Break, DSB) 的主要途徑之一，特別是在 G1 期。它不依賴同源模板，而是直接將斷裂的 DNA 兩端連接起來。

NHEJ 機制的關鍵步驟如下：

1. DSB 的偵測與結合 (DSB Detection and Binding)：

   • 當細胞偵測到雙鏈斷裂時，首先會招募一個蛋白質複合物，稱為 Ku 蛋白質複合物 (Ku70/Ku80 異二聚體)。
   • Ku 蛋白質能辨識並結合到 DNA 的斷裂末端，它像一個環一樣套住 DNA 斷裂處，起到保護和穩定斷裂末端的作用。

2. 招募核酸外切酶和聚合酶 (Recruitment of Nucleases and Polymerases)：

   • Ku 蛋白質的結合會招募其他關鍵的 NHEJ 因子，其中最重要的是 DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)。
   • Ku 和 DNA-PKcs 共同構成了一個激活的 DNA-PK 複合物。
   • 根據斷裂末端的性質（是平末端、黏末端或帶有損傷），可能還會招募核酸外切酶 (nucleases) 和 DNA 聚合酶 (polymerases)。
     • 核酸外切酶（如 Artemis, Exo1）可以移除斷裂末端的突起 (overhangs) 或損傷的核苷酸，使末端變得更加「乾淨」，便於連接。
     • DNA 聚合酶（如 Pol μ, Pol λ）可以填補斷裂末端產生的缺口 (gaps)。

3. 末端加工 (End Processing)：

   • 在招募了核酸外切酶和聚合酶後，斷裂的 DNA 末端可能會經過「加工」過程，以準備連接。
   • 這個加工過程可能包括：移除突起部分、填補缺口、以及在某些情況下進行少量的鹼基添加。
   • 這一步是 NHEJ 可能引入插入或缺失突變 (indels) 的主要原因，尤其是在 V(D)J 重組等過程中。

4. DNA 連接 (DNA Ligation)：

   • 一旦斷裂末端被加工成合適的狀態（通常是鈍末端或輕微的黏末端），DNA 連接酶 IV (Ligase IV) 就被招募到斷裂位點。

這題考的是真核細胞核中的染色質結構，特別是常染色質 (Euchromatin)。

定義：
常染色質 (Euchromatin) 是指細胞核內相對鬆散、去凝集 (decondensed) 的染色質區域。與異染色質 (heterochromatin) 相對，常染色質在光學顯微鏡下染色較淺，並且在細胞週期的間期 (interphase) 處於活躍的轉錄狀態。

結構特徵：

• 鬆散結構：常染色質的 DNA 纏繞在組蛋白 (histones) 周圍形成的核小體 (nucleosome) 結構相對鬆散，DNA 鏈更容易暴露。
• 低甲基化：通常，常染色質區域的 DNA 甲基化程度較低。
• 組蛋白修飾：組蛋白尾部（histone tails）通常發生乙醯化 (acetylation) 等修飾，這些修飾會減弱組蛋白與 DNA 之間的靜電吸引力，進一步促進染色質的鬆散化。例如，組蛋白乙醯化 (histone acetylation) 是一個標誌性的常染色質特徵。
• 富含基因：常染色質區域通常包含活躍轉錄的基因，因此它在基因表達中起著關鍵作用。

這題考的是核酶 (Ribozyme)。核酶是指具有催化活性的 RNA 分子。這個概念顛覆了過去認為只有蛋白質才能作為酶的觀點。

定義：
核酶 (Ribozyme) 是指具有催化活性的 RNA 分子，能夠催化生化反應，類似於蛋白質酶。

發現與重要性：

• 1980 年代，Sidney Altman 和 Thomas Cech 分別獨立發現了核酶，他們也因此獲得了 1989 年的諾貝爾化學獎。
• 核酶的存在證明了 RNA 在生命起源過程中可能扮演了更為核心的角色（「RNA 世界」假說），因為 RNA 既能儲存遺傳信息（類似 DNA），又能催化反應（類似蛋白質酶）。

