111 年 國立成功大學醫學檢驗生物技術研究所《分子生物學及細胞生物學》

本題主要考查細菌操縱組 (operon) 的結構與調控機制，特別是 lac operon。理解操縱組的組成、基因產物功能，以及葡萄糖對 lac operon 的雙重調控（正向與負向調控）是解題關鍵。

核心觀念： 操縱組 (Operon) 是細菌基因調控的基本單位，包含結構基因 (structural genes)、啟動子 (promoter)、操縱子 (operator) 和調節基因 (regulatory gene)。lac operon 是一種誘導型操縱組，其表達受基質 (乳糖) 和葡萄糖濃度的影響。

解題步驟：

1. lac operon 的結構與基因產物：

   • 調節基因 (Regulatory gene)： 位於操縱組外部，編碼阻遏蛋白 (repressor protein)，即 lacI 基因。
   • 結構基因 (Structural genes)： 位於操縱組內部，編碼參與乳糖代謝的酵素。
     • lacZ 基因： 編碼 $\beta$-galactosidase，負責將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，或將乳糖異構為異乳糖 (allolactose)。
     • lacY 基因： 編碼乳糖透酶 (lactose permease)，將乳糖運輸到細胞內。
     • lacA 基因： 編碼硫代半乳糖苷轉乙醯酶 (thiogalactoside transacetylase)，其確切功能尚不明確，但可能參與解毒。
   • 啟動子 (Promoter)： RNA 聚合酶結合並開始轉錄的區域。
   • 操縱子 (Operator)： 位於啟動子下游，是阻遏蛋白結合的位點。

2. 調控機制： lac operon 的調控涉及兩種機制：負向調控 (negative control) 和正向調控 (positive control)。

   • 負向調控 (由阻遏蛋白控制)：
     • 葡萄糖充足 (Glucose present)：
       • 細胞內 cAMP (cyclic AMP) 濃度低。
       • 阻遏蛋白 (由 lacI 基因製造) 結合到操縱子 (operator) 上，阻止 RNA 聚合酶進行轉錄。
       • 此時 lacZ, lacY, lacA 基因的轉錄非常少，幾乎不產生相關蛋白質。
     • 葡萄糖缺乏 (Glucose absent)：
       • 細胞內 cAMP 濃度高。
       • cAMP 與 CAP (catabolite activator protein) 結合，形成 cAMP-CAP 複合物。

本題考查突變的類型及其在實驗中的應用，特別是顯性負突變 (Dominant negative mutation) 的概念。

核心觀念： 顯性負突變是指突變基因產物不僅本身功能異常，還能干擾或抑制野生型 (wild-type) 基因產物的正常功能。這種突變表現出顯性遺傳的特性。

解題步驟：

1. 何謂 Dominant negative mutation？

   • 定義： 顯性負突變 (Dominant negative mutation) 是一種突變，其突變基因產物 (通常是蛋白質) 不僅自身失去正常功能，還能與野生型基因產物相互作用，並以某種方式阻礙野生型產物的正常功能。
   • 機制： 這種突變通常發生在編碼多聚體 (multimer) 蛋白質的基因上，或者在蛋白質需要與其他分子形成複合物才能發揮功能的場合。例如，如果一個蛋白質由兩個相同的亞基 (subunit) 組成，一個突變亞基即使本身無功能，但只要能組裝進二聚體中，就可能破壞整個二聚體的結構或功能。或者，突變蛋白可能錯誤地結合到野生型蛋白的結合位點，從而阻礙野生型蛋白與其正常配偶體結合。
   • 遺傳表現： 由於突變產物能夠「支配」野生型產物的表現，即使只有一個拷貝的突變基因 (雜合子狀態)，表現型也會像純合子突變體一樣，因此稱為「顯性負」。

2. 我們可以在何種實驗應用這個原理？
   顯性負突變在實驗中用途廣泛，主要用於研究蛋白質功能、信號傳導通路以及基因在細胞中的作用。

   • 研究蛋白質功能和相互作用：
     • 確認蛋白質複合物的亞基組成： 引入顯性負突變體，若觀察到特定蛋白質複合物的形成受阻，則可推斷該突變蛋白是該複合物的組成部分。

本題考查分子生物學中常用的載體 (vector) 類型，特別是穿梭載體 (shuttle vector) 的定義及其應用。

核心觀念： 穿梭載體是一種特殊的質體 (plasmid) 或其他載體，它能夠在兩種不同的宿主細胞 (host cell) 中複製和維持。這通常意味著它攜帶了兩個不同來源的複製起始點 (origin of replication, ori) 和相應的選擇標記 (selectable marker)。

