109 年 國立成功大學生命科學研究所甲組《生物化學及分子生物學》

Hanes-Woolf 繪圖法是另一種分析酵素動力學數據的方法，用於確定酵素的最大反應速率（$V_{max}$）和米氏常數（$K_m$）。它源自 Michaelis-Menten 方程式，並進行了代數轉換。

Michaelis-Menten 方程式：
$v_0 = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]}$
其中 $v_0$ 是初始反應速率，$[S]$ 是受質濃度。

將此方程式改寫為 Hanes-Woolf 方程式：
$\frac{[S]}{v_0} = \frac{1}{V_{max}}[S] + \frac{K_m}{V_{max}}$
這個方程式的形式類似於直線方程式 $y = mx + c$，其中：

• $y = \frac{[S]}{v_0}$ (縱軸)
• $x = [S]$ (橫軸)
• $m = \frac{1}{V_{max}}$ (斜率)
• $c = \frac{K_m}{V_{max}}$ (y 截距)

繪製 Hanes-Woolf 圖：

1. 測量不同受質濃度（$[S]$）下的初始反應速率（$v_0$）。
2. 計算每組數據的 $\frac{[S]}{v_0}$ 值。
3. 以 $[S]$ 為橫軸，以 $\frac{[S]}{v_0}$ 為縱軸，將數據點繪製在圖上。
4. 繪製一條最佳擬合直線穿過這些數據點。

酵素的催化效率（Catalytic efficiency）是衡量酵素在特定條件下將受質轉化為產物的能力，通常用 $k_{cat}/K_m$ 比值來表示。這個指標結合了酵素的催化能力（$k_{cat}$）和對受質的親和力（$K_m$）。

定義：
酵素的催化效率通常定義為 $k_{cat}/K_m$。

• $k_{cat}$ (Turnover number)：表示每單位時間內，一個酵素分子能轉化多少個受質分子成為產物。它代表了酵素的催化能力。
• $K_m$ (Michaelis constant)：表示當反應速率達到 $V_{max}$ 的一半時所需的受質濃度。它在一定程度上反映了酵素對受質的親和力（$K_m$ 越低，親和力越高）。

為什麼使用 $k_{cat}/K_m$？

1. 綜合考量： $k_{cat}/K_m$ 結合了酵素的催化速度（$k_{cat}$）和其與受質結合的親和力（$K_m$）。一個高效的酵素不僅需要快速進行催化反應（高 $k_{cat}$），還需要能夠在較低的受質濃度下有效結合受質並進行催化（低 $K_m$）。
2. 生理相關性： 在許多生理條件下，受質濃度可能低於 $K_m$。此時，反應速率 $v_0 \approx \frac{k_{cat}}{K_m}[S]$。

此題考驗對 Lineweaver-Burt 圖的理解，以及不同類型酵素抑制劑對 $V_{max}$ 和 $K_m$ 的影響。Lineweaver-Burt 圖是 Michaelis-Menten 方程式的線性化形式：
$\frac{1}{v_0} = \frac{K_m}{V_{max}} \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}$
其中 $\frac{1}{v_0}$ 是縱軸， $\frac{1}{[S]}$ 是橫軸。

• y 截距是 $\frac{1}{V_{max}}$。
• x 截距是 $-\frac{1}{K_m}$。
• 斜率是 $\frac{K_m}{V_{max}}$。

圖中顯示了三條線：

• 線 X：無抑制劑時的酵素反應。
• 線 A：加入抑制劑 A 後的反應。
• 線 B：加入抑制劑 B 後的反應。

從圖形上觀察：

• 線 A 和線 X 的 y 截距相同，但 x 截距不同（更負）。這表示 $V_{max}$ 不變，但 $K_m$ 增加。這種情況符合競爭性抑制。

此題考驗對胰蛋白酶（chymotrypsin）活性位點關鍵胺基酸及其功能的了解。胰蛋白酶是一種絲胺酸蛋白酶（serine protease），其催化機制依賴於一個「催化三聯體」（catalytic triad）。

胰蛋白酶的催化三聯體：
胰蛋白酶的活性位點包含三個關鍵胺基酸殘基：

1. Serine 195 (S195)： 這是催化反應的核心。它的羥基（-OH）會攻擊肽鍵的羰基碳。
2. Histidine 57 (H57)： 作為一個鹼，它會從 S195 的羥基上奪取質子，使其成為一個強親核試劑（離子化）。
3. Aspartate 102 (D102)： 位於 H57 的下方，通過氫鍵穩定 H57 的正電荷，並增強 H57 作為鹼的強度，進而促進 S195 的離子化。

改變 Ser195 為 Glycine 的影響：
Serine 195 的羥基是胰蛋白酶催化蛋白質水解反應的親核攻擊者。它直接參與了肽鍵的斷裂過程。

• 親核攻擊： 在催化循環的第一步，S195 的羥基攻擊肽鍵的羰基碳，形成一個共價的醯基-酵素中間體（acyl-enzyme intermediate）。

核心觀念

本題考查蛋白質激酶的「受質辨識序列」。不同激酶偏好辨識磷酸化胺基酸附近的特定胺基酸排列；題目給出的序列為：

$$\mathrm{LARKKGSIH}$$

其中可被磷酸化的胺基酸是 Ser（S）。因此應以 S 為中心，向其上游比對各激酶的 target sequence。

S 的上游序列為：

$$\mathrm{RKKG\underline{S}}$$

也就是：

• 磷酸化位點：S
• S 前一位：G
• S 前兩位：K
• S 前三位：K
• S 前四位：R

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解題方法

將題目序列中的 $\mathrm{RKKGS}$ 與各激酶的辨識序列比對。

cGMP-dependent protein kinase（PKG）的辨識序列為：

$$-(R/K)KKX(S^*/T^*)-$$

其中 $S^*/T^*$ 表示被磷酸化的 Ser 或 Thr，$X$ 表示任意胺基酸。

題目序列可排列為：

$$\mathrm{R\ K\ K\ G\ S^*}$$

逐位符合：

• 第 1 位：R，符合 $(R/K)$
• 第 2 位：K，符合 K
• 第 3 位：K，符合 K
• 第 4 位：G，符合 $X$
• 第 5 位：S，為磷酸化位點

