111 年 國立成功大學生物科技與產業科學系《生物化學》

此題考驗對標準胺基酸定義的理解。標準胺基酸是指在人體蛋白質中，透過遺傳密碼直接轉譯出來的二十種胺基酸。

• (a) Glycine (甘胺酸) 是最簡單的胺基酸，屬於標準胺基酸。
• (b) Ornithine (鳥胺酸) 是尿素循環的中間產物，不是蛋白質的組成單元，因此不是標準胺基酸。
• (c) Tyrosine (酪胺酸) 是一種芳香族胺基酸，屬於標準胺基酸。
• (d) N-formylmethionine (N-甲醯基甲硫胺酸) 是原核生物蛋白質合成的起始胺基酸，雖然在轉譯後會被移除，但有時也被視為一種特殊的起始胺基酸，不過在嚴格定義的「標準」二十種胺基酸之外。

此題考驗對胺基酸殘基在特定 pH 下電荷狀態的判斷，進而推算胜肽的總電荷。pH 7 屬於生理 pH 範圍，接近中性。

首先，我們需要檢查此胜肽序列中是否含有帶有離子化側鏈的胺基酸。標準胺基酸中，帶有酸性側鏈（在 pH 7 下帶負電）的有 Aspartate (D) 和 Glutamate (E)。帶有鹼性側鏈（在 pH 7 下帶正電）的有 Lysine (K)、Arginine (R) 和 Histidine (H)。

此胜肽序列為：Val (V) - Ser (S) - Tyr (Y) - Ser (S) - Met (M) - Glu (E) - Asn (N) - Phe (F) - Arg (R) - Trp (W) - Gly (G) - Lys (K) - Pro (P)。

我們逐一檢查：

• Val (V): 非極性，無離子化側鏈。
• Ser (S): 極性，無離子化側鏈。
• Tyr (Y): 芳香族，酚羥基的 pKa 約為 10，在 pH 7 下幾乎不帶電。
• Met (M): 非極性，無離子化側鏈。

核心觀念

本題考查蛋白質分離方法的「主要分離依據」。

蛋白質的極性主要與其表面胺基酸組成及疏水性有關。蛋白質表面的極性基團與非極性基團比例不同，會造成其對固定相及溶劑的親和力不同，因此可利用色層分析加以分離。

其中，**逆相層析（reverse phase chromatography）**是依據分子的疏水性／極性差異分離蛋白質。固定相通常具有非極性的疏水性基團，蛋白質越疏水，與固定相作用越強，越晚被洗脫；較具極性的蛋白質則較早洗脫。

解題方法

判斷各選項的核心分離原理：

• 依分子大小：size exclusion chromatography
• 依溶解度：ammonium sulfate precipitation
• 依分子量：SDS-PAGE
• 依淨電荷：ion exchange chromatography
• 依疏水性／極性：reverse phase chromatography

題目問的是依據蛋白質的 polarity 分離，因此應選擇利用疏水性差異的逆相層析。

逆相層析通常以非極性固定相，例如 C4、C8 或 C18，吸附蛋白質。增加有機溶劑比例或改變流動相條件後，蛋白質依疏水性由弱至強依序洗脫：

$$\text{極性較高、疏水性較低的蛋白質} \rightarrow \text{較早洗脫}$$ $$\text{極性較低、疏水性較高的蛋白質} \rightarrow \text{較晚洗脫}$$

選項分析

a. Size exclusion chromatography

錯誤。排阻層析又稱凝膠過濾或分子篩層析，主要依據分子的大小與水動力體積分離。較大的蛋白質無法進入填料孔洞，會較早流出；較小的蛋白質可進入孔洞，路徑較長，因此較晚流出。其主要分離依據不是極性。

b. Ammonium sulfate precipitation

錯誤。硫酸銨沉澱是利用不同蛋白質在高鹽濃度下的溶解度差異進行分級沉澱，稱為鹽析（salting out）。

此題考驗對醣類結構中糖苷鍵（glycosidic bond）的命名和識別能力。題目提供了一個二醣的結構圖，需要判斷其連接方式。

首先，我們需要識別圖中連接兩個單醣單元的鍵。糖苷鍵的命名包含兩個部分：

1. α 或 β 構型: 這取決於連接兩個單醣的 C1 原子的構型。如果 C1 上的羥基（或連接的基團）與主鏈（通常指 C5 上的 CH2OH 基團）在同側（下），則為 α 鍵；如果在異側（上），則為 β 鍵。
2. 連接的碳原子編號: 標明了兩個單醣單元中，哪兩個碳原子之間形成了糖苷鍵。

此題考驗對轉胺反應（transamination）的理解。轉胺反應是胺基酸代謝中的一個重要過程，通常涉及胺基酸將其 α-胺基轉移到 α-酮酸上，形成新的胺基酸和新的 α-酮酸。這個反應通常由輔酶 PLP（pyridoxal phosphate）催化。

轉胺反應的通式是：
胺基酸 (R1-CH(NH2)-COOH) + α-酮酸 (R2-CO-COOH) ⇌ α-酮酸 (R1-CO-COOH) + 胺基酸 (R2-CH(NH2)-COOH)

在生物體內，最常見的轉胺反應是胺基酸與 α-酮戊二酸 (α-ketoglutarate) 之間的反應。
當一個胺基酸（例如 Aspartate）將其胺基轉移給 α-酮戊二酸時，Aspartate 會變成 Oxaloacetate，而 α-酮戊二酸則變成 Glutamate。

我們來分析各選項：
a. Glutamate → Hexanoic acid + NH3: 這是一個脫胺反應（deamination），不是轉胺反應。而且 Hexanoic acid 是脂肪酸，與此類反應無關。

