114 年 國立臺灣大學植物病理與微生物學系碩士班甲組《植物病理學》

此題為名詞解釋與植物病害基本知識的綜合題，旨在測驗考生對植物病原體、病害名稱、傳播方式、病徵以及病害防治難易度的基本理解。

1. 名詞解釋：

(1) Viroid
Viroid 是一種比病毒更小的感染性病原體，由單股環狀 RNA 所組成，沒有蛋白質外殼。它們僅能透過機械損傷或種子、花粉傳播，並在植物宿主細胞內複製，干擾宿主生理代謝而引起病徵。代表性的例子有馬鈴薯 સ્પિન્ડલ ટ્યુબર વાયરોઇડ (Potato spindle tuber viroid, PSTVd)。

(2) Ti plasmid
Ti plasmid (Tumor-inducing plasmid) 是一種存在於土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) 中的質體。它含有能將部分 DNA 片段 (T-DNA) 轉移到植物基因組中的基因，從而誘導植物產生腫瘤，引起冠癭病 (crown gall disease)。Ti plasmid 在植物分子生物學研究中，是重要的基因載體。

(3) Sigatoka disease
Sigatoka disease，又稱香蕉黑星病或香蕉葉斑病，是一種由真菌 Mycosphaerella fijiensis (或 Pseudocercospora fijiensis) 引起對香蕉和芭蕉造成嚴重危害的葉部病害。其特徵為葉片出現長條狀的褐色至黑色病斑，嚴重時會導致葉片枯萎、產量和品質下降。

(4) Endemic
Endemic (地方性流行) 指一種疾病或病原體在特定地理區域或人群中持續存在，其發生率相對穩定，但通常不會造成大規模的爆發。例如，某種病原菌可能在某個溫暖潮濕的地區常年存在，但僅在特定季節或條件下對作物造成影響。

(5) Phyllody
Phyllody (花變葉化) 是一種植物病徵，指花器官（如花瓣、雄蕊、雌蕊）發育異常，轉變為類似葉片的結構。這種異常通常是由於植物受到類菌原體 (phytoplasma) 或某些病毒的感染所引起，干擾了植物正常的開花發育。

2. 柑橘黃龍病 (Citrus huanglongbing, HLB)：

• 病原學名： 柑橘黃龍病是由一種稱為「類菌原體」(Candidatus Liberibacter spp.) 的細菌引起。目前已確定有三個主要亞種：Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)、Candidatus Liberibacter africanus (CLaf) 和 Candidatus Liberibacter americanus (CLam)。

此題組圍繞著植物病原細菌 Ralstonia solanacearum 的分類學與其相關概念，並延伸至細菌性病害的病徵。題目涵蓋了傳統分類單位、分子分類方法、新興的 Pangenome 概念，以及具體的病害病徵。

1. Race 的分類依據：

• 定義： 在植物病原細菌和真菌中，race (或稱 biotype) 通常是根據其對不同寄主植物品種的寄生性或致病性差異來區分的。換句話說，不同的 race 對於同一種作物，但不同基因型的品種，會表現出不同的感染能力或引起的病徵。
• 舉例：
  • 植物病原細菌： Xanthomonas 屬的許多種類，例如引起辣椒瘡痂病 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 的細菌，就常用 race 來區分其對不同辣椒品種的致病性。
  • 植物病原真菌： 小麥的條紋銹病菌 (Puccinia striiformis)，其不同的 race 對不同小麥品種的抗性反應差異很大，是重要的分類依據。

2. Species complex 的分類依據：

• 定義： Species complex (種複合群) 指的是一群形態上相似、難以區分的微生物，但實際上它們在遺傳上、生態上或寄主範圍上存在差異。這些差異可能足以將它們視為不同的物種，但由於形態學上的相似性，或者由於研究的不足，它們被歸為一個複合群。分類上通常會結合形態學、生理生化特性、寄主範圍，以及最重要的，分子生物學（如基因序列比對）來進行區分。
• 舉例：
  • 植物病原細菌： Pseudomonas syringae 是一個典型的 species complex。它包含許多不同的致病變種 (pathovars)，例如 P. syringae pv. tomato (番茄瘡痂病菌) 和 P. syringae pv. lachrymans (瓜類露水病菌)，雖然都屬於 P. syringae，但寄主和病害不同。
  • 植物病原真菌： Colletotrichum 屬，包含許多引起炭疽病的種類，也常被視為一個 species complex，其內部的不同物種需要藉由分子標記來區分。

