108 年 國立成功大學細胞生物與解剖研究所《生物化學》

本題主要考查基因表現量測的技術。基因表現量測是指分析特定基因在細胞或組織中被轉錄（transcription）的程度，進而反映出該基因的活性。常見的技術包括 Northern blot、RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)、qPCR (Quantitative PCR)、Microarray 和 RNA-Seq (RNA Sequencing)。

1. Northern Blot

• 核心觀念： 透過偵測特定 mRNA 分子的存在與量，來判斷基因的表現程度。
• 原理：
  1. 從細胞或組織中萃取總 RNA。
  2. 將 RNA 樣品進行電泳分離，依分子大小排列。
  3. 將電泳分離後的 RNA 轉移（blotting）到固態載體（如硝化纖維膜或尼龍膜）上。
  4. 使用帶有標記（如放射性同位素或螢光分子）的 DNA 或 RNA 探針（probe），與膜上對應的 mRNA 進行雜交（hybridization）。此探針序列與欲偵測的 mRNA 序列互補。
  5. 透過偵測標記的訊號強度，來定量 mRNA 的量。
• 優缺點： 可以偵測到特定大小的 mRNA，並提供 mRNA 的大小資訊；但實驗步驟較繁瑣，靈敏度相對較低，且需要較大量的 RNA 樣本。

2. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

• 核心觀念： 將 mRNA 反轉錄為 cDNA 後，再利用 PCR 技術放大並偵測特定基因表現。
• 原理：
  1. 從細胞或組織中萃取總 RNA。
  2. 利用反轉錄酶（reverse transcriptase）將 RNA 樣本中的 mRNA 反轉錄成互補 DNA (complementary DNA, cDNA)。
  3. 使用針對目標基因設計的引子（primer），以及 PCR 條件，對 cDNA 進行指數級放大。
  4. 透過電泳分析 PCR 產物的大小和量，來判斷目標基因的表現。
• 優缺點： 相較於 Northern blot，RT-PCR 更靈敏且操作較快；但無法直接得知 mRNA 的大小，且難以進行精確的定量（除非搭配定量 PCR）。

3. qPCR (Quantitative PCR)

• 核心觀念： 在 PCR 過程中即時監測 DNA 產物的累積，以精確定量 mRNA 的表現量。
• 原理：
  1. 與 RT-PCR 相同，先將 mRNA 反轉錄為 cDNA。
  2. 在 PCR 反應體系中加入螢光染劑（如 SYBR Green）或螢光標記的探針。
  3. 隨著 PCR 循環的進行，DNA 產物增加，螢光訊號也隨之增強。
  4. 利用儀器偵測螢光訊號的變化，並繪製螢光曲線。
  5. 透過計算達到特定螢光閾值（threshold cycle, Ct 值）所需的循環數，來定量起始 cDNA 的量，進而推算 mRNA 的表現量。

本題主要考查 SDS-PAGE 的原理及其應用。SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 是蛋白質生化實驗中常用的一種分離技術，用於根據蛋白質的大小（分子量）進行分離。

SDS 的作用 (Purpose of adding SDS):

SDS 是一種陰離子去污劑（anionic detergent），它在蛋白質分離中的主要作用有以下幾點：

1. 變性 (Denaturation): SDS 會破壞蛋白質的非共價鍵（如氫鍵、離子鍵、疏水性交互作用），使蛋白質的二級結構（α-helix, β-sheet）和三級結構（tertiary structure）解開，呈現出線性的多肽鏈結構。這確保了蛋白質的空間結構不會影響其電泳行為。
2. 賦予均一的電荷密度 (Uniform Charge Density): SDS 是一種帶有長鏈烷基的陰離子，它會與蛋白質結合。在足夠濃度的 SDS 存在下，每個胺基酸殘基大約會結合 1.4 個 SDS 分子，使得蛋白質的總電荷與其分子量之間形成一個近似線性的比例關係。也就是說，SDS 會掩蓋蛋白質本身原有的電荷，讓蛋白質帶上統一的負電荷，且每單位質量的蛋白質所帶的負電荷量大致相同。
3. 增加溶解度 (Increased Solubility): SDS 的兩親性（amphipathic）可以幫助溶解疏水性較強的蛋白質，防止其在電泳過程中沉澱。

何時決定是否在 PAGE 中加入 SDS (How to decide whether to include SDS in your PAGE):

是否在 PAGE 中加入 SDS，主要取決於實驗的目的以及你想要根據蛋白質的哪個特性來進行分離。

本題考查細胞凋亡（apoptosis）的誘導與調控，以及多種處理劑（C, F, N）之間的交互作用。題目提供了一個長條圖，顯示不同處理條件下細胞凋亡的百分比。我們要根據圖的數據來分析 C、F、N 這三種處理劑對細胞凋亡的影響及其交互作用。

圖表數據解讀：

首先，我們需要仔細觀察圖中的數據，了解各組處理的效果。圖中橫軸表示不同的處理組合，縱軸表示細胞凋亡的百分比（Apoptotic cells (%)）。

• Blank (對照組)：

  • Blank (-N): 約 2% 的細胞凋亡。
  • Blank (+N): 約 3% 的細胞凋亡。
  • 結論：單獨處理 N 對細胞凋亡的影響很小，幾乎沒有增加凋亡率。

• C (化合物 C)：

  • C (-N): 約 7% 的細胞凋亡。
  • C (+N): 約 14% 的細胞凋亡。
  • 結論：單獨處理 C 能輕微增加細胞凋亡（約 2% → 7%）。但與 N 共處理時，C 的誘導凋亡效果顯著增強（約 3% → 14%）。這表明 N 可能增強了 C 的促凋亡作用。

• F (化合物 F)：

  • F (-N): 約 12% 的細胞凋亡。
  • F (+N): 約 15% 的細胞凋亡。
  • 結論：單獨處理 F 能顯著增加細胞凋亡（約 2% → 12%）。與 N 共處理時，F 的凋亡誘導效果略有增加，但增幅不大（約 3% → 15%），與單獨處理 F (-N) 相比，差異不大。這表明 N 對 F 的促凋亡作用增強效果不明顯，或者說 F 本身已是強效的促凋亡劑。

• C+F (化合物 C 與 F 的組合)：

  • C+F (-N): 約 14% 的細胞凋亡。
  • C+F (+N): 約 15% 的細胞凋亡。
  • 結論：單獨處理 C+F 組合能顯著增加細胞凋亡（約 2% → 14%），效果與 C (+N) 或 F (-N) 相當。與 N 共處理時，C+F 的凋亡誘導效果沒有顯著增加（約 14% → 15%）。

交互作用分析：

根據上述數據，我們可以分析 C、F、N 之間的交互作用：

1. C 與 N 的交互作用 (Synergy between C and N):

   • 觀察 C (-N) (約 7%) 與 C (+N) (約 14%) 的比較，以及 Blank (-N) (約 2%) 與 Blank (+N) (約 3%) 的比較。
   • N 單獨處理對凋亡影響不大。
   • C 單獨處理能誘導凋亡。
   • C 與 N 共處理時，凋亡率從約 7% 顯著提升到約 14%，增幅非常大。這表明 N 顯著增強了 C 的促凋亡活性。這種效應可能稱為「協同作用」（synergism），即兩者聯合使用的效果大於各自獨立使用的效果之和。

2. F 與 N 的交互作用 (Effect of N on F):

   • 觀察 F (-N) (約 12%) 與 F (+N) (約 15%) 的比較。
   • N 單獨處理對凋亡影響不大。