此題考驗對葡萄糖新生（Gluconeogenesis）的定義理解。葡萄糖新生是指從非碳水化合物前驅物合成葡萄糖的過程。

• a. glucose from non-carbohydrate precursors: 這是葡萄糖新生的正確定義。常見的非碳水化合物前驅物包括乳酸、丙酮酸、甘油、以及某些胺基酸。
• b. glycogen from glucose: 這是肝醣合成（glycogenesis）的過程，從葡萄糖合成肝醣儲存。
• c. pyruvate from glucose: 這是葡萄糖分解代謝（glycolysis）的最後一步，將葡萄糖分解為丙酮酸。

此題考驗對類固醇荷爾蒙（steroid hormones）來源的知識。所有類固醇荷爾蒙都源自膽固醇（cholesterol）。題目要求找出「不是」由膽固醇衍生的選項。

• a. Testosterone (睪固酮): 是雄性激素，屬於類固醇荷爾蒙，由膽固醇合成。
• b. Estradiol (雌二醇): 是主要的雌性激素，屬於類固醇荷爾蒙，由膽固醇合成。
• c. Cortisol (皮質醇): 是糖皮質激素，屬於類固醇荷爾蒙，由膽固醇合成。

核心觀念

本題考查四種核苷三磷酸在細胞中的主要生物功能，以及 IMP 在嘌呤核苷酸代謝中的定位。

常見功能可整理如下：

• ATP：細胞通用能量貨幣，並參與多種磷酸化反應。
• GTP：蛋白質合成、G 蛋白訊號傳遞及微管動力學。
• UTP：醣類活化與醣代謝，例如 UDP-glucose 的生成。
• CTP：磷脂質及其他脂質的生合成。
• dTTP（TTP）：DNA 合成所需的胸腺嘧啶核苷酸。
• IMP：嘌呤核苷酸生合成的共同中間產物，可進一步生成 AMP 或 GMP，但不是 RNA 的標準單體。

解題方法

逐一比對各選項所述核苷酸的主要功能即可。判斷重點是：

1. IMP 是否屬於 RNA 的標準單體。
2. IMP 是否能作為 AMP 的生合成前驅物。
3. 脂質合成所需的活化核苷酸是否為 TTP 或 CTP。
4. UTP 與 GTP 的經典代謝功能是否相符。

選項分析

a. IMP is one of the monomers of RNA.

錯誤。

RNA 的標準單體為 ATP、GTP、CTP 和 UTP，聚合後分別提供腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶。

IMP 是次黃嘌呤核苷酸，主要是嘌呤核苷酸生合成的中間產物。IMP 可分流生成 AMP 或 GMP：

$$\text{IMP} \rightarrow \text{adenylosuccinate} \rightarrow \text{AMP}$$

或：

$$\text{IMP} \rightarrow \text{XMP} \rightarrow \text{GMP}$$

因此，IMP 不是 RNA 的標準單體。

b. IMP is a biosynthetic precursor of AMP.

正確。

IMP 是 AMP 與 GMP 生合成的共同前驅物。IMP 生成 AMP 時，先與天門冬胺酸及 GTP 參與反應形成 adenylosuccinate，之後釋放 fumarate 生成 AMP：

$$\text{IMP}+\text{Aspartate}+\text{GTP} \rightarrow \text{adenylosuccinate} \rightarrow \text{AMP}$$

此途徑由 adenylosuccinate synthetase 及 adenylosuccinate lyase 催化。

此題考驗對脂肪酸結構和命名法的理解，特別是 α-亞麻酸 (α-linolenic acid, ALA)。題目提供 ALA 的化學結構圖，並要求找出「錯誤」的敘述。

首先，我們需要分析 ALA 的結構：

• 碳鏈長度: 數一下結構圖中的碳原子數量。ALA 是一個 18 個碳原子的長鏈脂肪酸。所以 (a) ALA is a C18 fatty acid. (ALA 是 C18 脂肪酸) 是正確的。
• 不飽和度: ALA 結構圖中含有三個碳-碳雙鍵。含有兩個或更多雙鍵的脂肪酸稱為多不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid)。所以 (b) ALA is a polyunsaturated fatty acid. (ALA 是多不飽和脂肪酸) 是正確的。
• 雙鍵構型: 觀察雙鍵。在圖中，這三個雙鍵都是順式（cis）構型，即雙鍵兩側的氫原子或碳鏈位於同一側。反式（trans）構型的雙鍵在自然界較少見，通常在加工食品中出現。

此題考驗對含氮鹼基（nitrogenous bases）分類的知識。含氮鹼基主要分為兩大類：嘌呤（purines）和嘧啶（pyrimidines）。

• 嘌呤 (Purines): 具有雙環結構。常見的嘌呤包括腺嘌呤 (Adenine, A) 和鳥嘌呤 (Guanine, G)。Hypoxanthine 和 Xanthine 也是嘌呤的衍生物。
• 嘧啶 (Pyrimidines): 具有單環結構。

此題考驗對基因突變（point mutations）影響蛋白質結構的理解，以及各種突變類型的相對可能性。題目要求將四種單鹼基點突變的影響程度，從最可能影響（改變蛋白質結構）到最不可能影響，進行排序。這裡的排序是根據其對最終蛋白質胺基酸序列的影響程度。

四種突變類型是：

1. insertion mutation deep within an intron (內含子深處的插入突變): 內含子（intron）是非編碼區，在 mRNA 加工過程中會被剪接掉。因此，即使內含子發生插入突變，只要剪接位點（splice sites）不受影響，通常不會影響最終的蛋白質序列。
2. substitution mutation at the third position of an exonic codon (外顯子密碼子第三位點的取代突變): 密碼子的第三個位置（也稱為擺動位置，wobble position）對密碼子簡併性（degeneracy of the genetic code）的影響較大。許多胺基酸有多個密碼子，而這些密碼子往往僅在第三個位置上不同。因此，在第三個位置發生單鹼基取代，很可能不會改變所編碼的胺基酸（稱為同義突變，silent mutation），或者會編碼一個性質相似的胺基酸。
3. substitution mutation at the second position of an exonic codon (外顯子密碼子第二位點的取代突變): 密碼子的第二個位置對胺基酸的決定非常關鍵。在第二個位置發生單鹼基取代，極有可能改變所編碼的胺基酸，導致胺基酸序列的改變（稱為錯義突變，missense mutation）。
4. deletion mutation within the first exon of the gene (基因第一個外顯子內的刪除突變): 外顯子（exon）是編碼區。

