109 年 國立成功大學生物科技與產業科學系《生物化學》

蛋白質磷酸化（phosphorylation）與去磷酸化（dephosphorylation）是蛋白質功能調控中極為重要的後轉譯修飾機制。

定義：

• 蛋白質磷酸化 (Protein phosphorylation): 指的是一個或多個磷酸基團（通常來自 ATP）透過共價鍵連接到蛋白質上的特定胺基酸殘基（主要是絲胺酸 Ser, 蘇胺酸 Thr, 或酪胺酸 Tyr）的過程。這個過程由一類稱為激酶（kinases）的酵素催化。
• 蛋白質去磷酸化 (Protein dephosphorylation): 指的是從蛋白質上移除磷酸基團的過程。這個過程由另一類稱為磷酸酶（phosphatases）的酵素催化。

功能與調控機制：
磷酸化和去磷酸化可以在多個層面上影響蛋白質的功能：

1. 改變蛋白質構象： 磷酸基團帶有負電荷，其引入會改變蛋白質局部或整體的電荷分佈，進而影響其三級結構（構象）。這種構象的改變可能活化或抑制蛋白質的活性。
2. 改變蛋白質活性： 許多蛋白質的活性受到磷酸化狀態的直接調控。例如，某些酶在磷酸化後活性增強，而另一些則減弱。
3. 提供蛋白質交互作用的位點： 磷酸化的酪胺酸殘基常作為 SH2 結構域（SH2 domains）的結合位點，促進蛋白質與蛋白質之間的相互作用，進而啟動訊號傳遞途徑。
4. 影響蛋白質亞細胞定位： 磷酸化可能改變蛋白質與細胞內特定區域（如細胞膜、細胞核）的親和力。
5. 影響蛋白質穩定性： 磷酸化也可能標記蛋白質進行降解，或使其免於降解。

戊糖磷酸途徑（Pentose Phosphate Pathway, PPP），又稱磷酸葡萄糖酸脫氫酶途徑（Hexose Monophosphate Shunt），是一個與糖解作用（glycolysis）並行的代謝途徑。它在細胞質中進行，主要有兩個核心功能，其中一個是為生物合成提供還原力，另一個是提供合成核酸所需的五碳醣。

PPP 的主要生合成角色：

PPP 的主要生合成角色是提供還原力，以 NADPH 的形式，用於各種合成反應。

1. 提供 NADPH 作為還原劑：
   • PPP 的氧化階段（第一階段）產生 NADPH。在這一階段，葡萄糖-6-磷酸 (glucose-6-phosphate) 經過一系列去氫酶反應，最終生成核酮糖-5-磷酸 (ribulose-5-phosphate)，並在此過程中產生兩分子的 NADPH。
   • NADPH 的生合成用途：
     • 脂肪酸合成 (Fatty acid synthesis): 在肝臟、脂肪組織和乳腺中，NADPH 是脂肪酸合成過程中脂肪醯輔酶 A (fatty acyl-CoA) 還原為脂肪醇的關鍵還原劑。
     • 類固醇合成 (Steroid synthesis): 類固醇的從頭合成過程中，需要 NADPH 作為還原劑。
     • 核苷酸合成 (Nucleotide synthesis): 在嘌呤和嘧啶核苷酸的從頭合成過程中，NADPH 也被用作還原劑。
     • 胺基酸合成 (Amino acid synthesis): 某些胺基酸的合成也需要 NADPH。
     • 抗氧化防禦： NADPH 在維持細胞的還原環境方面起著至關重要的作用。

血糖恆定（blood glucose homeostasis）是一個複雜的生理過程，主要由肝臟、胰臟和激素（特別是胰島素和升糖素）協同調控。肝臟透過儲存和釋放葡萄糖來維持血糖穩定，而肝糖合成酶 (Glycogen Synthase, GS) 和肝糖磷解酶 (Glycogen Phosphorylase, GP) 是調控肝糖合成與分解的關鍵酶。胰島素 (insulin) 和升糖素 (glucagon) 是調節這些酶活性的主要激素。