解題步驟：

1. 何謂 shuttle vector？

   • 定義： 穿梭載體 (shuttle vector) 是指一種分子載體，它能夠在至少兩種不同的宿主生物體中自主複製並保持穩定。最常見的組合是細菌 (如大腸桿菌, E. coli) 和真核生物 (如酵母菌, Saccharomyces cerevisiae 或哺乳動物細胞)。
   • 結構特點： 為了能在兩種宿主中複製，穿梭載體必須攜帶：
     • 兩種或多種複製起始點 (origins of replication, ori)： 一種用於在第一種宿主 (例如細菌) 中複製，另一種用於在第二種宿主 (例如酵母菌) 中複製。
     • 至少兩個選擇標記 (selectable markers)： 一個標記必須能在第一種宿主中篩選，例如抗生素抗性基因 (如 ampicillin resistance, Ap^R)；另一個標記必須能在第二種宿主中篩選，例如能在特定培養基上生長的營養缺陷型酵母菌株所需的基因 (如 URA3, LEU2)。

2. 我們在分子生物學研究上需要 shuttle vector 達到何種目的？
   穿梭載體的主要目的是在不同實驗系統之間「穿梭」基因或 DNA 片段，極大地提高了實驗的靈活性和效率。

本題考查有機化學和生物化學的基本概念，特別是酸鹼之間的關係。

核心觀念： Lactic acid 是一種有機酸，而 lactate 是其共軛鹼 (conjugate base)。在生理 pH 下，lactic acid 通常以 lactate 的形式存在。

解題步驟：

1. Lactic acid (乳酸)：

   • 化學式為 $CH_3CH(OH)COOH$。
   • 它是一個羧酸 (carboxylic acid)，具有酸性。
   • 在水中會解離，失去羧基上的質子 (H$^+$)，生成 lactate 離子。

2. Lactate (乳酸根離子)：

   • 化學式為 $CH_3CH(OH)COO^-$。
   • 它是 lactic acid 解離後形成的陰離子，是 lactic acid 的共軛鹼。

本題考查 DNA 分子的結構特性，特別是其方向性 (polarity)。

核心觀念： DNA 分子是由核苷酸 (nucleotide) 組成的長鏈。每個核苷酸都含有一個磷酸基團、一個脫氧核糖 (deoxyribose) 和一個含氮鹼基。DNA 分子的方向性由脫氧核糖上的碳原子決定。

解題步驟：

1. 脫氧核糖的結構： 脫氧核糖是一個五碳糖。其碳原子編號從與含氮鹼基相連的碳開始，依次為 1', 2', 3', 4', 5'。

   • 3' 碳： 3' 碳原子上連接一個羥基 (-OH)。
   • 5' 碳： 5' 碳原子上連接一個磷酸基團。

2. DNA 鏈的形成： DNA 鏈中的核苷酸通過磷酸二酯鍵 (phosphodiester bond) 連接。這個鍵是由一個核苷酸的 5' 磷酸基團與下一個核苷酸的 3' 羥基之間形成的。

   • 一個磷酸基團連接到一個糖的 5' 碳。
   • 這個磷酸基團又連接到下一個糖的 3' 碳上的羥基。

本題考查蛋白質分子量與 DNA 長度之間的關係，以及計算平均氨基酸分子量。

核心觀念：

1. 蛋白質是由氨基酸組成的聚合物。
2. DNA 的核苷酸序列決定了蛋白質的氨基酸序列。
3. DNA 的密碼子 (codon) 是由三個核苷酸組成，每個密碼子決定一種氨基酸。
4. 計算蛋白質分子量需要知道其氨基酸數量和平均氨基酸分子量。

解題步驟：

1. 氨基酸的平均分子量：

   • 蛋白質由 20 種標準氨基酸組成。
   • 這些氨基酸的分子量各不相同。
   • 在進行粗略計算時，通常取一個平均值。
   • 平均氨基酸分子量約為 110 道爾頓 (Daltons, Da)。這個值是考慮了氨基酸的分子量以及形成肽鍵時失去一分子水的質量。更精確的平均值約為 109.5 Da，但 110 Da 常用於估算。