3. 基因序列用於分類的基因：

• 細菌： 在細菌分類學中，最常用來進行基因序列分析的是 16S 核糖體 RNA (16S rRNA) 基因。這是因為 16S rRNA 基因在細菌中普遍存在、功能保守，但其序列又包含足夠的變異區域，能夠反映物種間的親緣關係。
• 真菌： 在真菌分類學中，常用來進行基因序列分析的基因包括：
  • 核糖體 RNA (rRNA) 基因： 尤其是 18S rRNA 基因 (真核生物的同源物，相當於細菌的 16S rRNA) 和 28S rRNA 基因。
  • 核糖體蛋白質基因。
  • ** ITS (Internal Transcribed Spacer) 區域**：位於 18S 和 28S rRNA 基因之間的非轉錄區，變異速度較快，對於區分近緣物種特別有用。

4. Pangenome 的概念：

• Pangenome 的定義： Pangenome (全基因組) 指的是一個物種或細菌群體中，所有個體所擁有的全部基因集合。它包含了核心基因組 (core genome) 和輔助基因組 (accessory genome) 兩部分。核心基因組是群體中所有個體都共有的基因，通常負責基本生命功能；輔助基因組則是在群體中部分個體才存在的基因，這些基因往往與適應特殊環境、獲得新的代謝能力或毒力因子有關。
• Open vs. Closed Pangenome 的生物學意義：
  • Open Pangenome (開放式全基因組)： 指的是隨著採樣的新個體增加，全基因組的規模會不斷擴大，不斷發現新的基因。這表示該物種的基因交流非常活躍，或者存在許多獨特的基因，適應性強，能夠快速演化和適應新環境。

此題組主要探討植物對病原體的抗性機制，包括抗性反應類型、先天免疫系統，以及植物次級代謝產物和病原菌毒素的作用。

1. 植物對病原感染的抗性反應類型：

植物對病原體的抗性反應可以分為幾種類型，主要與病原體是否被識別以及識別後引發的反應強度有關。常見的類型包括：

• 易感性 (Susceptibility)： 植物無法有效識別病原體，或者識別後反應不足，導致病原體能夠順利侵入、定殖並引起病害。這是最常見的反應。
• 抗性 (Resistance)： 植物能夠有效識別病原體，並啟動一系列防禦反應，阻止或延緩病原體的生長和繁殖，從而限制病害的發生。抗性反應可以是：
  • 非誘導抗性 (Non-host Resistance)： 這是指一種植物對絕大多數不同類型的病原體都具有的廣譜抗性。這種抗性通常是基於植物細胞結構的物理屏障、缺乏對病原體生長必需的營養物質，或者植物產生了對廣譜病原體都有效的防禦物質。
  • 誘導抗性 (Induced Resistance)： 指植物在受到一次（通常是弱的或無害的）刺激（如微生物、化學物質、或非致病性微生物）後，其對後續病原體感染的抗性水平提高。這是一種後天獲得的、系統性的抗性，可以分為：
    • 系統獲得抗性 (Systemic Acquired Resistance, SAR)： 由病原體感染（通常是局部感染）觸發，並通過植物體內的信號傳導（如水楊酸信號）在整個植株範圍內誘導的抗性。SAR 通常對廣譜的病原體有效，並且是長效的。
    • 誘導抗性 (Induced Resistance, IR)： 由某些化學物質（如茉莉酸、乙烯等）或益生菌觸發，主要作用於局部或有限範圍，通常對特定類型的病原體（如真菌、細菌）有效。
• 耐病性 (Tolerance)： 植物能夠被病原體感染，但儘管存在病原體，植物表現出的病徵較輕微，對產量的影響也較小。這意味著植物能夠在一定程度上忍受病原體的危害，而不會採取強烈的防禦措施。