核心概念：

• 血糖升高時： 胰島素分泌增加，促進葡萄糖進入細胞並合成肝糖，從而降低血糖。
• 血糖降低時： 升糖素分泌增加，促進肝糖分解和葡萄糖釋放，從而升高血糖。

激素與關鍵酶的關係：

1. 胰島素 (Insulin):

   • 作用： 當血糖升高（如餐後）時，胰臟 β 細胞分泌胰島素。胰島素主要作用於肝臟、肌肉和脂肪細胞。
   • 對 GS 的影響： 胰島素透過促進細胞膜上葡萄糖轉運蛋白 GLUT4（在肌肉和脂肪細胞中）的轉位，增加葡萄糖進入細胞。在肝臟，胰島素會活化肝糖合成酶 (GS)。它透過一個信號傳遞途徑，導致 GS 的去磷酸化。去磷酸化的 GS 是活性形式，能促進葡萄糖單元聚合成肝糖。
   • 對 GP 的影響： 胰島素會抑制肝糖磷解酶 (GP) 的活性。它透過誘導 GP 的去磷酸化來實現這一點。去磷酸化的 GP 是非活性形式，因此抑制了肝糖分解。
   • 總結： 胰島素促進肝糖的合成，並抑制肝糖的分解，從而降低血糖。

2. 升糖素 (Glucagon):

   • 作用： 當血糖降低（如禁食期間）時，胰臟 α 細胞分泌升糖素。升糖素主要作用於肝臟。

溶菌酶（Lysozyme）是一種廣泛存在於動物體內的抗菌酶，是先天免疫系統（innate immune system）的重要組成部分，扮演著化學防禦的角色。

溶菌酶的分佈與存在位置：

溶菌酶存在於動物體的多種分泌物和組織中，其主要存在位置包括：

1. 分泌物：

   • 淚液 (Tears): 這是溶菌酶最廣為人知和最顯著的存在位置之一。淚液中的溶菌酶能有效殺滅附著在眼球表面的細菌。
   • 唾液 (Saliva): 唾液中的溶菌酶有助於清潔口腔，並預防口腔內的細菌感染。
   • 鼻腔黏液 (Nasal mucus): 黏液中的溶菌酶能捕捉和殺滅吸入的微生物。
   • 胃液 (Gastric juice): 胃酸（pH 極低）本身就是強大的殺菌屏障，溶菌酶的存在進一步增強了胃部的殺菌能力。
   • 呼吸道黏液 (Respiratory mucus): 作用類似於鼻腔黏液。
   • 乳汁 (Milk): 特別是初乳，含有高濃度的溶菌酶，為新生兒提供早期保護。
   • 雞蛋清 (Egg white): 雖然題目問的是動物，但雞蛋清是溶菌酶的一個重要來源，其含量很高，是雞蛋清抗菌的主要機制之一。

2. 組織和細胞：

   • 巨噬細胞 (Macrophages) 和中性粒細胞 (Neutrophils): 這些吞噬細胞在吞噬病原體後，會將溶菌酶釋放到吞噬體（phagosome）內，與其他消化酶一起分解病原體。
   • 皮膚 (Skin): 存在於皮膚的微量分泌物中，提供局部保護。

溶菌酶的化學防禦機制：

非共價鍵相互作用（Non-covalent interactions）在維持生物大分子（如蛋白質和核酸）的正確三維結構及其功能方面起著至關重要的作用。這些相互作用雖然比共價鍵弱，但大量弱相互作用的累積可以產生足夠的穩定性。

以下是與蛋白質和核酸結構及功能相關的至少四種非共價鍵相互作用：

1. 離子鍵/靜電相互作用 (Ionic interactions / Electrostatic interactions):

   • 描述： 帶相反電荷的基團之間的吸引力。在蛋白質中，這發生在帶正電的胺基（如賴胺酸 Lys、精胺酸 Arg 的側鏈）和帶負電的羧基（如天門冬胺酸 Asp、麩胺酸 Glu 的側鏈）之間。在核酸中，DNA 的磷酸骨架帶負電，而某些蛋白質（如組蛋白）帶正電，兩者之間會產生強烈的靜電吸引。
   • 作用： 穩定蛋白質的二級結構（如 α-螺旋和 β-摺疊）和三級結構，參與蛋白質與核酸的結合，以及蛋白質與蛋白質之間的相互作用。