核酶的催化功能：
核酶可以催化多種生化反應，包括：

1. 自我剪切 (Self-splicing)：一些前體 RNA 分子（如 rRNA 或 tRNA 的前體）在沒有蛋白質的情況下，可以通過自身的催化活性，準確地切除內含子 (intron)，並將外顯子 (exon) 連接起來，形成成熟的 RNA 分子。這是最早發現的核酶活性之一。
2. 肽鍵形成 (Peptide bond formation)：核糖體 (ribosome) 是細胞內蛋白質合成的場所。

這題考的是 CRISPR/Cas9 系統，這是目前最廣泛應用於基因編輯的技術之一。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 和 Cas9 蛋白質共同構成了一個強大的基因組編輯工具。

CRISPR/Cas9 系統的起源：
CRISPR/Cas 系統最初是細菌和古細菌用來抵抗病毒感染的一種適應性免疫系統。當病毒入侵時，細菌會將病毒 DNA 的一小段序列（稱為 spacer）整合到其基因組的 CRISPR 區域。這些 spacer 序列與 CRISPR 區域周圍的 repeat 序列交替排列。當同一病毒再次入侵時，細菌會轉錄 CRISPR 區域，產生一個長 RNA 分子，該分子被加工成小 RNA，稱為 CRISPR RNA (crRNA)。crRNA 會與 Cas 蛋白質（如 Cas9）結合，並引導 Cas 蛋白質識別並切割病毒 DNA。

CRISPR/Cas9 系統作為基因編輯工具：
在實驗室中，科學家們將這個細菌的免疫系統轉化為一個強大的基因編輯工具，主要通過以下組件實現：

1. Cas9 蛋白質：這是一種 DNA 內切酶 (endonuclease)，能夠切割雙鏈 DNA。它需要一個 guide RNA (gRNA) 來引導其定位到目標 DNA 序列。

2. 導向 RNA (Guide RNA, gRNA)：在基因編輯應用中，通常使用一個人工設計的嵌合 RNA (chimeric RNA)，稱為單導向 RNA (single-guide RNA, sgRNA)。sgRNA 由兩部分組成：

   • crRNA 部分：包含約 20 個核苷酸的序列，這個序列是與目標 DNA 序列互補的，用於引導 Cas9 蛋白質結合到基因組的特定位置。
   • tracrRNA 部分：一個 RNA 分子，它能與 crRNA 部分結合，並與 Cas9 蛋白質結合，形成一個功能性的 RNA-蛋白質複合物。
   • 在人工設計的 sgRNA 中，crRNA 和 tracrRNA 部分被連接在一起。

3. PAM 序列 (Protospacer Adjacent Motif)：

   • Cas9 蛋白質在切割 DNA 時，除了需要 sgRNA 的引導外，還需要識別目標 DNA 序列旁邊的一個短的特定 DNA 序列，稱為 PAM 序列。

這題考的是酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) 系統。Y2H 是一種在酵母細胞中用於研究蛋白質-蛋白質相互作用 (protein-protein interaction, PPI) 的經典體內 (in vivo) 技術。

基本原理：
Y2H 系統依賴於一個轉錄因子 (transcription factor) 的結構。一個典型的轉錄因子包含兩個功能區域：

1. DNA 結合域 (DNA-Binding Domain, DBD)：負責識別並結合到目標基因的啟動子區域。
2. 激活域 (Activation Domain, AD)：負責招募 RNA 聚合酶 II 和其他轉錄輔助因子，從而啟動目標基因的轉錄。