2. Two-layered plant innate immunity (兩層式植物先天免疫)：

「兩層式植物先天免疫」是目前植物免疫學中廣泛接受的模型，用來解釋植物如何識別病原體並啟動防禦反應。它包含兩個主要的識別和響應層次：

• 第一層：PAMPs-Triggered Immunity (PTI) / MAMPs-Triggered Immunity (MTI)：

  • 識別對象： 植物細胞表面的模式識別受體 (Pattern Recognition Receptors, PRRs) 識別病原體相關分子模式 (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) 或微生物相關分子模式 (Microbe-Associated Molecular Patterns, MAMPs)。這些是病原體共有的、保守的分子結構，例如細菌的鞭毛蛋白 (flagellin)、脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS)、幾丁質 (chitin) 等。
  • 響應： 當 PRRs 識別到 PAMPs/MAMPs 後，會觸發一系列細胞內信號傳導，包括鈣離子內流、活性氧 (ROS) 的產生、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 級聯反應等，最終導致植物產生防禦反應，例如細胞壁加厚、酚類化合物的積累、PR (pathogenesis-related) 蛋白的表達增加等。PTI/MTI 是一種廣譜的、非特異性的免疫反應，可以阻止大多數非致病性微生物的侵入。

• 第二層：Effector-Triggered Immunity (ETI)：

  • 識別對象： 許多病原體為了克服 PTI/MTI，會分泌效應蛋白 (effectors) 到植物細胞內，這些效應蛋白能夠抑制植物的防禦反應。植物細胞內有一些「抗性蛋白」(Resistance proteins, R proteins)，它們能夠識別這些來自病原體的特定效應蛋白。
  • 響應： 當 R proteins 識別到病原體的效應蛋白後，會觸發更強烈、更迅速的防禦反應，稱為 ETI。ETI 通常伴隨著「細胞死亡」(hypersensitive response, HR)，即感染部位的細胞快速死亡，形成病斑隔離，阻止病原體進一步擴散。ETI 是一種高度特異性的免疫反應，與特定的病原體效應蛋白有關。

此題組涵蓋了植物病害防治的化學藥劑、抗藥性機制、生物防治，以及現代育種技術，是植物病理學和作物育種的綜合性考題。

1. 三種殺菌劑的作用機制：

這三種藥劑都是用於防治草莓炭疽病（通常由 Colletotrichum 屬真菌引起）的常見藥劑。

(1) 普克利 (Pyraclostrobin)
普克利屬於甲氧基丙烯酸酯類 (Strobilurins) 殺菌劑。

• 作用機制： 抑制粒線體呼吸鏈複合體 III (Cytochrome bc1 complex) 的電子傳遞，具體來說是結合到泛醌結合位點 (Qo site)，阻止電子由細胞色素 b 傳遞到細胞色素 c1。這會阻斷 ATP 的合成，導致能量供應中斷，進而抑制真菌的生長和孢子萌發。

(2) 百克敏 (Boscalid)
百克敏屬於琥珀酸脫氫酶抑制劑 (Succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs)，也稱為呼吸鏈複合體 II 抑制劑。

• 作用機制： 抑制粒線體呼吸鏈複合體 II (琥珀酸脫氫酶)。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸氧化為延胡索酸，並將電子傳遞給泛醌。百克敏結合到琥珀酸脫氫酶的泛醌結合位點，阻止電子從琥珀酸傳遞到泛醌，從而阻斷呼吸鏈的電子傳遞，抑制 ATP 生成。