2. 氫鍵 (Hydrogen bonds):

   • 描述： 當一個氫原子與一個電負性較強的原子（如氧 O 或氮 N）共價鍵合，且該氫原子又靠近另一個電負性原子時，就會形成氫鍵。通常表示為 D-H···A，其中 D 是給電子體（通常是 N 或 O），H 是氫原子，A 是受電子體（通常是 N 或 O）。
   • 作用：
     • 蛋白質： 穩定蛋白質的二級結構（α-螺旋和 β-摺疊）的形成，其中氫鍵連接肽骨架上的胺基和羧基。也參與蛋白質的局部構象穩定。
     • 核酸： 是 DNA 雙螺旋結構和 RNA 二級結構（如髮夾結構）形成的最關鍵的相互作用。例如，A-T (或 A-U) 之間形成兩個氫鍵，G-C 之間形成三個氫鍵，這些鹼基對的穩定性差異影響了雙螺旋的穩定性。

3. 范德華力 (Van der Waals forces):

血紅素蛋白（Globins）是一類含有血紅素輔基（heme group）的球狀蛋白質。血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）和肌紅蛋白（Myoglobin, Mb）是其中最為人熟知的兩種，它們在分子結構和生理功能上存在顯著差異。

分子結構上的差異：

生理功能上的差異：

代謝廢物（Metabolic wastes）是指生物體內代謝過程中產生的、對機體無用甚至有害的物質。氮代謝廢物是其中一類重要的廢物，主要來源於蛋白質和核酸的分解代謝。在人類體內，主要的氮代謝廢物是尿素。

人類產生的主要氮代謝廢物：

1. 尿素 (Urea):

   • 來源： 尿素是人類體內最主要的含氮廢物。它主要由肝臟通過「尿素循環」（Urea Cycle）合成。尿素循環是將氨（$\text{NH}_3$）轉化為毒性較低的尿素的代謝途徑。氨的來源包括：
     • 胺基酸的去胺基作用 (Deamination of amino acids): 蛋白質分解產生的胺基酸，在肝臟中通過氧化去胺基，釋放出氨。
     • 核酸的分解代謝。
     • 腸道細菌的代謝產物。
   • 合成途徑： 尿素循環發生在肝細胞的細胞質和粒線體中，將氨、二氧化碳和天冬胺酸 (aspartate) 轉化為尿素。
   • 排出： 合成後的尿素通過血液運輸到腎臟，由腎臟濾過並隨尿液排出體外。
   • 重要性： 尿素的毒性遠低於氨，因此將氨轉化為尿素是哺乳動物解毒和排泄氮的一種有效策略。

2. 尿酸 (Uric acid):

   • 來源： 尿酸是嘌呤核苷酸（adenine 和 guanine）分解的最終產物。
   • 合成途徑： 在肝臟和腸道中，嘌呤經過一系列酶促反應，最終生成尿酸。

NADH（煙鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸的還原型）和 NADPH（煙鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的還原型）是兩種極為重要的輔酶，它們在細胞代謝中扮演著「能量貨幣」和「還原力載體」的角色，參與眾多生化反應。

功能 (Functions):

1. NADH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide, reduced form):

   • 主要功能： NADH 主要參與能量產生，尤其是在細胞呼吸過程中。
   • 具體作用：
     • 糖解作用 (Glycolysis): 在糖解作用的第三步（磷酸甘油醛氧化為1,3-二磷酸甘油酸）和第七步（3-磷酸甘油酸轉化為2-磷酸甘油酸）中，產生 NADH。
     • 丙酮酸氧化脫羧 (Pyruvate oxidation): 丙酮酸進入粒線體後，轉化為乙醯輔酶 A 的過程中產生 NADH。
     • 檸檬酸循環 (Citric acid cycle / Krebs cycle): 檸檬酸循環中的多個步驟（如異檸檬酸轉化為 α-酮戊二酸、α-酮戊二酸轉化為琥珀醯輔酶 A、蘋果酸轉化為草醯乙酸）都會產生 NADH。
     • 電子傳遞鏈 (Electron transport chain, ETC): 在粒線體的電子傳遞鏈中，NADH 提供的電子是主要的能量來源。NADH 將其高能電子傳遞給 ETC 的第一個複合物（NADH 脫氫酶複合物 I），這個過程釋放的能量用於將質子泵入粒線體膜間隙，最終驅動 ATP 合成酶產生大量的 ATP（氧化磷酸化）。
   • 總結： NADH 是能量代謝的關鍵載體，其釋放的能量主要用於 ATP 的生成。

2. NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, reduced form):

   • 主要功能： NADPH 主要參與還原合成反應（anabolic reactions）和抗氧化防禦。
   • 具體作用：
     • 生物合成 (Biosynthesis): NADPH 提供電子（還原力）來驅動各種生物合成反應，這些反應通常是吸能的。
       • 脂肪酸合成 (Fatty acid synthesis): 在細胞質中，NADPH 是脂肪酸合成過程中羧酸還原為醇的還原劑。
       • 類固醇合成 (Steroid synthesis): 類固醇的從頭合成也需要 NADPH。
       • 核苷酸合成 (Nucleotide synthesis): 嘌呤和嘧啶核苷酸的從頭合成過程需要 NADPH。
       • 胺基酸合成 (Amino acid synthesis): 某些胺基酸的合成也消耗 NADPH。
     • 抗氧化防禦 (Antioxidant defense): NADPH 對維持細胞的還原狀態至關重要，尤其是在抵抗氧化壓力時。
       • 穀胱甘肽還原 (Glutathione reduction): NADPH 是穀胱甘肽還原酶 (glutathione reductase) 的輔酶，該酶將氧化的穀胱甘肽 (GSSG) 還原為還原態的穀胱甘肽 (GSH)。GSH 是細胞內主要的抗氧化劑，可以清除有害的活性氧 (ROS)，保護細胞免受氧化損傷。
       • 細胞色素 P450 系統 (Cytochrome P450 system): 在肝臟和其他組織中，NADPH 是細胞色素 P450 酶系進行氧化、解毒和合成反應的重要還原劑。
     • 吞噬細胞的殺菌作用 (Bactericidal activity in phagocytes): 在吞噬細胞（如中性粒細胞）中，NADPH 氧化酶利用 NADPH 產生超氧化物自由基 ($\text{O}_2^-$)，這是殺滅吞噬的細菌和病原體的重要武器（呼吸爆發，respiratory burst）。
   • 主要來源： 戊糖磷酸途徑 (Pentose Phosphate Pathway, PPP) 是 NADPH 的主要生成途徑，尤其是在細胞需要大量 NADPH 的情況下（如脂肪合成活躍的肝細胞）。

相似點 (Similarities):

細胞膜運輸是物質進出細胞的關鍵過程，主要分為被動運輸（passive transport）和主動運輸（active transport）兩大類。這兩類運輸方式在是否需要能量以及如何跨膜方面存在根本區別。

被動運輸 (Passive Transport):
被動運輸是指物質順著其濃度梯度（或電化學梯度）跨膜移動，不需要細胞直接提供能量（如 ATP 水解）。能量來源是物質本身的濃度梯度。

1. 簡單擴散 (Simple Diffusion):

   • 定義： 物質直接透過脂質雙層膜的縫隙，從高濃度區域向低濃度區域移動。
   • 特點：
     • 不需要載體蛋白。
     • 不需要消耗 ATP。
     • 移動方向： 順濃度梯度。
     • 適用物質： 體積小、非極性或弱極性的分子，如氧氣 ($\text{O}_2$)、二氧化碳 ($\text{CO}_2$)、脂溶性分子（如類固醇激素、酒精）。
     • 速率： 速率與濃度梯度成正比，與膜的通透性有關。

2. 促進擴散 (Facilitated Diffusion):