因此 protein X 可被 cGMP-dependent protein kinase 磷酸化。

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選項分析

A. cAMP-dependent protein kinase（PKA）

PKA 的辨識序列為：

$$-R(R/K)X(S^*/T*)-$$

若以題目的 S 為磷酸化位點，其上游四個胺基酸為：

$$\mathrm{RKKG\underline{S}}$$

PKA 要求磷酸化位點前方依序為：

$$\mathrm{R\ (R/K)\ X\ S}$$

但題目序列在 S 前三位為 K，而非 R，因此不符合 PKA 的完整辨識序列。

錯誤。

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B. cGMP-dependent protein kinase（PKG）

PKG 的辨識序列為：

$$-(R/K)KKX(S^*/T*)-$$

題目序列中的：

$$\mathrm{RKKGS^*}$$

完全符合此共識序列，其中 G 是任意胺基酸 $X$，S 是磷酸化位點。

正確。

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C. Phosphorylase kinase（PhK）

PhK 偏好的受質序列為：

$$-KRKQIS^*VRGL-$$

題目序列在磷酸化 S 前為 $\mathrm{RKKG}$，並非 $\mathrm{KRKQI}$；S 後方也沒有 $\mathrm{VRGL}$。

錯誤。

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D. Myosin light-chain kinase（MLCK）

MLCK 的辨識序列為：

$$-KKRPQRATS^*NV-$$

此題考驗對肝醣磷解酶（Glycogen phosphorylase）活性的調節機制，特別是其變構調節劑（allosteric regulators）和磷酸化調節的理解。肝醣磷解酶是肝醣分解（glycogenolysis）的限速酶，其活性受到細胞能量狀態和激素信號的調控。

肝醣磷解酶有兩種主要的同功酶形式：

• Glycogen phosphorylase a (Pha)： 磷酸化形式，活性較高。
• Glycogen phosphorylase b (Phb)： 非磷酸化形式，活性較低。

磷酸化（通過磷酸化激酶，Phosphorylase kinase）會將 Phb 轉化為 Pha，從而激活酶。去磷酸化（通過磷酸化酶磷酸酶，Phosphorylase phosphatase）則使 Pha 轉化為 Phb，抑制酶。

各分項分析：

(A) AMP

• 影響： 活化（Activation）。
• 原因： AMP 是一種能量狀態的指標。當細胞能量狀態低時，ATP 水解產生 AMP。AMP 可以作為一種變構調節劑，結合到肝醣磷解酶 b (Phb) 的變構位點上。AMP 的結合會使 Phb 的構象發生變化，使其更容易被磷酸化（通過磷酸化激酶），或者直接增加 Phb 的活性（儘管 Phb 本身活性較低，AMP 的作用主要是促進其向活性更高的 Pha 轉化，或在某些情況下直接增加 Phb 的活性）。

缺氧誘導因子（Hypoxia-Inducible Factor, HIF）是一組蛋白質轉錄因子，在細胞應對低氧（hypoxia）環境中扮演著關鍵角色。HIF 的主要功能是啟動一系列基因的表達，這些基因的產物有助於細胞和組織適應缺氧狀態，維持能量供應和細胞生存。

HIF 的結構與調控：
HIF 通常由兩個亞基組成：

1. HIF-$\alpha$ 亞基： 這是氧氣敏感的亞基。在正常氧氣（normoxia）條件下，HIF-$\alpha$ 亞基會被脯胺醯羥化酶（prolyl hydroxylases, PHD）羥基化，然後被 VHL 蛋白（von Hippel-Lindau tumor suppressor protein）識別並通過泛素-蛋白酶體系統降解。在低氧條件下，PHD 的活性降低，HIF-$\alpha$ 亞基不再被降解，穩定存在並累積。
2. HIF-$\beta$ 亞基（ARNT）： 這是相對穩定的亞基，不受氧氣濃度的直接影響。

當 HIF-$\alpha$ 累積後，它會與 HIF-$\beta$ 結合形成一個異二聚體（heterodimer）。這個 HIF 異二聚體隨後會轉運到細胞核，結合到靶基因啟動子區域的缺氧反應元件（hypoxia-response elements, HREs）上，從而啟動這些基因的轉錄。

HIF 的主要功能（應對缺氧的機制）：

1. 增加氧氣供應：
   • 血管生成（Angiogenesis）： HIF 誘導血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）的表達。

三羧酸循環（TCA cycle，又稱克氏循環或檸檬酸循環）和乙醛酸循環（glyoxylate cycle）都是代謝途徑，但它們在功能、參與的生物體、以及關鍵反應上存在顯著差異。

三羧酸循環 (TCA Cycle)：

• 功能： 是有氧呼吸的核心代謝通路，負責將乙醯輔酶A（Acetyl-CoA）氧化成二氧化碳，同時產生還原性輔酶（NADH 和 FADH2），這些輔酶將進入電子傳遞鏈產生大量的 ATP。它也是許多代謝物（如胺基酸、脂肪酸）分解和合成的中間產物的來源或去向。
• 參與的生物體： 幾乎所有好氧生物，包括細菌、古菌、真核生物（植物、動物、真菌）。
• 起始物： 乙醯輔酶A (Acetyl-CoA)。
• 關鍵反應： 循環包含一系列氧化和脫羧反應。
  • 檸檬酸合成酶 (Citrate synthase) 催化乙醯輔酶A與草醯乙酸反應生成檸檬酸。
  • 後續步驟包括異檸檬酸脫氫酶 (isocitrate dehydrogenase)、α-酮戊二酸脫氫酶複合物 (α-ketoglutarate dehydrogenase complex) 等，這些反應會釋放 $CO_2$ 並產生 NADH。
  • 琥珀醯輔酶A合成酶 (succinyl-CoA synthetase) 產生 GTP (或 ATP)。
  • 琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase)、蘋果酸脫氫酶 (malate dehydrogenase) 產生 FADH2 和 NADH。
• 淨產物 (每分子乙醯輔CoA)： $2 CO_2$, 3 NADH, 1 FADH2, 1 GTP (或 ATP)。
• 是否產生 $CO_2$： 是，在 α-酮戊二酸生成琥珀醯輔酶A 的過程中會脫羧產生 $CO_2$。
• 是否產生草醯乙酸： 是，草醯乙酸是循環的起始物之一，也是最終產物之一。