此題考驗對 DNA 突變類型（點突變）的識別。題目給出一個 DNA 片段的原始序列和突變後的序列，需要判斷發生了哪種類型的突變。

原始序列: T G C C A T T G C G A
突變後序列: T G G C C A T T G C G A

比較兩序列，我們可以發現：
在原始序列的第三個鹼基 C 被替換成了 G。
T G C C A T T G C G A
T G G C C A T T G C G A
^ ^
C G

這個變化是一個鹼基的取代 (substitution)。

接下來，我們需要判斷這個取代突變屬於哪種類型。

• a. missense mutation (錯義突變): 這是指一個點突變導致編碼的胺基酸改變。
• b. conservative missense mutation (保守性錯義突變): 這是指錯義突變導致改變後的胺基酸與原來的胺基酸性質相似（例如，都是疏水性的，或都是帶電的）。
• c. silent mutation (同義突變): 這是指一個點突變，雖然 DNA 序列改變，但由於遺傳密碼的簡併性，編碼的胺基酸並沒有改變。
• d. frameshift mutation (移碼突變): 這是指插入或刪除非 3 的倍數個鹼基，導致後續密碼子的讀取框改變，從而改變後續所有胺基酸序列。
• e. nonsense mutation (無義突變): 這是指一個點突變，將一個編碼胺基酸的密碼子轉變為終止密碼子，導致蛋白質合成提前終止。

在這個例子中，我們只知道 DNA 序列的改變：C 變成了 G。我們不知道這個 DNA 序列編碼什麼蛋白質，也不知道這個突變是否改變了胺基酸。

然而，題目給出的選項是基於「DNA 序列改變」來判斷突變類型的。
如果我們假設這個 DNA 序列被轉錄成 mRNA，然後被翻譯成蛋白質。
原始 DNA: T G C C A T T G C G A

此題考驗對 RNA 處理（RNA processing）過程的理解，特別是真核生物的 mRNA 加工。

我們來逐一分析選項：
a. Exons are cut out before mRNA leaves the nucleus. (外顯子在 mRNA 離開細胞核前被切除。) 這是錯誤的。外顯子 (exons) 是編碼區，在 mRNA 加工過程中會被保留，而內含子 (introns) 才被切除。
b. Ribozymes may function in RNA splicing. (核酶可能在 RNA 剪接中發揮作用。) 這是正確的。RNA 剪接是由剪接體（spliceosome）完成的，剪接體是一個由 snRNP（小核核糖核蛋白）組成的複合體，其中包含 RNA 分子。這些 RNA 分子本身具有催化活性，可以作為核酶（ribozymes）來催化剪接反應。例如，U2 snRNP 和 U6 snRNP 中的 RNA 組分參與了催化過程。
c. RNA splicing can be catalyzed by tRNA. (RNA 剪接可以由 tRNA 催化。) 這是錯誤的。tRNA (轉運 RNA) 主要負責將胺基酸運送到核醣體以參與蛋白質合成。

此題考驗對選擇性剪接（alternative splicing）的理解。選擇性剪接是真核生物 mRNA 加工過程中的一種機制，它允許從一個基因的單一前驅 mRNA（pre-mRNA）產生多種不同的 mRNA 分子，進而產生多種不同的蛋白質。

我們來分析各選項：
a. is a mechanism for increasing the rate of translation. (是提高轉譯速率的機制。) 選擇性剪接主要影響 mRNA 的結構和種類，進而影響蛋白質的產生。它本身並不是直接提高轉譯速率的機制。
b. can allow the production of proteins of different sizes and functions from a single mRNA. (可以從單一 mRNA 產生不同大小和功能的蛋白質。) 這是選擇性剪接的核心功能。通過選擇性地包含或排除某些外顯子，或者使用不同的剪接位點，可以產生具有不同胺基酸序列、不同大小和不同功能的蛋白質。

此題考驗對細胞分化和基因表達調控的理解。同一個體中的不同細胞類型（如神經細胞和胰腺細胞）具有相同的基因組（DNA），但它們表達的蛋白質卻不同，這是細胞分化的基礎。這種差異表達是由基因表達調控機制決定的。

我們來分析選項：
a. genes (基因): 同一個體的細胞具有相同的基因組，因此神經細胞和胰腺細胞含有幾乎相同的基因。雖然有些細胞在分化過程中會丟失某些基因（如紅血球），但這不是普遍現象，而且主要的差異表達不是因為基因的有無。
b. regulatory sequences (調控序列): 調控序列（如啟動子、增強子、沉默子等）是 DNA 上的非編碼區域，它們與轉錄因子結合，調控基因的轉錄。不同細胞類型確實可以有不同的調控序列活性，但這通常是通過與調控蛋白的相互作用來實現的。
c. sets of regulatory proteins (調控蛋白質的集合): 這是最主要的差異。細胞內表達的轉錄因子（一類調控蛋白質）的種類和豐度，是決定哪些基因被開啟或關閉的關鍵因素。

此題考驗對短串聯重複序列（Short Tandem Repeats, STRs）在 DNA 指紋分析（DNA fingerprinting）中應用的理解。STRs 是基因組中高度多態性的區域，它們的特點是重複單元（通常是 2-6 個鹼基）在特定位點重複多次，且重複次數因個體而異。