   • 定義： 物質順著其濃度梯度（或電化學梯度）跨膜移動，但需要膜上的載體蛋白 (carrier protein) 或通道蛋白 (channel protein) 的協助。
   • 特點：
     • 需要載體蛋白或通道蛋白。
     • 不需要消耗 ATP。
     • 移動方向： 順濃度梯度（或電化學梯度）。
     • 適用物質： 離子（如 $\text{Na}^+$、$\text{K}^+$、$\text{Ca}^{2+}$）、極性分子（如葡萄糖、胺基酸）。
     • 速率： 速率受載體蛋白或通道蛋白數量的限制，當所有載體/通道都被佔用時，速率會達到飽和。
     • 通道蛋白： 形成親水性通道，允許特定離子或小分子通過，通常具有門控機制（如電壓門控、配體門控）。
     • 載體蛋白： 與特定溶質結合，發生構象變化，將溶質從一側轉移到另一側。

主動運輸 (Active Transport):
主動運輸是指物質跨膜移動，需要細胞直接提供能量（通常是 ATP 水解），以克服濃度梯度或電化學梯度。

3. 初級主動運輸 (Primary Active Transport):

   • 定義： 直接利用能量（主要是 ATP 水解）來驅動物質從低濃度向高濃度移動。
   • 特點：
     • 直接消耗 ATP。
     • 移動方向： 逆濃度梯度（或電化學梯度）。
     • 需要膜上的蛋白質泵 (protein pump)。
     • 例子：
       • 鈉鉀泵 (Na+/K+-ATPase): 在所有動物細胞中都存在，將 3 個 $\text{Na}^+$ 泵出細胞，同時將 2 個 $\text{K}^+$ 泵入細胞，維持細胞內外的離子濃度梯度，並產生膜電位。
       • 鈣泵 (Ca2+-ATPase): 將 $\text{Ca}^{2+}$ 泵出細胞質（如細胞膜上的鈣泵）或泵入細胞器（如肌漿網/內質網上的鈣泵），維持細胞質低鈣濃度。
       • 質子泵 (H+-ATPase): 在某些細胞中，將質子泵出細胞或進入細胞器。

4. 次級主動運輸 (Secondary Active Transport):

   • 定義： 間接利用能量，通過偶聯另一種物質的順梯度移動（其梯度本身是由初級主動運輸建立的）來驅動目標物質的逆梯度移動。
   • 特點：
     • 不直接消耗 ATP，但依賴於由初級主動運輸建立的離子梯度（如 $\text{Na}^+$ 梯度）。

RNA 世界假說（RNA World Hypothesis）提出，在地球生命演化早期，RNA 分子不僅僅是 DNA 和蛋白質的信使，更是同時扮演著遺傳物質（儲存遺傳資訊）和催化劑（類似酶的功能）的角色，是生命演化最初的「活物質」。這個假說有幾個主要的理論依據和實驗支持。

支持 RNA 世界假說的主要理由：

1. RNA 的雙重功能（遺傳信息儲存與催化活性）：

   • 遺傳信息儲存： RNA 的核苷酸序列可以攜帶遺傳信息，類似於 DNA。雖然 RNA 在結構上不如 DNA 穩定（雙鏈結構、核糖上的 2'-OH 基團使其更容易水解），但在早期生命形式可能不需要極高的穩定性。
   • 催化活性（核酶, Ribozymes）： 這是 RNA 世界假說的核心支持點。科學家發現了許多 RNA 分子本身具有催化活性，能夠進行生物化學反應，就像蛋白質酶一樣。
     • 核酶的例子：
       • 核糖體中的 rRNA： 核糖體是蛋白質合成的場所，其中核糖體 RNA (rRNA) 不僅是結構組分，更重要的是，它負責催化胜肽鍵的形成（肽基轉移酶活性）。這證明了 RNA 可以催化複雜的蛋白質合成過程。
       • RNA 剪接 (RNA splicing)： 某些 RNA 分子（如 المجموعة I 和 II 的內含子）能夠自我催化剪接，切除自身的內含子序列。
       • 其他核酶： 還發現了能夠進行 RNA 複製、磷酸化、脫磷酸化、胺基酸連接等反應的核酶。