乙醛酸循環 (Glyoxylate Cycle)：

• 功能： 這是 TCA 循環的一個變體，主要存在於能利用單碳單元（如乙酸）或脂肪酸作為碳源的生物體中（如某些細菌、酵母、植物種子萌發時）。其關鍵功能是繞過 TCA 循環中的兩個脫羧反應，從而允許乙醯輔酶A 的碳原子用於合成有機酸（如草醯乙酸），進而用於合成糖類（糖質新生，gluconeogenesis）或脂肪酸。它是一種合成代謝途徑，而不是分解代謝。
• 參與的生物體： 某些細菌、酵母、植物（種子萌發期）。動物（包括人類）缺乏此循環，因此動物不能將脂肪或乙醯輔酶A 轉化為葡萄糖。
• 起始物： 乙醯輔酶A (Acetyl-CoA)。
• 關鍵反應：
  • 乙醛酸循環利用了 TCA 循環中的部分酶，但有兩個關鍵的繞過步驟：
    1. 異檸檬酸裂解酶 (Isocitrate lyase)： 將異檸檬酸裂解為琥珀酸（succinate）和乙醛酸（glyoxylate）。這是乙醛酸循環的標誌性反應，繞過了 TCA 循環中產生 $CO_2$ 的異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶步驟。
    2. 蘋果酸合成酶 (Malate synthase)： 催化乙醛酸與乙醯輔酶A 結合，生成蘋果酸（malate）。這一步也繞過了 TCA 循環中從 α-酮戊二酸到琥珀醯輔酶A 的步驟，並重新產生了 TCA 循環的起始物之一。

解偶聯劑（Uncouplers）是能夠破壞粒線體內膜上氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）過程的化合物。氧化磷酸化是一個通過電子傳遞鏈（electron transport chain, ETC）將電子能量轉化為質子梯度，再利用這個質子梯度驅動 ATP 合酶（ATP synthase）合成 ATP 的過程。解偶聯劑的作用是使得質子能夠繞過 ATP 合酶，直接穿過粒線體內膜，從而削弱或消除 ATP 的合成，但電子傳遞仍然繼續進行，釋放的能量以熱能的形式散失。

解偶聯劑的作用機制：
粒線體內膜是一個對質子（$H^+$）不透水的屏障。電子傳遞鏈將電子從 NADH 和 FADH2 傳遞，並在此過程中將質子從粒線體基質（matrix）泵送到膜間空間（intermembrane space），建立起一個質子電化學梯度（proton electrochemical gradient），也稱為質子驅動力（proton motive force）。這個梯度儲存了能量。

ATP 合酶利用這個質子梯度，讓質子從膜間空間流回粒線體基質，這個過程驅動 ATP 合酶的旋轉，最終合成 ATP。

解偶聯劑的作用是：

1. 增加內膜對質子的通透性： 許多解偶聯劑是親脂性分子，帶有可解離的質子（例如，酚類衍生物）。它們可以插入粒線體內膜，作為質子載體。它們可以在膜間空間接受質子，然後擴散到膜的另一側（基質）釋放質子，或者直接促進質子通過膜。
2. 質子洩漏（Proton leak）： 這種質子繞過 ATP 合酶的流動，被稱為「質子洩漏」。
3. ATP 合成停止，能量散失： 由於質子繞過了 ATP 合酶，驅動 ATP 合成的能量就被轉化為熱能散失，而不是用於 ATP 的合成。電子傳遞鏈的速率會因為質子梯度的減弱而加快，以維持電子流動，進一步產生更多熱量。

常見的解偶聯劑：

• 化學解偶聯劑：
  • 2,4-二硝基酚 (2,4-Dinitrophenol, DNP)： 這是一種經典的解偶聯劑。它是一種弱酸，可以接受質子，穿過膜，然後釋放質子。

此題考驗對細胞質和粒線體之間 NADH 轉運機制及其對 ATP 產量的影響的理解。在細胞質中進行糖酵解產生的 NADH 無法直接進入粒線體參與氧化磷酸化。因此，需要通過「NADH 穿梭系統」（NADH shuttle systems）將細胞質 NADH 的還原力轉移到粒線體基質中。主要有兩種穿梭系統：甘油磷酸鹽穿梭系統（glycerol-3-phosphate shuttle）和蘋果酸-天門冬胺酸穿梭系統（malate-aspartate shuttle）。它們的效率不同，導致最終 ATP 產量有差異。

1. 甘油磷酸鹽穿梭系統 (Glycerol-3-phosphate Shuttle)：

• 機制：
  1. 細胞質中的 NADH 作用於細胞質的甘油-3-磷酸脫氫酶（cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase, cGPD），將 NADH 氧化為 $NAD^+$，同時將二羥基丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP）還原為甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate）。
  2. 甘油-3-磷酸進入粒線體內膜外側。
  3. 粒線體內膜外側的甘油-3-磷酸脫氫酶（mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase, mGPD）將粒線體基質中的 FAD 轉化為 $FADH_2$，同時將甘油-3-磷酸氧化回二羥基丙酮磷酸。
  4. $FADH_2$ 直接將電子傳遞給粒線體電子傳遞鏈的泛醌（ubiquinone, Q），即電子傳遞鏈的第二個複合物（Complex II）。
• ATP 產量：
  • 由於電子是從 Complex II 進入電子傳遞鏈，與從 Complex I 進入相比，它產生的質子梯度較弱。
  • 一個 NADH 分子通過此穿梭系統轉移到粒線體基質，最終通過氧化磷酸化產生的 ATP 量約為 1.5 個 ATP。
  • （每個葡萄糖分子糖酵解產生 2 個 NADH，因此通過此系統可產生約 $2 \times 1.5 = 3$ 個 ATP，遠低於理論值 30-32 個 ATP）。