2. 計算 cDNA 轉譯的氨基酸數量：

   • cDNA 長度為 99 bp (鹼基對)。
   • 蛋白質的合成是通過 mRNA 進行的，mRNA 的序列由 cDNA 轉錄而來。
   • 密碼子 (codon) 是由三個核苷酸組成，每個密碼子決定一個氨基酸。
   • 因此，99 bp 的 cDNA (或其轉錄出的 mRNA) 可以編碼的氨基酸數量為：
     $\text{氨基酸數量} = \frac{\text{DNA 長度 (bp)}}{\text{每個密碼子的大小 (bp/密碼子)}} = \frac{99 \text{ bp}}{3 \text{ bp/密碼子}} = 33 \text{ 個密碼子}$
   • 重要提示： 這是指編碼的氨基酸數量。實際上，蛋白質合成的起始需要一個起始密碼子 (start codon, AUG)，它編碼甲硫氨酸 (methionine)。在計算長度時，起始密碼子也算一個氨基酸。此外，終止密碼子 (stop codon, UAA, UAG, UGA) 雖然也由三個核苷酸組成，但它不編碼任何氨基酸，而是標誌蛋白質合成的終止。因此，一個長度為 99 bp 的 cDNA，如果其中包含一個完整的開放閱讀框 (open reading frame, ORF)，且起始密碼子在第 1 個密碼子，終止密碼子在第 33 個密碼子，那麼它實際上編碼了 32 個氨基酸 (33 個密碼子 - 1 個終止密碼子)。

核心觀念

本題考查三個層次：

1. Chromatin（染色質）與 Chromosome（染色體）的結構層級
2. 染色質結構如何調控基因轉錄，以及如何隨細胞週期變化
3. 染色質的核小體排列如何造成細胞凋亡時的 DNA 片段化，以及循環游離 DNA（cell-free DNA, cfDNA）的特定片段大小

染色質不是單純的 DNA，而是由 DNA、組蛋白（histones）、非組蛋白及染色質相關 RNA 組成的核蛋白複合體。染色體則是染色質在細胞分裂期間高度凝縮、具有特定形態與功能組織的形式。

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一、Chromatin 與 Chromosome 的結構

1. DNA 雙股螺旋與核小體

真核細胞 DNA 以負電性的磷酸骨架，纏繞在帶正電的組蛋白核心上。組蛋白核心由兩份 H2A、H2B、H3、H4 組成：

$$(H2A)_2(H2B)_2(H3)_2(H4)_2$$

約 $147$ 個鹼基對的 DNA 以約 $1.65$ 圈纏繞在組蛋白八聚體上，形成一個核小體（nucleosome）。相鄰核小體之間的 DNA 稱為 linker DNA，組蛋白 H1 可結合 linker DNA 與核小體入口、出口位置，使染色質更加穩定與凝縮。

染色質的基本排列可表示為：

$$\text{DNA} \rightarrow \text{nucleosome} \rightarrow \text{染色質纖維} \rightarrow \text{DNA loop} \rightarrow \text{高階染色質} \rightarrow \text{染色體}$$

「30 nm fiber」可作為傳統教材中的高階模型，但現代研究指出，活細胞中的染色質更常呈現較不規則、動態的核小體串與局部折疊，而非整條均一的 30 nm 纖維。

2. 染色質的功能性分類

Euchromatin（常染色質）

• 結構較鬆散
• DNA 較容易被轉錄因子與 RNA polymerase 接觸
• 通常具有較高的轉錄活性
• 常見特徵包括 H3K4me3、H3K27ac 等活化標記
• DNA 複製時間通常較早

Heterochromatin（異染色質）

• 結構較緊密
• 轉錄因子較不易進入
• 基因通常呈現低度轉錄或沉默狀態
• 常見 H3K9me3、H3K27me3、DNA methylation 等抑制性標記
• DNA 複製時間通常較晚

異染色質又可分為：

• 構成型異染色質（constitutive heterochromatin）：主要位於著絲點、端粒及高度重複序列區域，通常長期保持凝縮。
• 兼性異染色質（facultative heterochromatin）：依細胞類型、發育階段或訊號而在開放與關閉狀態間轉換，例如失活的 X 染色體。

3. 染色體的結構

在進入有絲分裂前，DNA 先完成複製。一條複製後的染色體由兩條相同的**姊妹染色分體（sister chromatids）**組成，兩者在著絲點附近連接。

染色體的重要結構包括：

• 姊妹染色分體：DNA 複製後形成的兩份相同拷貝。
• 著絲點（centromere）：形成動粒（kinetochore）的區域，供紡錘絲附著。
• 端粒（telomere）：位於染色體末端，保護染色體末端，避免被誤認為 DNA 斷裂。
• 染色體臂：著絲點將染色體分為短臂 $p$ 與長臂 $q$。
• 凝縮蛋白複合體：包括 cohesin 與 condensin，分別參與姊妹染色分體黏合及有絲分裂染色體凝縮。