2. RNA 在現存生物體中的核心地位：

   • 遺傳信息的中心法則： 在現代生物體中，DNA 儲存信息，RNA 傳遞信息，蛋白質執行功能。但 RNA 在這個過程中起著關鍵的橋樑作用。
   • 轉譯過程： 蛋白質合成（轉譯）過程依賴於 mRNA（攜帶信息）、tRNA（攜帶胺基酸並識別密碼子）和 rRNA（構成核糖體並催化肽鍵形成）。這個過程本身就高度依賴 RNA 的功能。

基因表達分析（Gene expression analysis）是研究基因在特定時間、特定細胞或組織中被轉錄成 RNA 的水平，從而推斷基因功能和調控的技術。基因表達水平的變化通常預示著細胞生理狀態或生物過程的改變。

以下是兩種常用於基因表達分析的方法：

1. 定量聚合酶鏈式反應 (Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)

   • 原理： qPCR（也稱為實時 PCR, Real-time PCR）是一種基於 PCR 技術的方法，它可以在反應過程中實時監測 DNA 擴增產物的量。通過使用螢光染料（如 SYBR Green）或螢光標記的探針（如 TaqMan 探針），DNA 聚合酶在複製 DNA 時，螢光信號會增強。儀器會記錄螢光信號的增長，並繪製出擴增曲線。
   • 應用於基因表達分析：
     1. RNA 提取與反轉錄： 首先從樣本中提取總 RNA。由於 PCR 只能擴增 DNA，因此需要將 RNA 反轉錄成互補 DNA (complementary DNA, cDNA) 作為模板。
     2. 設計引物： 為目標基因設計特異性的引物對，用於擴增目標基因的 cDNA 片段。
     3. 定量： 將 cDNA 模板、引物、dNTPs、DNA 聚合酶和螢光染料/探針加入反應體系，進行 PCR 擴增。儀器實時監測螢光信號。
     4. 數據分析： 數據以螢光信號隨循環數變化的曲線表示。通常關注「閾值循環數」（Ct value），即螢光信號達到預設閾值所需的循環數。Ct 值越小，表示起始模板量越多（即基因表達水平越高）。
     5. 相對定量： 通常會使用內參基因（如 GAPDH, β-actin）作為對照，以校正 RNA 提取和反轉錄的效率差異。透過比較目標基因和內參基因的 Ct 值差異，可以計算出目標基因的相對表達量。
   • 優點： 高靈敏度、高特異性、定量準確、快速、可檢測少量樣本。
   • 缺點： 只能檢測少量預設的目標基因，不適合大規模基因表達譜的篩查。

2. RNA 測序 (RNA Sequencing, RNA-Seq)

   • 原理： RNA-Seq 是一種基於新一代測序 (Next-Generation Sequencing, NGS) 技術的基因表達分析方法。

此題結合了 DNA 的鹼基組成規則（Chargaff's rules）和高溫環境對 DNA 穩定性的影響。

第一部分：計算 DNA 鹼基比例

根據 Watson-Crick 的 DNA 雙螺旋模型，DNA 的雙鏈結構中存在嚴格的鹼基配對規則：腺嘌呤 (Adenine, A) 總是與胸腺嘧啶 (Thymine, T) 配對，而鳥嘌呤 (Guanine, G) 總是與胞嘧啶 (Cytosine, C) 配對。這意味著：

• A = T
• G = C
• 因此，A + G = T + C，且 A + G + T + C = 100%。
• A + T 的比例 代表 the AT content，G + C 的比例 代表 the GC content。

對於細菌 X：
已知 A 的比例為 32%。
根據 A = T 規則，T 的比例也為 32%。
因此，A + T 的總比例為 32% + 32% = 64%。
剩餘的鹼基比例為 G + C，即 100% - 64% = 36%。
根據 G = C 規則，G 的比例等於 C 的比例，所以 G = C = 36% / 2 = 18%。

預期比例（細菌 X）：

• A = 32%
• T = 32%
• G = 18%
• C = 18%
  （總計：32+32+18+18 = 100%）

對於細菌 Y：
已知 A 的比例為 17%。
根據 A = T 規則，T 的比例也為 17%。
因此，A + T 的總比例為 17% + 17% = 34%。
剩餘的鹼基比例為 G + C，即 100% - 34% = 66%。
根據 G = C 規則，G 的比例等於 C 的比例，所以 G = C = 66% / 2 = 33%。