2. 蘋果酸-天門冬胺酸穿梭系統 (Malate-Aspartate Shuttle)：

• 機制：
  1. 細胞質中的 NADH 作用於細胞質的蘋果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase），將 NADH 氧化為 $NAD^+$，同時將草醯乙酸（oxaloacetate）還原為蘋果酸（malate）。
  2. 蘋果酸通過一個特定的蘋果酸-α-酮戊二酸轉運蛋白（malate-α-ketoglutarate transporter）進入粒線體基質。
  3. 在粒線體基質中，粒線體蘋果酸脫氫酶（mitochondrial malate dehydrogenase）將蘋果酸氧化回草醯乙酸，同時將粒線體基質中的 $NAD^+$ 還原為 NADH。
  4. 生成的粒線體 NADH 可以直接進入電子傳遞鏈的 Complex I。
  5. 同時，草醯乙酸需要通過天門冬胺酸轉運蛋白（aspartate transporter）與細胞質的天門冬胺酸交換，然後才能在細胞質中被還原。

這是一道關於大腸桿菌（E. coli）DNA 聚合酶（DNA polymerase）的題目，涵蓋了 DNA 聚合酶 I (Pol I) 的功能、E. coli 基因組複製的特徵，以及不同外切酶（exonuclease）的功能。

核心概念：

• DNA 複製的特性： DNA 複製需要高度的準確性，並且具有半保留性、半不連續性（岡崎片段）的特點。
• DNA 聚合酶的功能： 主要功能是從 5' 端到 3' 端合成新的 DNA 鏈，同時許多 DNA 聚合酶還具有校對（proofreading）功能，即 3'→5' 外切酶活性，用於移除錯誤配對的核苷酸。
• E. coli 的 DNA 聚合酶： E. coli 主要有 Pol I、Pol II、Pol III 等幾種 DNA 聚合酶，它們各有分工。Pol III 是主要的複製酶，Pol I 則在修復和填補空隙中起重要作用。

解題：

(a) 為什麼科學家認為 DNA 聚合酶 I (Pol I) 不是 E. coli 基因組複製的主要酶？

儘管 Pol I 是最早被發現的 DNA 聚合酶，且具有 5'→3' 的聚合酶活性和 3'→5' 的校對外切酶活性，但有幾個關鍵原因使得它不被認為是主要的複製酶：

1. 聚合速率（Turnover number）過低：

   • 從表格中可見，Pol I 的 turnover number 僅為 20 個核苷酸/秒/分子。
   • 而 E. coli 的基因組約有 5 Mbp (5 百萬鹼基對)。如果僅靠 Pol I 進行複製，其速度將遠遠不足以在細胞分裂週期內完成整個基因組的複製。
   • 相比之下，Pol III 的 turnover number 高達 1000 個核苷酸/秒/分子，是 Pol I 的 50 倍，更適合擔任主要的複製酶。

2. 分子數量相對較多，但催化效率不高：

   • E. coli 細胞內有約 400 個 Pol I 分子，而 Pol III 核心酶（Pol III holoenzyme 實際上是多個亞基組成的複雜結構，但這裡指的是核心酶）的分子數目與 Pol II 相當，約為 40 個。
   • 儘管 Pol I 的總量較多，但其低下的聚合速率限制了其作為主要複製酶的能力。

3. 5'→3' 外切酶活性：

   • Pol I 獨特地擁​​有 5'→3' 的外切酶活性。這個活性在 DNA 修復和岡崎片段的加工中非常重要，但它與連續複製的過程不符。在連續複製過程中，需要的是從 5' 到 3' 的合成，而不是從 5' 端移除核苷酸。
   • 在岡崎片段的加工中，Pol I 的 5'→3' 外切酶活性用於移除 RNA 引物，同時其 5'→3' 聚合酶活性用於填補空隙。這個過程雖然重要，但 Pol I 並非持續進行長鏈 DNA 的合成。

總結： Pol I 的聚合速率太慢，且其 5'→3' 外切酶活性更適合用於修復和引物去除，而非主要的 DNA 鏈合成。Pol III 則因其高聚合速率和作為全酶（holoenzyme）的結構，是 E. coli 基因組複製的主要酶。

真核細胞的 DNA 末端（染色體端粒，telomeres）複製是一個複雜且精巧的過程，因為 DNA 聚合酶只能從 5' 端向 3' 端合成 DNA，這在線性染色體末端會導致「末端複製問題」（end replication problem）。如果沒有特殊的機制，每次 DNA 複製後，滯後鏈（lagging strand）的末端都會比前導鏈（leading strand）短一截，導致染色體逐漸縮短。

末端複製問題 (End Replication Problem)：
在線性 DNA 分子的滯後鏈複製中，需要 RNA 引物來啟動 DNA 聚合酶的合成。一旦 RNA 引物被移除，DNA 聚合酶就無法在被移除的引物位置處填補空隙，因為它無法在 5' 端開始合成。這就導致了滯後鏈的末端會比模板鏈短。

真核細胞解決方案：端粒酶 (Telomerase)

真核細胞通過一種特殊的酶——端粒酶 (Telomerase) 來解決這個末端複製問題。

1. 端粒酶的組成與功能：

   • 端粒酶是一種含有 RNA 模板的核蛋白酶（ribonucleoprotein）。它包含一個 RNA 組分（telomerase RNA component, TERC）作為逆轉錄酶的模板，以及一個蛋白質組分（telomerase reverse transcriptase, TERT），這是具有逆轉錄酶活性的催化亞基。
   • TERC 的序列是端粒重複序列（telomeric repeat sequence）的互補序列。

