108 年 國立臺灣大學植物科學系碩士班《分子生物學（A）》

本大題主要考驗學生對分子生物學中重要名詞的理解與解釋能力。

1. Nick translation:
   此技術是一種在實驗室中標記 DNA 的方法。它利用 DNA 聚合酶 I (DNA polymerase I) 的 5' to 3' 外切酶活性，移除 DNA 鏈上的一個核苷酸，然後同時以新的標記核苷酸 (如放射性標記的 dNTPs) 填補該位置，進而沿著 DNA 鏈進行標記。這個過程會產生一個「nick」 (斷裂點)，並從此點向一個方向進行核苷酸的替換。
   【答案】一種利用 DNA 聚合酶 I 的外切酶活性移除 DNA 上的核苷酸，並同時以標記核苷酸填補的 DNA 標記技術。

2. Glycosylase and AP endonuclease 1 (APE1):

   • Glycosylase (DNA 醣苷酶): 這是 DNA 修復酶家族中的一員，負責催化 DNA 鹼基與脫氧核糖之間的 N-醣苷鍵的水解，移除受損或變異的鹼基。這個過程是鹼基切除修復 (Base Excision Repair, BER) 的第一步。
   • AP endonuclease 1 (APE1): 在鹼基切除修復 (BER) 路徑中，移除鹼基後會留下一個無鹼基的嘧啶核苷酸 (apurinic/apyrimidinic site, AP site)。APE1 負責切斷 AP site 的磷酸二酯鍵，在核糖磷酸骨架上產生一個 3'-OH 末端和一個 5'-磷酸末端，為後續的 DNA 聚合酶填補核苷酸和 DNA ligase 連結斷裂點提供條件。
     【答案】Glycosylase 負責移除 DNA 中受損的鹼基；APE1 負責切斷鹼基移除後產生的無鹼基位點的磷酸二酯鍵，啟動 DNA 修復。

3. DNA Ligase III and IV:
   DNA Ligase 是連接 DNA 斷裂處的關鍵酶。

   • DNA Ligase III: 在哺乳動物中，DNA Ligase III 主要參與粒線體 DNA 的修復和複製，以及體細胞 DNA 的同源重組修復。它具有 ATP 依賴性的催化機制。

本大題涵蓋分子生物學的實驗技術、細胞生物學、DNA 複製以及染色體結構等重要主題。

1. Describe how to identify the DNA binding site of transcription factor by using DNA footprinting technique in vitro (5%).
   核心觀念: DNA footprinting 是一種實驗技術，用於確定蛋白質（如轉錄因子）與 DNA 結合的精確位置。
   解題過程:
   DNA footprinting 技術的基本原理是利用 DNase I (一種核酸酶) 在 DNA 上進行隨機切割。當轉錄因子與其目標 DNA 序列結合後，會在其結合區域周圍形成一個「保護區」(footprint)，使得 DNase I 無法接近並切割該區域的 DNA。
   實驗步驟如下：
   a. 製備標記 DNA: 首先，需要一條含有潛在轉錄因子結合位點的 DNA 片段。通常會將此 DNA 片段的一端進行放射性同位素標記（例如 $^32$P 標記）。
   b. 蛋白質-DNA 結合反應: 將標記的 DNA 片段與待測的轉錄因子在適當的緩衝液中混合，使其發生結合。
   c. DNase I 消化: 在蛋白質-DNA 複合物存在的情況下，加入少量 DNase I 進行有限度的消化。DNase I 會隨機切割未被蛋白質保護的 DNA 區域。
   d. 蛋白質變性與 DNA 純化: 加入變性劑（如蛋白酶 K 或 SDS）以使轉錄因子變性，然後純化 DNA。
   e. 跑膠分離與檢測: 將消化後的 DNA 片段進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 (denaturing PAGE)，以便分離不同長度的 DNA 片段。之後，通過放射自顯影 (autoradiography) 來檢測標記的 DNA 片段。
   f. 結果判讀:
   * 對照組 (無蛋白質): 在沒有轉錄因子存在的情況下，DNase I 會隨機切割 DNA，產生一條連續的 DNA 片段大小分佈的條帶（從最大到最小）。
   * 實驗組 (有蛋白質): 在有轉錄因子存在的情況下，轉錄因子結合的區域將不會被 DNase I 切割，因此在電泳圖譜上會觀察到一個「空白區」或「腳印」(footprint)，對應於轉錄因子結合的 DNA 序列。通過比較實驗組和對照組的條帶分佈，就可以確定轉錄因子結合的 DNA 位點。
   【答案】透過將放射性標記的 DNA 與轉錄因子進行孵育，然後用 DNase I 進行有限度消化。轉錄因子結合的區域會保護 DNA 免受 DNase I 切割，在變性膠電泳和放射自顯影後，會觀察到一個特定的「腳印」，從而確定轉錄因子結合的 DNA 位點。