染色體的高階組織還包括：

• 染色質迴圈（chromatin loops）
• 拓撲相關結構域（topologically associating domains, TADs）
• 染色體區域（chromosome territories）

CTCF 與 cohesin 可協助建立染色質迴圈及 TAD 邊界，使增強子與適當的啟動子接觸，同時限制不適當的調控作用。

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二、染色質對轉錄的調控

基因是否能被轉錄，主要取決於啟動子、增強子等調控序列是否能被轉錄因子接觸，以及染色質是否處於開放狀態。

1. 核小體位置與染色質可近性

若核小體佔據啟動子核心區域，會阻礙一般轉錄因子與 RNA polymerase II 結合，降低轉錄。染色質重塑複合體可利用 ATP 水解能量，重新排列、移除或替換核小體，使啟動子暴露。

常見 ATP-dependent chromatin remodeler 包括：

• SWI/SNF
• ISWI
• CHD
• INO80

其功能包括核小體滑動、核小體移除及組蛋白變異體置換。

2. 組蛋白修飾

組蛋白 N 端尾端可接受多種化學修飾：

組蛋白乙醯化

HAT 將乙醯基加到組蛋白尾端的 lysine 上，減少組蛋白正電性，使其與 DNA 的作用減弱，染色質較為開放，通常促進轉錄。

HDAC 移除乙醯基，使染色質重新緊密，通常抑制轉錄。

組蛋白甲基化

甲基化的作用取決於修飾位置：

• H3K4me3：常見於活化啟動子
• H3K27ac：常見於活化增強子
• H3K9me3：常與異染色質及轉錄抑制有關
• H3K27me3：常與 Polycomb-mediated gene repression 有關

因此，「甲基化一定會抑制轉錄」是錯誤概念，必須根據修飾位置判斷。

3. DNA methylation

DNA methyltransferase 可將 methyl 加到 CpG 位點的 cytosine，形成 5-methylcytosine。若啟動子 CpG island 高度甲基化，通常會：

1. 阻礙部分轉錄因子結合；
2. 招募 methyl-CpG-binding proteins；
3. 進一步招募 HDAC 與其他抑制性染色質蛋白；
4. 造成染色質凝縮與基因沉默。

4. 三維染色質結構

增強子可透過染色質迴圈接觸啟動子。當增強子與啟動子進入同一個調控結構域時，轉錄因子、Mediator 及 RNA polymerase II 可形成轉錄複合體，增加轉錄效率。

因此，轉錄調控不只由 DNA 序列決定，也受到以下因素共同影響：

$$\text{基因表現} = \text{DNA 序列} + \text{核小體位置} + \text{組蛋白修飾} + \text{DNA 甲基化} + \text{三維染色質結構}$$

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三、染色質與染色體在細胞週期中的變化

1. G1 期

G1 期的 DNA 尚未複製，每條染色體由一條染色分體構成。染色質大致維持在可進行轉錄的間期狀態，常染色質區域較開放，異染色質區域則較凝縮。

核心觀念
本題測驗的是 RNA 干擾 (RNAi) 系統中兩大類小分子 RNA——siRNA（small interfering RNA）與 miRNA（microRNA）——的產生機制（biogenesis）與功能（functions），以及它們在來源、加工、作用機制上的差異。掌握這些概念即可回答 12 分題目。

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1. siRNA 的 biogenesis（產生過程）

1. 來源：外源或內源雙股 RNA（dsRNA），可由病毒基因組、實驗加入的長 dsRNA，或由基因轉錄產生的反義 RNA 配對形成。
2. 切割：核酸酶 Dicer（RNase III 家族）在細胞質中將 dsRNA 切割成約 21–23 nt、具有 2‑nt 3' 端黏性末端 的雙股小片段。
   $\text{dsRNA} \xrightarrow{\text{Dicer}} \text{siRNA (≈22 nt)}$
3. 裝配：一條正義鏈（guide strand）與一條反義鏈（passenger strand）形成 RNA‑induced silencing complex (RISC) 的前體；載體蛋白 Argonaute (Ago) 結合兩條鏈，經過熱力學不穩定性與第 5 位核甘酸的 5' 磷酸基選擇，使 passenger strand 被去除，只留下 guide strand 形成成熟 RISC。