2. 端粒酶的作用機制 (伸長端粒)：

   • 結合： 端粒酶結合到染色體的 3' 端懸垂鏈（3' overhang）上。

桑格 DNA 定序法（Sanger sequencing），也稱為鏈終止法（chain-termination method），是由 Frederick Sanger 在 1977 年發明的，它徹底改變了我們讀取 DNA 序列的能力。桑格法能夠準確地確定 DNA 片段的核苷酸順序。這個方法的核心在於使用了一種特殊的核苷酸。

桑格定序法的原理：
桑格法基於 DNA 聚合酶在體外合成 DNA 的能力。該方法需要一個 DNA 模板、一個 DNA 引物、DNA 聚合酶、四種普通的脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs：dATP, dGTP, dCTP, dTTP），以及一種特殊的修飾核苷酸。

關鍵發明：鏈終止核苷酸 (Chain-terminating nucleotides)

桑格定序法的核心發明是鏈終止脫氧核苷酸（chain-terminating deoxynucleotide triphosphates），也被稱為雙脫氧核苷酸三磷酸（dideoxynucleotide triphosphates, ddNTPs）。

• 結構特點： 與普通的脫氧核苷酸（dNTPs）相比，ddNTPs 在其核糖的 3' 碳原子上缺少一個羥基（-OH），而 dNTPs 在 3' 碳原子上則有一個羥基。

  • dNTP: 3'-OH
  • ddNTP: 3'-H

• 鏈終止機制：

  1. 在 DNA 合成過程中，DNA 聚合酶將 dNTPs 逐個連接到新生 DNA 鏈的 3' 末端，形成磷酸二酯鍵。這個鍵的形成依賴於新生鏈 3' 末端的羥基 (-OH) 與進入的 dNTP 的 α-磷酸基團之間發生反應。
  2. 如果 DNA 聚合酶錯誤地將一個 ddNTP 掺入到新生 DNA 鏈的末端，由於 ddNTP 的 3' 位置沒有羥基，它就無法作為下一個核苷酸連接點，從而終止了 DNA 鏈的延伸。
  3. 這個過程是隨機發生的。在反應體系中，會同時加入大量的 dNTPs 和少量的 ddNTPs。當 ddNTPs 被隨機掺入時，DNA 合成就會在該位置終止。

• 四種 ddNTPs：
  桑格法需要使用四種不同的 ddNTPs，每種都對應一種鹼基：

  • ddATP (2',3'-dideoxyadenosine triphosphate)
  • ddGTP (2',3'-dideoxyguanosine triphosphate)

σ (sigma) 亞基是大腸桿菌（E. coli）RNA 聚合酶（RNA polymerase, RNAP）的一個重要組分，它在轉錄（transcription）過程中扮演著關鍵的起始角色。RNAP 本身由核心酶（core enzyme）組成，核心酶包含 α, β, β' 和 ω 亞基，負責催化 RNA 的合成。然而，核心酶本身不能有效地識別和結合 DNA 的啟動子（promoter）區域。

σ 亞基的功能：

1. 識別和結合啟動子 (Promoter Recognition and Binding)：
   • σ 亞基是 RNA 聚合酶的核心部分，它能夠識別 DNA 模板鏈上特定的啟動子序列。啟動子是基因上游的 DNA 區域，是 RNA 聚合酶開始轉錄的起點。
   • E. coli 的 σ 因子有多種類型，其中最常見的是 σ70（σ^70），它負責識別大多數「家管基因」（housekeeping genes）的啟動子。不同的 σ 因子可以識別不同的啟動子序列，從而調控特定基因集的轉錄。
   • σ 亞基與核心酶結合形成全酶（holoenzyme），這個全酶對啟動子有更高的親和力。

脂肪酸合成（Fatty acid synthesis）是一個複雜的多步驟代謝途徑，主要發生在細胞質中，由細胞質基質中的多種酶催化。其中有一個關鍵的「承諾步驟」（committed step），是指代謝途徑中一個不可逆且對該途徑具有調節作用的反應。

脂肪酸合成的承諾步驟：

脂肪酸合成的承諾步驟是由乙醯輔酶A羧化酶 (Acetyl-CoA carboxylase, ACC) 催化的反應。

• 反應： ACC 催化乙醯輔酶A (Acetyl-CoA) 的羧基化，生成丙二醯輔酶A (Malonyl-CoA)。
  $\text{Acetyl-CoA} + \text{HCO}_3^- + \text{ATP} \xrightarrow{\text{ACC}} \text{Malonyl-CoA} + \text{ADP} + P_i$
• 重要性：
  1. 不可逆性： 這個反應是脂肪酸合成途徑中第一個不可逆的步驟。
  2. 調節點： ACC 是脂肪酸合成途徑的關鍵調節酶。ACC 的活性受到嚴格調控，以決定脂肪酸合成的速率。
  3. 提供三個碳單元： Malonyl-CoA 是脂肪酸鏈延長的直接供體。每當脂肪酸鏈延長兩個碳原子時，實際上是通過 Malonyl-CoA 提供三個碳單元，然後釋放一個 $CO_2$。

ACC 的調節機制：

ACC 的活性受到多種生理信號的調控，主要包括變構調節（allosteric regulation）、共價修飾（covalent modification，主要是磷酸化）以及激素調節。

1. 變構調節 (Allosteric Regulation)：

   • 活化劑 (Activators)： 檸檬酸鹽 (Citrate)。當細胞內檸檬酸鹽濃度高時（通常表示能量充足，TCA 循環產物豐富），檸檬酸鹽會促進 ACC 的聚合，形成活性更高的聚合體。這是一個從 TCA 循環到脂肪酸合成的信號。
   • 抑制劑 (Inhibitors)： 長鏈脂肪醯輔酶A (Long-chain acyl-CoA)。當細胞內脂肪酸濃度高時，長鏈脂肪醯輔酶A 會抑制 ACC 的活性，防止過度合成脂肪酸。