在 Y2H 系統中，這兩個功能域被「拆開」，並分別融合到兩個不同的蛋白質上。

系統組件：

1. 誘餌蛋白質 (Bait protein)：將待研究的蛋白質（或其一部分）與 DBD 融合。
2. 獵物蛋白質 (Prey protein)：將另一個待研究的蛋白質（或其文庫）與 AD 融合。
3. 報告基因 (Reporter gene)：一個對轉錄因子活性敏感的基因，其啟動子區域包含 DBD 結合的序列。報告基因的表達可以通過檢測其產物（如酶活性、顏色變化等）來指示轉錄因子的活性。常見的報告基因包括 lacZ (β-galactosidase) 和 HIS3 (組氨酸合成酶)。

操作流程：

1. 構建載體：構建包含誘餌-DBD 融合蛋白和獵物-AD 融合蛋白的表達載體。
2. 轉化酵母：將這兩個載體同時轉化到一個酵母菌株中。這個酵母菌株本身不能合成組氨酸，並且攜帶一個以 DBD 結合位點為啟動子的報告基因。
3. 篩選：
   • 如果誘餌蛋白質和獵物蛋白質之間沒有相互作用，則 DBD 和 AD 就不會被帶到同一個啟動子區域，報告基因的轉錄就不會被激活，酵母菌將無法合成組氨酸，也無法在缺乏組氨酸的培養基上生長。
   • 如果誘餌蛋白質和獵物蛋白質存在相互作用，則它們會結合在一起，將 DBD 和 AD 帶到同一個啟動子區域。

核心觀念

本題考查真核生物 DNA 的基本包裝單位——核小體（nucleosome），以及其組成、結構與功能。核小體是染色質形成與基因表現調控的基礎，必須掌握：

• DNA 如何纏繞在組蛋白上。
• 核小體核心由哪些組蛋白構成。
• linker DNA 與組蛋白 H1 的角色。
• 核小體如何兼具 DNA 壓縮與轉錄調控功能。

解題方法

回答此名詞解釋題時，依序說明「定義 → 結構 → 功能」即可完整作答：

1. 先指出核小體是真核染色質的基本結構單位。
2. 說明其核心為組蛋白八聚體。
3. 說明約 $147$ 個鹼基對的 DNA 纏繞於核心外側約 $1.65$ 圈。
4. 補充相鄰核小體之間具有 linker DNA，H1 可協助穩定與進一步壓縮。
5. 說明核小體除了包裝 DNA，也能藉由位置、穩定性及組蛋白尾端修飾調控 DNA 的可近性與基因表現。

結構與組成

核小體的中央核心是由八個組蛋白組成的組蛋白八聚體（histone octamer），包含：

• 兩個 H2A
• 兩個 H2B
• 兩個 H3
• 兩個 H4

DNA 具有帶負電的磷酸骨架，而組蛋白富含帶正電的 lysine 與 arginine，因此 DNA 能以靜電作用吸附在組蛋白表面。約 $147$ 個鹼基對的 DNA 纏繞組蛋白八聚體約 $1.65$ 圈，形成核小體核心顆粒。

相鄰核小體之間由長度可變的 linker DNA 連接，使染色質呈現「珠串狀」排列。組蛋白 H1 稱為 linker histone，主要結合於 DNA 進出核小體的位置及 linker DNA，可穩定核小體並促進較高階的染色質壓縮。

功能與基因調控

核小體的第一項功能是將很長的 DNA 有效壓縮，使其能容納於細胞核內。核小體排列後可進一步形成更高階的染色質結構。

這題考的是 mRNA 的可變剪接 (Alternative Splicing) 以及 mRNA 剪接 (mRNA Splicing) 的過程與組件。

mRNA 可變剪接 (Alternative Splicing)：

• 定義：可變剪接是一種基因調控機制，通過在轉錄後 (post-transcriptional) 水平，從同一個初級轉錄本 (primary transcript) 中產生多種不同的成熟 mRNA 分子。
• 機制：在真核生物中，基因通常包含編碼區（外顯子, exons）和非編碼區（內含子, introns）。在 mRNA 加工過程中，內含子被移除，外顯子被連接起來。可變剪接是指，在剪接過程中，可以選擇性地保留或排除某些外顯子，或者使用不同的剪接位點，從而產生具有不同外顯子組合的 mRNA。
• 結果：由於不同的 mRNA 分子編碼的蛋白質序列可能不同（例如，包含或排除某些結構域，或者改變蛋白質的 C 端或 N 端），可變剪接大大增加了蛋白質的多樣性，使得一個基因能夠產生多種功能不同的蛋白質產物。這在發育、細胞分化和組織特異性表達中起著重要作用。