我們來分析選項：
a. The number of repeats varies widely from person to person or animal to animal. (重複的次數因人或動物而異，差異很大。) 這是 STRs 在 DNA 指紋分析中最重要的特點。每個個體在特定 STR 位點上的重複次數是獨一無二的（除了同卵雙胞胎），這種高度的多樣性使得 STRs 成為區分個體的理想標記。
b. The sequence of DNA that is repeated varies significantly from individual to individual. (重複的 DNA 序列本身因個體差異很大。) 雖然 STR 位點的重複單元序列可能在不同位點或不同物種間有所不同，但在同一個體、同一物種的同一 STR 位點上，重複的單元序列通常是相同的。個體間的主要差異在於重複的「次數」，而不是重複的「序列」。

此題考驗對誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）技術的理解。iPSCs 技術是通過重編程 (reprogramming) 成年體細胞（如皮膚細胞）使其恢復到類似胚胎幹細胞的多能狀態。

這項技術的核心是引入特定的轉錄因子，這些轉錄因子能夠「重啟」成體細胞的發育程式，使其重新獲得分化為體內所有細胞類型的能力。最初，山中伸彌（Shinya Yamanaka）及其團隊發現，僅需引入四個特定的轉錄因子（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc），即可將小鼠和人類的成體細胞重編程為 iPSCs。這些因子通常通過病毒載體（如逆轉錄病毒）導入。

我們來分析選項：
a. A retrovirus is used to introduce four specific regulatory genes. (使用逆轉錄病毒引入四個特定的調控基因。) 這是正確的。逆轉錄病毒是常用的基因遞送載體，可以將目標基因整合到宿主細胞的基因組中。山中因子（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc）就是這四個關鍵的調控基因。

此題考驗對基因功能研究中，如何通過基因修飾（如突變）來研究其功能的理解。題目描述的過程是：首先體外（in vitro）對一個基因進行突變，然後將這個突變基因克隆並重新插入細胞。為了讓這個突變基因在細胞的基因組中取代原來的野生型基因，需要發生特定的分子事件。

這裡描述的實驗設計，通常是為了產生基因敲除（gene knockout）或基因替換（gene replacement）的細胞或生物體。

我們來分析選項：
a. recombination resulting in replacement of the wild type with the mutated gene (重組導致突變基因替換野生型基因。) 這是正確的。在許多生物體（如酵母、小鼠）中，當外源 DNA 插入細胞時，如果外源 DNA 兩側有與基因組中目標區域同源的序列（即同源重組，homologous recombination），則可以發生重組事件，用插入的外源 DNA（在此例中是突變基因）替換掉細胞基因組中的野生型基因。這是實現基因替換或敲除的關鍵步驟。
b. use of a microarray to verify continued expression of the original gene (使用微陣列驗證原始基因的持續表達。

核心觀念

RNA interference（RNAi）是利用短雙股 RNA（如 siRNA 或由 shRNA 產生的 siRNA），使特定 mRNA 被降解，或抑制其翻譯。因此，RNAi 的主要效果是：

$$\text{基因表現降低（gene knockdown）}$$

而不是直接改變或刪除染色體上的 DNA。

基本機制如下：

1. 雙股 RNA 經 Dicer 切割成 siRNA。
2. siRNA 與 RISC（RNA-induced silencing complex）結合。
3. siRNA 的導引股與互補的目標 mRNA 配對。
4. Argonaute 等蛋白切割 mRNA，或抑制其翻譯，使相應蛋白質產量下降。

因此，本題的判斷重點是：該目的是否能藉由「特異性降低某基因的 mRNA 或翻譯」來達成。

解題方法

逐一檢查各選項：

• 若目的是降低某個有害基因的表現，RNAi 可以達成。
• 若要區分兩個不同 allele，必須有序列差異，使 siRNA 能選擇性辨識其中一個 allele。
• 若要真正刪除 DNA 序列或產生可遺傳的基因剔除，RNAi 通常無法達成。
• RNAi 會降低目標基因表現，不能直接提高某蛋白質的濃度。

選項分析

a. to decrease the production from a harmful mutated gene

正確。若有害突變基因產生有害蛋白質，可設計與其 mRNA 互補的 siRNA，使該 mRNA 降解或抑制翻譯，降低有害蛋白質的產生。

這是 RNAi 的典型應用，例如抑制顯性有害突變基因的表現。

b. to destroy an unwanted allele in a homozygous individual

錯誤。RNAi 的作用標的是 mRNA，不是染色體上的 DNA allele，因此不能真正「摧毀」或刪除 allele。

此外，若個體為 homozygous，兩條同源染色體上的 allele 序列相同，RNAi 通常無法只抑制其中一個而保留另一個；設計出的 RNA 會同時作用於兩份相同的基因拷貝。

c. to destroy an unwanted allele in a heterozygous individual

此題考驗對二脫氧核苷酸（dideoxyribonucleotides, ddNTPs）在分子生物學中的應用。二脫氧核苷酸是 Sanger 測序法（Sanger sequencing）或稱鏈終止法（chain-termination method）的核心試劑。

Sanger 測序法的原理是：在 DNA 聚合反應中，加入正常的四種脫氧核苷酸（dNTPs）以及一種 ddNTP。當 DNA 聚合酶將 ddNTP 摻入到正在合成的 DNA 鏈中時，由於 ddNTP 缺少 3' 端的羥基，DNA 鏈的延長就會終止。通過使用不同標記（如放射性同位素或螢光染料）的四種 ddNTPs（ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP），並在特定條件下進行反應，可以產生一系列不同長度、在末端帶有特定標記的 DNA 片段。通過分析這些片段的長度及其末端的標記，就可以推斷出 DNA 的序列。

我們來分析各選項：
a. separate DNA fragments (分離 DNA 片段): DNA 片段的分離通常通過凝膠電泳（gel electrophoresis）來實現，而 ddNTPs 只是用於產生特定長度的片段，本