2. 共價修飾 (Covalent Modification) - 磷酸化：

   • 磷酸化抑制 ACC 活性： ACC 的活性受到磷酸化和去磷酸化的調控。

乳糖操縱子（lac operon）是大腸桿菌（E. coli）中一個經典的基因調控系統，它被廣泛用來說明基因表達的負向調控（negative control）和正向調控（positive control）。lac 操縱子包含三個結構基因：lacZ（編碼 β-半乳糖苷酶）、lacY（編碼乳糖滲透酶）和 lacA（編碼硫代半乳糖苷轉乙醯酶），以及啟動子（promoter）、操縱區（operator）和一個調節基因 lacI（編碼阻遏蛋白，repressor）。

1. 負向調控 (Negative Control)：

負向調控是指一個調節蛋白（通常是阻遏蛋白）與 DNA 結合，從而阻止或抑制基因表達。在 lac 操縱子中，lacI 基因編碼的阻遏蛋白（repressor）是負向調控的關鍵。

• 機制：

  • 無乳糖 (No Lactose)： 當細胞內沒有乳糖時，lacI 基因表達產生的阻遏蛋白是活性的。這個活性的阻遏蛋白會與 lac 操縱子中的操縱區（operator, O）結合。操縱區位於啟動子 (P) 和結構基因之間。
  • 阻礙 RNA 聚合酶結合或移動： 阻遏蛋白與操縱區結合後，會物理性地阻礙 RNA 聚合酶（RNAP）結合到啟動子，或者阻止 RNAP 開始轉錄。因此，lacZ, lacY, lacA 基因的表達被抑制，處於「關閉」（off）狀態。
  • 有乳糖 (Lactose Present)： 當細胞內存在乳糖時，乳糖（或其異構體，如別乳糖 allolactose）會作為一個誘導物 (inducer)。誘導物分子會結合到阻遏蛋白上，改變其構象，使其從操縱區上脫落。
  • 解除抑制： 一旦阻遏蛋白脫落，RNA 聚合酶就可以結合到啟動子，並開始轉錄 lacZ, lacY, lacA 基因。操縱子處於「開啟」（on）狀態。

• 總結負向調控： 阻遏蛋白（由 lacI 編碼）在沒有誘導物（乳糖）時結合操縱區，抑制轉錄。誘導物（乳糖）結合阻遏蛋白，使其脫離操縱區，解除抑制，允許轉錄發生。

2. 正向調控 (Positive Control)：

正向調控是指一個調節蛋白（通常是激活蛋白）與 DNA 結合，從而促進或增強基因表達。在 lac 操縱子中，正向調控涉及一個稱為協同激活蛋白 (Catabolite Activator Protein, CAP)，也稱為環腺苷酸受體蛋白 (cAMP Receptor Protein, CRP)。

• 機制：
  • cAMP 的作用： CAP 需要與環腺苷酸 (cAMP) 結合後才能發揮活性。cAMP 的濃度與細胞內葡萄糖的濃度成反比。
    • 低葡萄糖 (Low Glucose)： 當細胞內葡萄糖濃度低時，cAMP 的濃度會升高。高濃度的 cAMP 會與 CAP 結合，形成 cAMP-CAP 複合物。
    • 高葡萄糖 (High Glucose)： 當細胞內葡萄糖濃度高時，cAMP 濃度低，CAP 處於無活性狀態。

組蛋白（Histones）是真核細胞中 DNA 包裝的主要蛋白質，它們與 DNA 共同組成核小體（nucleosomes），進而形成染色質（chromatin）。組蛋白的翻譯後修飾（Post-Translational Modifications, PTMs）在調節染色質結構、DNA 可及性以及基因表達方面起著至關重要的作用。這些修飾通常發生在組蛋白的 N 端尾巴（N-terminal tails）上，這些尾巴伸出核小體的核心。

以下是三種對基因表達重要的組蛋白翻譯後修飾：

1. 乙醯化 (Acetylation)：

   • 修飾位點： 主要發生在組蛋白賴胺酸（Lysine, K）殘基的 ε-胺基上。
   • 酶： 乙醯化由組蛋白乙醯轉移酶（Histone Acetyltransferases, HATs）催化，去乙醯化由組蛋白去乙醯化酶（Histone Deacetylases, HDACs）催化。
   • 對基因表達的影響： 乙醯化通常與基因的激活（activation）相關。
     • 原因： 賴胺酸帶有正電荷。乙醯化消除了賴胺酸的淨正電荷，這會減弱組蛋白與帶負電荷的 DNA 之間的靜電吸引力。
     • 結果： 染色質結構變得更鬆散（euchromatin），DNA 更容易被轉錄因子和 RNA 聚合酶接觸，從而促進基因的轉錄。HATs 通常被認為是轉錄激活因子。

2. 甲基化 (Methylation)：

   • 修飾位點： 發生在組蛋白賴胺酸（Lysine, K）和精胺酸（Arginine, R）殘基的側鏈上。賴胺酸可以被甲基化一次、兩次或三次（Kme1, Kme2, Kme3），精胺酸可以被甲基化一次或兩次（Rme1, Rme2）。
   • 酶： 甲基化由組蛋白甲基轉移酶（Histone Methyltransferases, HMTs）催化，去甲基化由組蛋白去甲基化酶（Histone Demethylases）催化。
   • 對基因表達的影響： 甲基化對基因表達的影響是複雜的，可以導致基因的激活或抑制，取決於甲基化的位點和程度。

RNA 剪接（RNA splicing）是真核細胞中一種重要的轉錄後加工過程，它通過從前體 mRNA (pre-mRNA) 中移除內含子（introns），並將外顯子（exons）連接起來，形成成熟的 mRNA。這個過程由稱為剪接體（spliceosome）的複雜分子機器執行，剪接體由小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs）和多種蛋白質組成。剪接過程的準確性至關重要，它依賴於對剪接位點（splice sites）和分支點（branch point）的精確識別。