mRNA 剪接的組件與過程 (mRNA Splicing)：
mRNA 剪接是將初級轉錄本 (pre-mRNA) 中的內含子移除，並將外顯子連接起來，形成成熟 mRNA 的過程。這個過程主要在細胞核中進行，由一個複雜的蛋白質-RNA 複合物稱為剪接體 (Spliceosome) 完成。

剪接體 (Spliceosome)：
剪接體是一個動態組裝的分子機器，主要由五種小核核糖核蛋白 (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) 和其他蛋白質因子組成。

• snRNPs：每個 snRNP 由一個或多個小核 RNA (small nuclear RNA, snRNA) 和一系列蛋白質組成。主要的 snRNPs 是：
  • U1 snRNP：識別 pre-mRNA 的 5' 剪接位點 (5' splice site)。
  • U2 snRNP：識別 pre-mRNA 的分支位點 (branch point sequence)，該位點通常位於內含子內部，距 3' 剪接位點不遠。
  • U4/U6 snRNP：U4 和 U6 snRNP 形成一個複合物。U6 snRNP 在催化過程中起關鍵作用。
  • U5 snRNP：幫助連接外顯子。

剪接位點 (Splice Sites)：
內含子兩端有特定的序列標誌，稱為剪接位點：

• 5' 剪接位點 (5' splice site)：通常是 GU 序列，位於內含子的 5' 端。
• 3' 剪接位點 (3' splice site)：通常是 AG 序列，位於內含子的 3' 端。
• 分支位點 (Branch point sequence)：位於內含子內部，通常是一個富含嘧啶的區域，其中包含一個腺嘌呤 (A) 核苷酸，這個 A 的 2'-OH 基團將作為內含子環化反應的親核進攻點。

這題考的是表觀遺傳繼承 (Epigenetic Inheritance) 以及與表觀遺傳調控相關的染色質修飾。

表觀遺傳繼承 (Epigenetic Inheritance)：

• 定義：表觀遺傳繼承是指遺傳信息在不改變 DNA 序列本身的基礎上，通過細胞分裂（有絲分裂）或世代間遺傳（減數分裂）傳遞下去的現象。這些遺傳信息可以影響基因的表達模式，從而導致表型上的差異。
• 機制：表觀遺傳信息通常以染色質結構的形式存在，包括 DNA 甲基化、組蛋白修飾以及非編碼 RNA。這些分子標記可以被精確地複製和傳遞到子細胞或後代中。
• 重要性：表觀遺傳繼承在細胞分化（例如，決定一個幹細胞分化為神經細胞或肌肉細胞）、基因沉默、X 染色體失活、印跡基因 (imprinted genes) 的表達以及對環境因素的響應等方面都發揮著至關重要的作用。

與表觀遺傳調控相關的染色質修飾：
表觀遺傳調控主要依賴於對染色質結構的改變，這些改變影響了 DNA 的可及性，從而調控基因的轉錄。主要的染色質修飾包括：

1. DNA 甲基化 (DNA Methylation)：

   • 機制：在哺乳動物細胞中，DNA 甲基化主要發生在胞嘧啶 (cytosine, C) 的 C5 位置，通常在 CpG 二核苷酸序列中（即一個 C 後面緊跟一個 G）。這個過程由 DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferases, DNMTs) 催化。
   • 作用：通常情況下，CpG 區域的 DNA 甲基化與基因沉默相關。甲基化的 DNA 會招募甲基化 CpG 結合蛋白 (methyl-CpG-binding proteins, MBDs)，這些蛋白進一步招募組蛋白去乙醯化酶 (HDACs) 和其他抑制性蛋白質複合物，導致染色質凝集，抑制基因轉錄。
   • 繼承：在 DNA 複製過程中，現有的甲基化模式可以被「半甲基化」地傳遞到子代 DNA 鏈上，然後通過 DNMTs 的維持活性 (maintenance methylation) 來確保甲基化模式的穩定繼承。