核心觀念

本題考脂質的基本組成與分類：

• 蠟（waxes）：長鏈脂肪酸與長鏈醇形成的酯。
• 脂肪（fats）：甘油與三分子脂肪酸形成的三酸甘油酯。
• 鞘磷脂（sphingomyelin）：以鞘氨醇為骨架，接上脂肪酸、磷酸與膽鹼。
• 神經節苷脂（ganglioside）：含鞘氨醇、脂肪酸及含唾液酸的寡糖，屬於鞘醣脂。

題目給出的五種分子成分為：

$$\text{glycerol、fatty acid、phosphate、long-chain alcohol、carbohydrates}$$

其中，鞘氨醇屬於具有長碳鏈的胺基醇，因此在本題的分類中歸入 long-chain alcohol。

解題方法

逐一列出各類脂質的核心骨架，再比較題目指定的成分是否存在。

脂質	主要組成
蠟	脂肪酸＋長鏈醇
鞘磷脂	長鏈醇（鞘氨醇）＋脂肪酸＋磷酸
脂肪	甘油＋脂肪酸
磷脂醯膽鹼	甘油＋脂肪酸＋磷酸
神經節苷脂	長鏈醇（鞘氨醇）＋脂肪酸＋醣類

（a）同時存在於蠟與鞘磷脂的兩種成分

蠟含有：

• fatty acid
• long-chain alcohol

鞘磷脂含有：

• fatty acid
• long-chain alcohol
• phosphate

因此兩者共同具有：

1. fatty acid
2. long-chain alcohol

補充判斷：

• glycerol：蠟與鞘磷脂皆非其主要骨架，錯誤。
• phosphate：鞘磷脂有，但蠟沒有，錯誤。
• carbohydrates：兩者皆非以醣類為主要組成，錯誤。

（b）同時存在於脂肪與磷脂醯膽鹼的兩種成分

脂肪是甘油與脂肪酸形成的三酸甘油酯：

$$\text{glycerol} + 3(\text{fatty acid}) \longrightarrow \text{triacylglycerol}$$

磷脂醯膽鹼則以甘油為骨架，接上兩條脂肪酸、磷酸及膽鹼：

核心觀念

本題考查嘌呤補救途徑中三類酵素的反應定義：

• Nucleotidase（核苷酸酶）：水解核苷酸的磷酸酯鍵，移除磷酸。
• Phosphorylase（磷酸解酶）：以無機磷酸切開核苷的糖苷鍵，產生鹼基與核糖-1-磷酸。
• Phosphoribosyltransferase（磷酸核糖轉移酶）：將 PRPP 的磷酸核糖基轉移至游離鹼基，形成核苷酸。

本題涉及的三種物質分別是：

• Guanine：嘌呤鹼基
• Guanosine：鹼基與核糖形成的核苷
• GMP：鹼基、核糖與磷酸形成的核苷酸

解題方法

先依照分子層級判斷反應：

$$\text{鹼基} \rightarrow \text{核苷} \rightarrow \text{核苷酸}$$

也就是：

$$\text{Guanine} \rightarrow \text{Guanosine} \rightarrow \text{GMP}$$

接著觀察每一類酵素所處理的鍵結：

1. GMP 變成 Guanosine，是移除 5′-磷酸，屬於核苷酸水解。
2. Guanosine 變成 Guanine，是切開鹼基與核糖之間的糖苷鍵，並以無機磷酸進行磷酸解。
3. Guanine 變成 GMP，是將磷酸核糖基轉移到游離鹼基上，屬於嘌呤補救反應。

各反應與酵素

(a) Nucleotidase

核苷酸酶催化 GMP 的去磷酸化：

$$\text{GMP}+\mathrm{H_2O} \longrightarrow \text{Guanosine}+\mathrm{P_i}$$

此反應的重點是水解核糖 5′-磷酸酯鍵，產物為 guanosine 與無機磷酸。典型酵素為 5′-nucleotidase。

因此，圖中由 GMP 指向 Guanosine 的反應，就是 nucleotidase 催化的反應。

(b) Phosphorylase

嘌呤核苷磷酸解酶催化 guanosine 的磷酸解：

$$\text{Guanosine}+\mathrm{P_i} \rightleftharpoons \text{Guanine}+\text{Ribose-1-phosphate}$$

此反應不是加水水解，而是利用無機磷酸切開 guanosine 的 N-糖苷鍵，因此稱為 phosphorolysis。典型酵素為 purine nucleoside phosphorylase（PNP）。

核心觀念

本題考查依「催化反應類型」辨識四類酵素：

• Isomerase：催化同一分子內的結構重排。
• Kinase：將磷酸基轉移至受體分子，常以 ATP 作為磷酸基供體。
• Phosphatase：利用水解反應移除受體上的磷酸基。
• Fatty acid synthase：以 acetyl-CoA 為起始單位、malonyl-CoA 為延長單位，利用 NADPH 合成脂肪酸。

解題方法

可依序回答每種酵素的四項內容：

1. 催化的反應本質。
2. 典型反應式或代表性例子。
3. 主要生理功能。
4. 容易混淆的特徵。

（1）Isomerase

Isomerase（異構酶）催化同一分子內的原子或官能基重新排列，使底物轉變為其異構物。此反應通常不涉及分子組成改變，因此反應前後的分子式與總能量狀態大致相同。

典型例子為 glycolysis 中的 phosphoglucose isomerase：

$$\text{Glucose-6-phosphate} \rightleftharpoons \text{Fructose-6-phosphate}$$

此反應將醛糖結構轉變為酮糖結構，磷酸基位置與分子總組成並未改變。

其他例子包括：

• Triose phosphate isomerase：dihydroxyacetone phosphate 與 glyceraldehyde-3-phosphate 的互相轉換。
• Phosphoglycerate mutase：將磷酸基在同一分子內重新定位。