(3) 四氯異苯腈 (Chlorothalonil)
四氯異苯腈是一種多位點作用 (multi-site) 的殺菌劑，屬於芳香族氯化物。

• 作用機制： 其作用機制較為複雜，被認為是通過與真菌細胞內的多種硫醇基 (-SH) 殘基結合，破壞細胞內關鍵酶的活性和輔酶的結構。它可能干擾呼吸作用、能量代謝、蛋白質合成，並引起細胞膜損傷。由於其作用位點多且非特異性，因此較不易產生抗藥性。

2. 草莓炭疽病菌對三種殺菌劑產生抗藥性的可能機制：

當病原菌對多種殺菌劑都表現出抗藥性時，通常是由於單一或多個基因的突變導致的。對於這三種殺菌劑，可能的抗藥性機制包括：

• 針對普克利 (Strobilurins, QoI)：
  • 目標位點突變： 最常見的機制是粒線體呼吸鏈複合體 III 的細胞色素 b 基因 (cyt b) 發生突變，導致普克利的結合位點 (Qo site) 結構改變，降低了藥劑與靶點的親和力。常見的突變位點包括 G143A、F129L 等。
  • 藥劑外排泵增強： 細菌可能過度表達外排泵蛋白（如 ATP-binding cassette (ABC) transporters），將藥劑主動泵出細胞，降低細胞內的藥劑濃度。
• 針對百克敏 (SDHIs)：
  • 目標位點突變： 琥珀酸脫氫酶複合體 II 的亞基（如 SdhB, SdhC, SdhD）基因發生突變，改變了藥劑的結合位點，降低親和力。常見的突變位點包括 H267Y, D129G (SdhB) 等。
  • 藥劑代謝或降解： 產生能夠快速代謝或降解百克敏的酶。
• 針對四氯異苯腈 (Multi-site)：
  • 目標位點多樣性： 由於四氯異苯腈作用於多個靶點，單一基因突變很難完全產生抗藥性。然而，如果存在多個基因突變，或細胞對所有這些靶點的敏感性整體下降，才可能產生較高的抗藥性。
  • 藥劑外排泵增強： 類似於 QoI 藥劑，外排泵的增強也可以降低細胞內藥劑濃度。
  • 代謝或降解： 產生能夠代謝或降解四氯異苯腈的酶。

綜合推測：
由於該菌株對三種不同作用機制的殺菌劑都產生了抗藥性，最可能的原因是：

1. 多重基因突變： 該菌株的基因組中可能存在多個與藥劑抗性相關的基因突變，分別影響了對 QoI、SDHI 及多位點藥劑的敏感性。
2. 藥劑外排泵的普遍增強： 該菌株可能過度表達了某種或某些廣譜的外排泵，能夠有效地將這三類藥劑（或其部分結構）排出細胞外。
3. 藥劑使用歷史： 長期、頻繁地使用這些藥劑（尤其是單一作用機制藥劑），壓力篩選出了具有抗藥性基因的菌株，並通過無性繁殖或基因水平轉移快速擴散。

3. 貝萊斯芽孢桿菌 (Bacillus velezensis) 的抗病及促進生長機制：

• 抗病機制：
  • 競爭： 貝萊斯芽孢桿菌能與植物病原菌競爭空間和營養物質（如鐵離子），阻止病原菌定殖。
  • 產生抗菌物質： 分泌多種抗菌物質，如：
    • 脂肽類 (Lipopeptides)： 如 iturins, surfactins, fengycins，這些化合物對真菌和細菌具有廣譜的抗菌活性，能破壞細胞膜。
    • 揮發性有機化合物 (VOCs)： 某些 VOCs 具有抑制病原菌生長或孢子萌發的作用。
    • 酶： 分泌幾丁質酶 (chitinases) 和葡聚醣酶 (glucanases)，能夠分解真菌細胞壁的主要成分，從而抑制真菌生長。
  • 誘導植物抗性： 刺激植物產生誘導抗性 (Induced Resistance, IR)，包括 SAR (系統獲得抗性) 和 ISR (內源性系統抗性)，提高植物自身的防禦能力。
  • 影響病原菌毒力因子： 干擾病原菌的群體感應 (quorum sensing) 或分泌系統。
• 促進生長機制：