剪接位點的決定：

在大多數情況下，內含子的兩端各有一個剪接位點：5' 剪接位點（5' splice site）和 3' 剪接位點（3' splice site）。它們的序列通常遵循一定的保守模式。

1. 5' 剪接位點 (5' Splice Site)：

   • 序列特徵： 5' 剪接位點通常位於內含子的開頭，其序列通常是保守的 GU。也就是說，內含子的第一個兩個鹼基通常是 GU。
   • 識別機制： 剪接體中的 U1 snRNP 扮演關鍵角色。U1 snRNP 的 RNA 組分（U1 snRNA）包含一個與 5' 剪接位點序列（特別是 GU）具有鹼基互補性的區域。
   • 互補結合： U1 snRNA 的保守序列與 pre-mRNA 的 5' 剪接位點（GU）進行鹼基配對，從而將剪接體招募到內含子的 5' 端。

2. 3' 剪接位點 (3' Splice Site)：

   • 序列特徵： 3' 剪接位點通常位於內含子的末端，其序列模式也相對保守，在人類中通常是 AG。內含子的最後兩個鹼基是 AG。
   • 識別機制： 剪接體中的 U2AF（U2 auxiliary factor）是一個異二聚體蛋白質，它能夠識別 3' 剪接位點附近富含嘧啶的區域（pyrimidine tract）和 3' AG 序列。
   • 互補結合： U2AF 協助 U2 snRNP 結合到分支點（見下文），並與 3' 剪接位點的 AG 序列相互作用，協助剪接體的組裝。

分支點 (Branch Point) 的決定：

分支點是內含子內部的一個特定腺苷酸（Adenosine, A）殘基，它在剪接過程中起著核心作用，是形成第一個剪接中間體（lariat intermediate）的位點。

1. 分支點序列 (Branch Point Sequence, BPS)：
   • 位置： 分支點通常位於 3' 剪接位點的上游，但與 3' 剪接位點之間隔著一段富含嘧啶的序列。
   • 序列特徵： 分支點本身是一個腺苷酸 (A)。

16S rRNA 和 23S rRNA 是細菌核糖體（ribosome）的組成部分，它們在蛋白質翻譯（protein translation）過程中扮演著至關重要的角色。核糖體是蛋白質合成的分子機器，由小亞基（small subunit）和大亞基（large subunit）組成。在細菌中，小亞基主要是 16S rRNA 和約 21 種蛋白質，大亞基主要是 23S rRNA、5S rRNA 和約 34 種蛋白質。

1. 16S rRNA 的功能 (小亞基)：

16S rRNA 是細菌核糖體小亞基（30S）的主要結構和功能成分。它的主要功能集中在翻譯的起始階段：

• 識別 mRNA 的起始密碼子 (Shine-Dalgarno sequence)： 16S rRNA 的 5' 端包含一個保守的序列，稱為 Shine-Dalgarno 序列（在 E. coli 中是 AGGAGG）。這個序列可以與 mRNA 上游的啟動子序列（也稱為 Shine-Dalgarno 序列）通過鹼基互補配對（A-U, G-C）結合。
  • 作用： 這種結合將核糖體小亞基精確地定位在 mRNA 上的起始密碼子（通常是 AUG）附近，確保蛋白質合成從正確的位置開始。
• 與起始因子 IF3 的相互作用： 16S rRNA 與起始因子 IF3 (Initiation Factor 3) 相互作用，有助於維持 30S 小亞基的穩定性，並促進其與 mRNA 的結合，同時阻止 50S 大亞基過早結合。
• 參與起始複合物的形成： 16S rRNA 參與組建 30S 起始複合物，該複合物包含 30S 小亞基、mRNA、起始 tRNA (fMet-tRNAfMet) 和起始因子。

2. 23S rRNA 的功能 (大亞基)：

23S rRNA 是細菌核糖體大亞基（50S）的主要結構和功能成分。它的主要功能集中在肽鏈的形成和延伸階段：

AMP 依賴性蛋白質激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 是細胞內一個至關重要的能量感測器和調節器。它在細胞能量代謝中扮演著核心角色，當細胞能量狀態低下（ATP 減少，AMP/ATP 比值升高）時，AMPK 會被激活，並啟動一系列有助於恢復細胞能量平衡的過程。AMPK 的激活受到多種因素的複雜調控。

AMPK 的調節機制：

AMPK 的激活主要依賴於細胞內 AMP/ATP 比值的升高，這會導致 AMPK 的三種亞基（α, β, γ）的構象變化，以及其磷酸化狀態。

1. AMP 的結合與激活 (Allosteric Activation by AMP)：

   • AMPK 由一個催化亞基（α）和兩個調節亞基（β 和 γ）組成。γ 亞基有一個特殊的結合位點，可以結合 AMP、ADP 和 ATP。
   • 當細胞內 AMP 濃度升高（ATP 濃度降低，ATP 水解產生 ADP 和 AMP）時，AMP 會結合到 γ 亞基的 AMP/ADP 結合位點上。
   • AMP 的結合會使 AMPK 構象發生變化，一方面，它能夠阻止 ATP 結合到 γ 亞基的位點，從而阻止 ATP 對 AMPK 的變構抑制作用；另一方面，它還會促進 AMPK 的磷酸化，從而增強其活性。ADP 也可以結合，但 AMP 的親和力更高。

2. 磷酸化調控 (Phosphorylation)：
   AMPK 的活性受到兩種主要類型的磷酸化調節：

   • 上游激酶的磷酸化 (Activation by upstream kinases)： AMPK 的 α 亞基有一個保守的蘇胺酸殘基（在人類 α1 亞基是 Thr172，α2 亞基是 Thr172），這個位點的磷酸化是激活 AMPK 的關鍵步驟。
     • 主要的上游激酶：
       • LKB1 (Liver kinase B1)： LKB1 是一個絲胺酸/蘇胺酸激酶，被認為是 AMPK 的主要上游激酶。LKB1 在細胞質中，並且其活性不受 AMP 的直接影響。當細胞能量狀態低下時，LKB1 會磷酸化 AMPK 的 α 亞基 Thr172 位點，從而激活 AMPK。