重點：Isomerase 是「分子內重排」，不是加入或移除特定原子。

（2）Kinase

Kinase（激酶）催化磷酸基由供體分子轉移至受體分子，最常見的磷酸基供體是 ATP。受體可以是糖、蛋白質、脂質或其他代謝物。

一般反應可表示為：

$$\text{ATP}+\text{受體} \rightarrow \text{ADP}+\text{受體-phosphate}$$

典型例子為 hexokinase：

$$\text{Glucose}+\text{ATP} \rightarrow \text{Glucose-6-phosphate}+\text{ADP}$$

蛋白質激酶則將磷酸基轉移至蛋白質的 serine、threonine 或 tyrosine 殘基，藉此改變蛋白質的活性、定位或交互作用。

Kinase 反應常具有下列功能：

• 啟動或調節代謝途徑。
• 利用磷酸化捕捉細胞內的葡萄糖。
• 傳遞細胞訊息。
• 調控蛋白質活性。

重點：Kinase 是「加上磷酸基」，本質為磷酸基轉移反應，不一定是單純消耗 ATP 的反應。

（3）Phosphatase

Phosphatase（磷酸酶）催化磷酸酯或磷酸酐鍵的水解，將底物上的磷酸基移除，產生去磷酸化產物與無機磷酸鹽。

一般反應可表示為：

$$\text{受體-phosphate}+\mathrm{H_2O} \rightarrow \text{受體}+\mathrm{P_i}$$

例如 protein phosphatase 可將蛋白質上的 phosphoserine、phosphothreonine 或 phosphotyrosine 去磷酸化：

$$\text{Protein-PO}_3^{2-}+\mathrm{H_2O} \rightarrow \text{Protein}+\mathrm{P_i}$$

Phosphatase 與 kinase 常形成相反的調節作用：

核心觀念

本題考查蜂毒胜肽 Melittin 活化磷脂酶 A₂（phospholipase A₂, PLA₂）後，如何促進花生四烯酸代謝與前列腺素生成，進而造成局部發炎。

細胞膜磷脂的第 2 位碳（$sn$-2）常接有花生四烯酸（arachidonic acid, AA）。PLA₂水解此酯鍵後，會產生：

$$\text{膜磷脂} \xrightarrow{\text{PLA}_2} \text{溶血磷脂}+\text{花生四烯酸}$$

花生四烯酸是多種發炎介質的前驅物，其中經由環氧化酶（cyclooxygenase, COX）途徑可生成前列腺素（prostaglandins）。

解題方法

依照「Melittin 活化 PLA₂」這項提示，沿著下列路徑推導：

$$\text{Melittin} \rightarrow \text{PLA}_2\text{ 活化} \rightarrow \text{膜磷脂水解} \rightarrow \text{花生四烯酸釋放} \rightarrow \text{COX 途徑} \rightarrow \text{前列腺素增加} \rightarrow \text{局部發炎}$$

花生四烯酸先經 COX 轉換成前列腺素內過氧化物：

$$\text{AA} \xrightarrow{\text{COX-1/COX-2}} \text{PGG}_2 \rightarrow \text{PGH}_2$$

$PGH_2$ 再依不同細胞所含的酵素，生成 $PGE_2$、$PGI_2$、$PGD_2$ 等前列腺素。這些物質會造成：

核心觀念

本題考查膽固醇生合成的負回饋抑制。

膽固醇生合成的關鍵反應為：

$$\text{HMG-CoA} \xrightarrow{\text{HMG-CoA reductase}} \text{mevalonate}$$

HMG-CoA reductase 是膽固醇生合成的速率調控酵素。當細胞內膽固醇濃度升高時，會抑制此酵素的活性，降低膽固醇自身的合成量，這稱為終產物負回饋抑制。

解題方法

由普通飲食改為素食後，通常會有以下變化：

1. 動物性食物攝取量下降，因此膳食膽固醇攝取量減少。
2. 肝細胞可取得的膽固醇下降，細胞內膽固醇濃度降低。
3. 原本由膽固醇施加的負回饋抑制減弱。
4. HMG-CoA reductase 的活性及表現量上升。
5. HMG-CoA 轉換成 mevalonate 的速率增加。

可用反應速率概念表示：

$$v_{\text{HMG-CoA reductase}} \uparrow \quad\Longrightarrow\quad \text{mevalonate 生成速率} \uparrow$$

因此，在題目所設定的生化調控模型中，肝臟生成並釋放至血液中的 mevalonate 增加，故人類血漿 mevalonate 濃度預期會上升。

核心觀念

這題考查條件性基因剔除（conditional knockout）的基本原理，核心元件包括：

• Cre recombinase：由噬菌體 P1 的 cre 基因編碼之位點特異性重組酶。
• loxP site：Cre 所辨識的 DNA 序列，全長 34 個鹼基，由兩側 13 bp 反向重複序列及中央 8 bp spacer 組成。
• floxed gene：目標基因的重要外顯子或功能區段兩側預先置入 loxP，稱為被「flox」的基因。

Cre 會辨識兩個 loxP 位點，並催化其間 DNA 的重組。因此，只要控制 Cre 在特定組織、特定發育階段或特定時間表現，就能選擇性地剔除目標基因。

解題方法

回答此題可依序說明兩個元件的角色，再解釋它們如何共同造成條件性基因剔除。

1. loxP 的角色：標記要被剔除的 DNA 區段

研究者先將兩個 loxP 位點設計在目標基因關鍵區段的兩側，例如重要外顯子兩側：

$$\text{loxP} - \text{目標基因關鍵區段} - \text{loxP}$$

這種結構稱為 floxed allele。在尚未表現 Cre 的細胞中，目標基因仍保留完整結構，因此通常可以正常轉錄與表現。

loxP 本身主要是「重組標記」，不會單獨切除 DNA；必須有 Cre recombinase 參與，才會發生位點特異性重組。

2. Cre recombinase 的角色：辨識 loxP 並催化重組

Cre 會辨識兩個 loxP 位點，將它們排列靠近並進行重組。當兩個 loxP 位點方向相同時，兩者之間的 DNA 片段會被切除，剩下一個 loxP 位點：

$$\text{loxP} - \text{目標區段} - \text{loxP} \;\xrightarrow{\text{Cre}}\; \text{單一 loxP}$$