2. Describe the septum formation and localization control in E. coli (10%).
   核心觀念: 細菌細胞分裂時，細胞壁的隔膜 (septum) 形成是精確調控的過程，涉及多種蛋白質的協同作用，以確保細胞分裂的準確性。
   解題過程:
   在細菌（如 E. coli）中，細胞分裂是一個複雜的過程，涉及細胞膜的內陷和細胞壁的合成，最終形成兩個子細胞。這個過程的關鍵是細胞中線 (midcell) 的隔膜形成。

   • 細胞骨架和定位:
     • FtsZ: 這是細菌細胞分裂中的核心蛋白，屬於微管蛋白 (tubulin) 的同源物。FtsZ 會在細胞中線處形成一個環狀結構，稱為 Z-ring (Z-環)。Z-ring 的形成是隔膜合成的起始信號。
     • FtsA 和 ZipA: 這些蛋白質是 Z-ring 的錨定蛋白，將 Z-ring 固定在細胞膜上。FtsA 具有 ATP 酶活性，參與 Z-ring 的動態組裝。ZipA 則直接與 FtsZ 結合。
   • 隔膜形成:
     • FtsI (PBP3): 這是細菌細胞壁合成中的關鍵酶（肽聚醣結合蛋白），負責合成隔膜的細胞壁。FtsI 會招募到 Z-ring 的位置，並在 Z-ring 的指導下開始合成新的細胞壁，形成隔膜。
     • 其他 Fts 蛋白: 還有許多其他 Fts 蛋白（如 FtsQ, FtsW, FtsK 等）參與隔膜的組裝和細胞的最終分離。
   • 定位控制:
     • Min 系統: MinC, MinD, MinE 蛋白系統負責確保 Z-ring 只在細胞中線形成，而不是在細胞兩極。MinC 是一種抑制 FtsZ 聚合的蛋白，而 MinD 則將 MinC 輸送到細胞膜上。MinE 則調控 MinC/D 的定位。Min 系統在細胞兩極的濃度較高，而在細胞中線的濃度較低，從而確保 Z-ring 在中線形成。
     • Nucleoid occlusion: DNA 複製後的染色體（nucleoid）也會抑制 Z-ring 在其附近形成，進一步確保 Z-ring 形成於細胞中線。
       總結: E. coli 的隔膜形成是一個由 FtsZ 蛋白在中線形成 Z-ring，然後由 FtsA、ZipA 錨定，再招募 FtsI 等細胞壁合成酶在中線合成隔膜的過程。Min 系統和染色體定位則精確控制 Z-ring 的形成位置。
       【答案】E. coli 的隔膜形成以 FtsZ 蛋白在中線形成 Z-ring 為起始，FtsA 和 ZipA 負責錨定 Z-ring。隨後，FtsI 等細胞壁合成酶被招募至 Z-ring 位置，開始合成隔膜。Min 系統 (MinCDE) 和染色體定位則確保 Z-ring 準確形成於細胞中線。

3. Describe the factors, ORC, Cdc6, Cdt1 and MCM, require for yeast DNA replication, and the most recently knowledge on MCM activation (10%).