泛素-蛋白酶體系統（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）是真核細胞中蛋白質降解的主要途徑。它負責選擇性地降解細胞內大部分的蛋白質，包括異常蛋白質、受損蛋白質、壽命短的調節性蛋白質（如週期蛋白、信號轉導蛋白），以及外源性蛋白質。UPS 的精確調控對於維持細胞的穩態（homeostasis）、調控細胞週期、信號傳導、DNA 修復和免疫反應至關重要。

UPS 的核心過程包括兩個主要步驟：

1. 蛋白質的泛素化 (Ubiquitination)： 在這個步驟中，一種稱為泛素（ubiquitin, Ub）的小蛋白質（76 個胺基酸）被共價連接到目標蛋白質的賴胺酸殘基上。
2. 目標蛋白質的降解： 被泛素化的蛋白質隨後被一個大型蛋白質複合體——蛋白酶體（proteasome）——識別並降解成小的肽段。

1. 蛋白質的泛素化 (Ubiquitination)：

泛素化是一個需要多種酶協同作用的過程，通常涉及三個主要的酶類：

• E1 酶 (Ubiquitin-activating enzyme)： 這是泛素化途徑的第一步。一個 E1 酶分子活化一個泛素分子，通過形成一個硫酯鍵（thioester bond）將泛素的 C 端羧基與 E1 酶的半胱胺酸殘基連接起來。這個過程需要消耗 ATP。
• E2 酶 (Ubiquitin-conjugating enzyme)： 活化的泛素從 E1 酶轉移到 E2 酶的半胱胺酸殘基上，形成另一個硫酯鍵。存在多種類型的 E2 酶，它們決定了泛素鏈的類型和目標蛋白質的降解速率。
• E3 酶 (Ubiquitin ligase)： E3 酶是泛素化途徑中的關鍵識別元件。它能夠識別特定的目標蛋白質（底物），並將 E2 酶上連接的泛素轉移到目標蛋白質的賴胺酸殘基上，形成一個異肽鍵（isopeptide bond）。
  • E3 酶的多樣性： E3 酶種類繁多（數百種），它們賦予了 UPS 高度的底物特異性。不同的 E3 酶識別不同的底物蛋白質，並將泛素連接到目標蛋白質上。
  • 泛素鏈的形成： 通常，一個泛素分子不足以啟動降解。目標蛋白質會被連接上一個由 4 個或更多泛素分子組成的多聚泛素鏈（polyubiquitin chain）。泛素分子之間通過其賴胺酸殘基（如 K48、K11）連接形成鏈。K48 連接的多聚泛素鏈是蛋白酶體識別的「標記」。

2. 蛋白酶體 (Proteasome)：

蛋白酶體是一個大型的、ATP 依賴性的蛋白質酶複合體，其結構類似於一個桶。它主要由兩部分組成：

• 20S 核心複合體 (20S core particle, CP)： 這是蛋白酶體的催化核心，由 14 個亞基組成，形成一個中空的圓筒狀結構。

細胞內鈣離子（$Ca^{2+}$）濃度是一個極其重要的細胞內信號，它在細胞信號轉導中扮演著多種關鍵角色，包括肌肉收縮、神經傳導、細胞黏附、細胞凋亡、基因表達等。儘管細胞外液和細胞質中 $Ca^{2+}$ 濃度差異巨大（細胞外約 $10^{-3} M$，細胞質遊離 $Ca^{2+}$ 約 $10^{-7} M$），但細胞內游離 $Ca^{2+}$ 的濃度受到嚴格的動態調控，以確保信號的準確傳遞和細胞功能的正常運行。

細胞內鈣離子濃度的調節機制：

細胞內 $Ca^{2+}$ 濃度的調節主要通過以下幾個方面實現：

1. 鈣離子的儲存與釋放 (Calcium Storage and Release)：

   • 鈣離子儲存庫： 細胞質中最主要的 $Ca^{2+}$ 儲存庫是內質網（endoplasmic reticulum, ER）和肌漿網（sarcoplasmic reticulum, SR，在肌細胞中）。這些膜結合的細胞器可以將 $Ca^{2+}$ 主動泵入其腔內，形成高濃度的儲存庫。
   • 鈣離子釋放通道： 當細胞受到特定信號（如激素、神經遞質）刺激時，細胞膜上的受體或細胞內的信號通路會激活內質網/肌漿網上的鈣離子通道，導致儲存的 $Ca^{2+}$ 大量釋放到細胞質中，引起細胞質 $Ca^{2+}$ 濃度的快速升高。
     • 肌醇三磷酸受體 (Inositol trisphosphate receptor, IP3R)： IP3R 是內質網上的鈣離子通道，受細胞內第二信使 IP3 的調節。IP3 通常由磷脂酶 C (PLC) 活性增加產生。
     • 蘭尼鹼受體 (Ryanodine receptor, RyR)： RyR 主要存在於肌細胞的肌漿網上，它對鈣離子本身和電信號（肌電耦合）有反應，負責快速釋放肌漿網中的大量鈣離子，觸發肌肉收縮。

2. 鈣離子的泵入與輸出 (Calcium Pumping and Export)：

   • 從細胞質泵入儲存庫：
     • SERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca$^{2+}$-ATPase)： 這是內質網/肌漿網膜上的 ATP 依賴性鈣離子泵。它將細胞質中的 $Ca^{2+}$ 主動泵回內質網/肌漿網腔內，這是恢復細胞質 $Ca^{2+}$ 低濃度的主要機制。
   • 從細胞質泵出細胞外：
     • PMCA (Plasma membrane Ca$^{2+}$-ATPase)： 這是細胞膜上的 ATP 依賴性鈣離子泵，將細胞質中的 $Ca^{2+}$ 泵出細胞外，維持細胞外 $Ca^{2+}$ 濃度梯度。