被切除的 DNA 片段通常會形成環狀 DNA，之後在細胞中被降解，因此目標基因的關鍵區段消失，導致：

1. 目標基因無法產生完整 mRNA；
2. 轉錄可能產生移碼或提前終止；
3. 產生失去功能的蛋白質；
4. 達成基因剔除效果。

3. 為何能形成「條件性」剔除

Cre 的表現可由組織特異性或誘導型啟動子控制。例如：

• 在肝細胞表現 Cre：只剔除肝臟中的目標基因。
• 在神經細胞表現 Cre：只剔除神經系統中的目標基因。
• 使用 Cre-ER 系統：給予誘導物後，Cre 才進入細胞核並作用，實現時間控制。

核心觀念

點突變（point mutation）是單一核苷酸位置發生改變，最典型形式是單一鹼基替換（base substitution）。依替換後對開放閱讀框（open reading frame, ORF）中密碼子與胺基酸序列的影響，可分為：

1. 同義突變（silent mutation）
2. 錯義突變（missense mutation）
3. 無義突變（nonsense mutation）

判斷關鍵是比較突變前後的密碼子，並依遺傳密碼表判定其所對應的胺基酸或終止訊號。

---

一、鹼基替換的基本分類

單一核苷酸替換依化學性質可分為：

• 轉換（transition）：嘌呤與嘌呤互換，或嘧啶與嘧啶互換。

  $A \leftrightarrow G,\qquad C \leftrightarrow T$

• 顛換（transversion）：嘌呤與嘧啶之間互換。

  $A \text{ 或 } G \leftrightarrow C \text{ 或 } T$

這種分類描述「核苷酸如何改變」；silent、missense、nonsense 則描述「密碼子功能如何改變」。兩者是不同層次的分類。

---

二、對 ORF 與胺基酸序列的影響

ORF 是由連續、固定閱讀框的三核苷酸密碼子所組成。每個密碼子通常決定一個胺基酸，某些密碼子則是終止密碼子：

$\text{UAA},\ \text{UAG},\ \text{UGA}$

單一鹼基替換若發生在編碼區，會改變該位置的密碼子。其結果如下。

1. 同義突變（silent mutation）

突變前後的密碼子不同，但仍編碼相同胺基酸，因此胺基酸序列不變。

例如：

$\text{DNA coding strand: } GAA \rightarrow GAG$

轉錄為 mRNA 後為：

$\text{GAA} \rightarrow \text{GAG}$

GAA 與 GAG 皆編碼麩胺酸（Glu, E），因此：

$\text{Glu} \rightarrow \text{Glu}$

同義突變常見於遺傳密碼的簡併性，尤其是密碼子第三個位置的改變。雖然蛋白質主要序列不變，仍可能影響：

• mRNA 穩定性
• 翻譯效率
• 密碼子使用偏好
• 剪接調控訊號
• 蛋白質摺疊速度

在一般考試判斷中，silent mutation 的主要結論是「不改變胺基酸序列」。

2. 錯義突變（missense mutation）

突變使原本編碼某一胺基酸的密碼子，改為編碼另一種胺基酸，因此胺基酸序列中的一個位置發生替換。

例如：

$\text{DNA coding strand: } GAA \rightarrow GTA$

mRNA 密碼子為：

$\text{GAA} \rightarrow \text{GUA}$

其胺基酸變化為：

$\text{Glu} \rightarrow \text{Val}$

錯義突變的影響取決於新舊胺基酸的性質與位置：

• 性質相近，可能是保守性錯義突變，對功能影響較小。
• 性質差異大，可能破壞蛋白質摺疊、活性部位或結合界面。
• 若發生於酵素活性中心、受體結合位點或結構核心，通常影響較明顯。

3. 無義突變（nonsense mutation）

突變使原本編碼胺基酸的密碼子變成終止密碼子，導致翻譯提早終止。

例如：

核心觀念

本題考查 CRISPR-Cas9 基因編輯系統中兩個核心元件的分工：

• small guide RNA（sgRNA）：負責辨認目標 DNA 序列，並將 Cas9 引導至正確位置。
• Cas9 endonuclease：負責切割目標 DNA 的兩股，形成特定位置的雙股斷裂。

CRISPR-Cas9 的特異性主要來自 sgRNA 與目標 DNA 的互補配對；實際的核酸切割作用則由 Cas9 蛋白完成。

解題方法

回答此題可依照「辨認目標」與「執行切割」兩個功能分段說明。

1. sgRNA 的作用：辨認並定位目標 DNA

sgRNA 是經人工設計的導引 RNA，通常由兩部分組成：

• guide sequence：約 20 個核苷酸，與目標 DNA 序列互補。
• scaffold sequence：提供 RNA 的結構，使其能與 Cas9 蛋白穩定結合。

sgRNA 先與 Cas9 結合形成複合體，再利用 guide sequence 與目標 DNA 進行鹼基互補配對，使 Cas9 被定位到特定基因座。目標辨認通常還必須符合 Cas9 的 PAM（protospacer adjacent motif） 要求；以常用的 Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）為例，PAM 通常是 $5'-NGG-3'$。