2. 組蛋白修飾 (Histone Modifications)：

   • 組蛋白（特別是其 N 端尾部）可以發生多種化學修飾，這些修飾被稱為「組蛋白密碼」(histone code)。這些修飾會改變組蛋白與 DNA 的相互作用，以及招募其他蛋白質，從而影響染色質的結構和基因表達。
   • 常見的組蛋白修飾包括：
     • 乙醯化 (Acetylation)：主要發生在組蛋白賴氨酸 (lysine) 殘基上，由組蛋白乙醯轉移酶 (Histone Acetyltransferases, HATs) 催化，通常與基因激活相關。乙醯化會中和組蛋白尾部的正電荷，減弱其與帶負電荷的 DNA 的結合，使染色質鬆散化，有利於轉錄。

這題考的是原核生物 (Prokaryotic) 和真核生物 (Eukaryotic) 轉錄起始 (transcription initiation) 的區別。轉錄是將 DNA 信息轉錄為 RNA 的過程，其起始階段是調控的關鍵。

以下從幾個方面比較兩者的差異：

1. 細胞內定位 (Subcellular Localization)：

   • 原核生物：原核細胞沒有核膜，DNA 位於細胞質的核區 (nucleoid)。轉錄和翻譯是耦合的 (coupled)，即 RNA 合成後，核糖體可以立即在其 5' 端開始翻譯，無需 RNA 加工。因此，轉錄起始發生在細胞質中。
   • 真核生物：真核細胞有核膜，DNA 位於細胞核內。轉錄發生在細胞核內，而翻譯發生在細胞質中。因此，轉錄起始發生在細胞核內，產生的 pre-mRNA 需要經過進一步加工（剪接、加帽、加尾）後才能輸出到細胞質進行翻譯。

2. RNA 聚合酶 (RNA Polymerase)：

   • 原核生物：只有一種 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 負責所有類型的 RNA（mRNA, tRNA, rRNA）的轉錄。該聚合酶由核心酶 (core enzyme) 和σ因子 (σ factor) 組成。σ因子負責識別啟動子區域，將核心酶引導到正確的起始位點。
   • 真核生物：有多種 RNA 聚合酶，每種負責轉錄不同類型的 RNA。
     • RNA 聚合酶 I (Pol I)：主要轉錄 rRNA。
     • RNA 聚合酶 II (Pol II)：主要轉錄 mRNA 和一些小核 RNA (snRNA)。這是研究最多的，也是最複雜的。
     • RNA 聚合酶 III (Pol III)：主要轉錄 tRNA 和 5S rRNA。

3. 啟動子結構 (Promoter Structure)：

   • 原核生物：啟動子相對簡單，通常包含兩個核心順序：-10 順序 (Pribnow box, TATAAT) 和 -35 順序 (TTGACA)。σ因子會識別這兩個順序。
   • 真核生物 (Pol II)：啟動子結構複雜得多，通常包含多個順序元件。
     • 核心啟動子 (Core promoter)：包含 TATA box (通常在 -25 到 -30 bp 處)，以及 INR (Initiator element, 在 +1 位點附近)。
     • 近端啟動子 (Proximal promoter)：包含一些增強子順序 (enhancer elements)，距離轉錄起始點不遠。
     • 遠端增強子/沉默子 (Distal enhancers/silencers)：可能位於離啟動子很遠的位置，通過 DNA 迴路 (DNA looping) 與轉錄複合物相互作用。