本大題主要考驗學生對分子生物學、生物化學及遺傳學中重要名詞的定義與理解。

1. Please explain the following terms: (20%)

   (1) Prion:
   核心觀念: Prion 是一種具有感染性的蛋白質，其本身不含核酸，但能誘導其他具有相同序列但構象不同的蛋白質發生錯誤摺疊，進而導致疾病。
   解釋: Prion (proteinaceous infectious particle) 是一種異常的蛋白質分子，它在哺乳動物中引起傳染性海綿狀腦病 (transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)，例如狂牛病 (BSE)、庫賈氏病 (CJD) 和羊搔癢症 (scrapie)。正常的細胞中也存在與 Prion 蛋白質 (PrP^C) 序列相同的蛋白質，但其三級結構不同。Prion (PrP^Sc) 能夠與 PrP^C 結合，並誘導 PrP^C 轉變為 PrP^Sc 的構象。這種錯誤摺疊的 PrP^Sc 會聚集形成不溶性的纖維狀沉澱物 (amyloid fibrils)，破壞細胞結構和功能，最終導致神經細胞死亡和腦組織的損傷。Prion 的傳播不依賴於遺傳物質（DNA 或 RNA），而是完全由蛋白質的構象傳播。
   【答案】一種不含核酸的感染性蛋白質，能誘導細胞內正常構象的同源蛋白質錯誤摺疊，形成聚集體，導致神經系統疾病。

   (2) CpG islands:
   核心觀念: CpG islands 是位於基因啟動子區域富含胞嘧啶 (C) 和鳥嘌呤 (G) 的 DNA 片段，其甲基化狀態與基因表達密切相關。
   解釋: CpG islands 是指在基因組中，一段富含胞嘧啶 (C) 和鳥嘌呤 (G) 的 DNA 片段，其中胞嘧啶經常與鳥嘌呤相鄰 (CpG dinucleotides)。在哺乳動物基因組中，CpG 二核苷酸的頻率遠低於隨機預期，因為胞嘧啶經常會發生甲基化，而甲基化的胞嘧啶容易發生脫氨基作用轉變為胸腺嘧啶 (T)，從而導致 CpG 序列的缺失。然而，約有 60-80% 的哺乳動物基因的 5' 啟動子區域（通常在基因的第一個外顯子附近）包含 CpG islands。這些 CpG islands 通常未被甲基化，並與活躍的基因表達相關。相反，當 CpG islands 被甲基化時，通常會抑制基因表達。因此，CpG islands 的甲基化狀態是表觀遺傳調控的重要標誌。
   【答案】基因啟動子區域富含 CpG 二核苷酸的 DNA 片段，其甲基化狀態通常與基因的開啟或關閉有關。

   (3) Ribozyme:
   核心觀念: Ribozyme 是一種具有催化活性的 RNA 分子，能夠像蛋白質酶一樣催化生化反應。
   解釋: Ribozyme (核酶) 是指具有酶活性的 RNA 分子。它們能夠催化各種化學反應，例如：

   • 自我剪切 (Self-splicing): 一些核酶可以催化自身 RNA 分子中的內含子 (intron) 被移除。
   • 肽鍵形成: 核糖體 (ribosome) 中的核糖體 RNA (rRNA) 具有肽酰轉移酶 (peptidyl transferase) 的活性，能夠催化氨基酸形成肽鍵，是蛋白質合成的關鍵。
   • 其他反應: 一些核酶還可以催化磷酸二酯鍵的水解、磷酸酯鍵的形成等。

本大題考驗學生對基因調控、分子生物學技術及轉錄機制的深入理解。

2. What is CRISPR/Cas9 system? Explain the differences between RNA interference (RNAi) and CRISPR/Cas9 system. (20%)
   核心觀念: CRISPR/Cas9 是一種強大的基因編輯工具，而 RNAi 是一種基因沉默機制。兩者都涉及 RNA，但作用機制和目的不同。
   解題過程:

   • CRISPR/Cas9 system:
     CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 系統最初是細菌和古細菌的一種適應性免疫系統，用於抵禦病毒感染。在基因工程應用中，它被改造為一種精確的基因編輯工具。

     • 組件:
       • Cas9 蛋白: 一種核酸酶，能夠切割雙鏈 DNA。
       • ** guía RNA (gRNA)**: 一段短的 RNA 分子，由兩部分組成：
         • CRISPR RNA (crRNA): 包含約 20 個核苷酸的序列，與目標 DNA 序列互補，負責識別並引導 Cas9 蛋白到目標 DNA 位置。
         • tracrRNA (trans-activating crRNA): 作為 Cas9 蛋白的支架，並與 crRNA 結合。在工程應用中，crRNA 和 tracrRNA 常被設計成一個單一的嵌合導向 RNA (single guide RNA, sgRNA)。
     • 作用機制: sgRNA 結合到 Cas9 蛋白上，形成一個複合物。sgRNA 的引導序列識別並結合到目標 DNA 序列上，Cas9 蛋白則在識別序列的下游（通常是 PAM 序列後方）切割雙鏈 DNA，產生 DNA 斷裂。細胞會嘗試修復這個斷裂，可以通過非同源末端連接 (NHEJ) 導致基因突變（插入或缺失），或通過同源重組 (HDR) 引入預先設計好的 DNA 模板，實現精確的基因編輯（如基因敲入、敲除或鹼基替換）。

   • RNA interference (RNAi):
     RNA interference (RNA 干擾) 是一種在真核生物中普遍存在的基因沉默機制，通過雙鏈 RNA (dsRNA) 分子來抑制特定基因的表達。

     • 組件:
       • dsRNA: 可以是外源引入的（如實驗中使用的 siRNA 或 shRNA），或內源產生的（如 microRNA, miRNA）。
       • Dicer: 一種核酸酶，將 dsRNA 切割成約 21-25 個核苷酸的小干擾 RNA (siRNA) 或 miRNA。
       • RISC (RNA-induced silencing complex): 一個包含多種蛋白質（其中關鍵的是 Argonaute, Ago 蛋白）的複合物。siRNA 或 miRNA 與 RISC 結合，形成引導鏈。
     • 作用機制: RISC 複合物通過 siRNA 或 miRNA 的引導序列，識別細胞內與之互補的 mRNA 分子。
       • 如果引導 RNA 與目標 mRNA 序列完全互補，Ago 蛋白會切割 mRNA，導致其降解。
       • 如果引導 RNA 與目標 mRNA 序列不完全互補（常見於 miRNA），則會抑制 mRNA 的翻譯，或促進 mRNA 的降解。
         RNAi 的主要功能是調節基因表達，抵抗病毒感染，以及抑制轉座子的活性。

   • RNAi 與 CRISPR/Cas9 的區別:

     特徵	RNA interference (RNAi)	CRISPR/Cas9 system
     主要作用	基因沉默 (mRNA 降解或翻譯抑制)	基因編輯 (DNA 切割，可導致基因敲除、插入、修飾)
     靶點	mRNA 分子	DNA 序列
     作用機制	Dicer 產生 siRNA/miRNA，RISC 識別 mRNA 並降解或抑制翻譯	sgRNA 引導 Cas9 識別 DNA，Cas9 切割雙鏈 DNA
     導向分子	siRNA, miRNA	sgRNA (crRNA + tracrRNA)
     核心酶	Dicer, Argonaute (Ago)	Cas9 (核酸酶)
     應用	研究基因功能，開發抗病毒藥物，基因治療 (基因沉默)	精確基因編輯，研究基因功能，基因治療 (基因修飾)
     特異性	取決於 siRNA/miRNA 與 mRNA 的互補性	取決於 sgRNA 的引導序列與目標 DNA 的互補性 (通常很高)