因此，sgRNA 的主要功能是：

1. 決定 Cas9 要作用的 DNA 位置。
2. 提供目標序列的辨認特異性。
3. 作為 Cas9 的結構性結合平台。

sgRNA 本身不具備切割 DNA 的酵素活性。

2. Cas9 endonuclease 的作用：切割 DNA

Cas9 是一種 RNA-guided endonuclease，會在 sgRNA 引導下辨認具有相符序列與 PAM 的 DNA，並切斷 DNA 雙股。

核心觀念

Ct 值（cycle threshold value，循環閾值）是定量即時反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative RT-PCR, qRT-PCR）中，螢光訊號首次超過預先設定之偵測閾值時所對應的 PCR 循環數。

qRT-PCR 以螢光訊號追蹤 DNA 擴增量：

• 擴增曲線初期為背景期，螢光訊號尚無法可靠區分。
• 進入指數擴增期後，產物量快速增加。
• 當螢光訊號超過固定閾值時，該循環數即記為 Ct 值。

因此，Ct 值反映樣品中最初模板量的多寡。

解題方法

PCR 每循環理想上使目標 DNA 增加一倍。若初始模板量為 $N_0$，經過 $n$ 個循環後：

$$N_n=N_0(1+E)^n$$

其中 $E$ 為擴增效率；理想擴增效率為 $100\%$ 時，$E=1$，因此：

$$N_n=N_0 2^n$$

當產物量達到固定閾值 $N_T$ 時：

$$N_T=N_0(1+E)^{Ct}$$

整理可得：

$$Ct=\frac{\log(N_T)-\log(N_0)}{\log(1+E)}$$

在閾值固定且擴增效率相近的條件下，$N_0$ 越大，達到閾值所需的循環數越少，因此 Ct 值越低；$N_0$ 越小，Ct 值越高。

以理想效率計算，初始模板量相差 2 倍，Ct 值約相差 1；相差 10 倍時：

$$\Delta Ct\approx \log_2(10)\approx 3.32$$

所以，Ct 值與初始核酸量呈反向關係，但 Ct 值本身是循環數，不是核酸濃度的直接單位。

在 RT-PCR 中的意義

核心觀念

RNA-Seq 是利用高通量次世代定序技術分析細胞或組織中 RNA 種類與含量的方法，主要目的在於建立特定樣本的 transcriptome（轉錄體）。

其核心原理是：

1. 從細胞或組織中萃取總 RNA。
2. 富集 mRNA，或去除 rRNA 以保留較完整的 RNA 種類。
3. 將 RNA 片段化並逆轉錄成互補 DNA（cDNA）。
4. 在 cDNA 兩端接上定序接頭（adapter），建立定序文庫。
5. 以高通量定序平台讀取大量短序列（reads）。
6. 將 reads 比對至參考基因組或轉錄體，並依據各基因獲得的 reads 數量，估算其 RNA 表現量。

因此，RNA-Seq 可視為：

$$\text{RNA 萃取} \rightarrow \text{cDNA 文庫製備} \rightarrow \text{高通量定序} \rightarrow \text{序列比對與定量} \rightarrow \text{轉錄體分析}$$

RNA-Seq 不只是測量單一基因，而是能在一次實驗中同時分析大量甚至全部基因的 RNA 表現情形。基因表現量通常與其對應 reads 數量相關；經過樣本總 reads 數、轉錄本長度等因素校正後，可使用 TPM、FPKM 等指標表示表現量。進行不同條件比較時，常使用經統計模型校正的 read counts 進行差異表現分析。

解題方法

本題分為兩部分：

• 前 5 分說明 RNA-Seq 的原理。
• 後 5 分說明 RNA-Seq 可應用於哪些研究。

作答時應同時寫出「實驗流程」與「分析目的」，不能只回答「用來分析 RNA 表現量」，因為完整原理還包含 RNA 如何轉換成可定序的文庫，以及定序資料如何被解讀。

一、RNA-Seq 的實驗原理

RNA-Seq 的基本流程如下。

1. RNA 萃取與品質檢查

先從細胞、組織、血液或其他生物樣本中萃取 RNA，並檢查 RNA 的純度與完整性。RNA 品質不佳會造成文庫偏差，例如部分轉錄本降解、3'端偏好或定序結果不穩定。

2. RNA 選擇與片段化

依研究目的選擇 RNA：

• 以 oligo-dT beads 富集 poly(A) mRNA，可集中分析蛋白質編碼基因。
• 去除 rRNA，可保留較廣泛的 RNA，包括部分非編碼 RNA。
• 若研究 small RNA，則需使用適合小 RNA 的文庫製備流程。

RNA 通常會先片段化，使不同長度的轉錄本能夠被均勻分析。

3. 逆轉錄與文庫製備

片段化後的 RNA 以 reverse transcriptase 逆轉錄成 cDNA，再接上 adapter。Adapter 用於：

• 讓 DNA 片段能固定在定序平台上；
• 提供 PCR 擴增所需的引子位置；
• 加入樣本條碼（index），使多個樣本可混合定序後再分開分析。

4. 高通量定序

定序平台讀取 cDNA 片段的鹼基序列，產生大量短序列 reads。若採用 paired-end sequencing，同一片段的兩端都會被讀取，可提高序列比對、剪接位點與轉錄本結構判定的準確度。

5. 生物資訊分析

原始 reads 必須經過品質控制，去除低品質序列與接頭序列，接著：

• 比對至參考基因組或參考轉錄體；
• 將 reads 分配至基因或轉錄本；
• 計算各基因的 read counts；
• 進行基因表現量定量與統計分析。

若沒有完整的參考基因組，也能透過 de novo transcriptome assembly 組裝轉錄本。

基因表現差異可用下列概念表示：

$$\text{基因表現量} \propto \text{對應至該基因的有效 reads 數量}$$

但實際比較時必須考慮定序深度、轉錄本長度、樣本間變異與生物複本，因此不能直接將兩個樣本的原始 reads 數量視為絕對表現量。

二、RNA-Seq 可應用的研究

1. 差異基因表現分析