2. siRNA 的功能

• 完全互補配對：guide strand 與目標 mRNA 形成 完全或近乎完全的互補（通常 21‑23 個鹼基），導致 Ago2‑mediated endonucleolytic cleavage（切割）於目標 mRNA 的中間位置。
  $\text{RISC–siRNA} + \text{mRNA}_{\text{target}} \rightarrow \text{mRNA}_{\text{cleaved}}$
• 結果：目標 mRNA 被切割後快速降解，基因表達被 沉默（post‑transcriptional gene silencing, PTGS）。
• 其他作用：在某些情況下，siRNA 亦可誘導 heterochromatin formation（異染色質化）與 DNA methylation，參與 轉錄層面的沉默（特別在植物與酵母中）。

3. miRNA 的 biogenesis（產生過程）

1. 基因結構：由 miRNA 基因 轉錄產生 初級 miRNA（pri‑miRNA），長度數百至上千 nt，具 局部雙股結構（hairpin）。
2. 核內加工：Drosha/DGCR8 微加工復合體 在核內將 pri‑miRNA 裁切成約 60‑70 nt 的 前體 miRNA（pre‑miRNA），保留 hairpin 末端的 2‑nt 3' 黏性末端。
   $\text{pri‑miRNA} \xrightarrow{\text{Drosha/DGCR8}} \text{pre‑miRNA}$
3. 核輸出：pre‑miRNA 透過 Exportin‑5/Ran‑GTP 複合體運出至細胞質。

核心觀念
本題在考查膜的結構組成與其物理化學性質如何決定功能。必須把 脂質雙層的組成及非對稱分布、膜蛋白的類型與定位、功能區域（lipid raft、caveolae 等），以及 流動性、厚度、電荷、滲透性 等特性說清楚，並舉例說明這些特性如何在特定生物功能（如受體訊號傳遞）中發揮作用。

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(a) Plasma membrane 的結構與主要成分

成分	位置 / 形式	主要功能
磷脂質 (phospholipids)	雙層（inner & outer leaflets），頭部親水、兩條脂肪酸尾疏水	形成基本的疏水屏障；提供膜的流動性與彈性
膽固醇 (cholesterol)	散佈於雙層中，與磷脂尾部相互作用	調節膜的流動性與剛性，防止過度流動或過於硬化
糖脂 (glycolipids)	主要在外側 leaflets，含糖基鏈	參與細胞辨識、黏附與受體功能
膜蛋白 (membrane proteins)	- 整合膜蛋白 (integral / transmembrane)：跨越雙層，含α‑螺旋或β‑桶結構<br>- 外周膜蛋白 (peripheral)：位於內側或外側表面，與脂質或整合蛋白相互作用	介導物質運輸、受體訊號、酶活性、細胞骨架連結等
其他	磷脂酰肌醇 (PIP₂)、磷脂酸 等信號分子；細胞骨架 (actin, spectrin) 之連結區	調控細胞形態與訊號傳遞

非對稱分布（Asymmetric distribution）

• 外側 leaflets：富含磷脂酸（PC）、磷脂膽鹼（PE）與糖脂，外露糖基鏈，呈正電/中性。
• 內側 leaflets：富含磷脂胺（PS）、磷脂酸（PI）與磷脂酰肌醇（PIP₂），帶負電，提供內部信號定位平台。

為什麼要強調非對稱？
非對稱分布決定了膜外側與內側的電荷差、受體/酶的定位、以及細胞凋亡時外翻的 PS 可作為 “eat‑me” 信號。

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(b) 功能性區域 (Functional domains)

1. 脂質筏 (Lipid rafts)

   • 富含 cholesterol + sphingolipids，形成較厚、較有序的微區域。
   • 常聚集 GPI‑anchored 蛋白、受體酪氨酸激酶、訊号適配蛋白。
   • 功能：促進訊號分子聚集，提高訊號傳遞效率。

2. 洞窟 (Caveolae)

   • 直徑 50–100 nm，受 caveolin-1 介導，屬於特殊的 lipid raft。
   • 功能：機械感測、內吞、脂質儲存以及 NO 生產的調控。

3. 細胞接觸區 (Cell‑cell junctions)

   • 包含 tight junction、adherens junction、desmosome，透過特定黏附分子（cadherin、claudin）固定於特定膜區域。
   • 功能：維持組織屏障、訊號耦合。

說明原因：膜不是均一的平面，而是由多種微結構形成的功能平台，這些平台決定了膜蛋白與脂質的空間定位與互動。

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核心概念
此題考查學生對細胞凋亡（apoptosis）的兩大信號傳導途徑──外在（extrinsic）與內在（intrinsic）路徑——以及關鍵分子（death receptor、caspase、Bcl‑2 家族、線粒體、死亡誘導因子）如何協同完成細胞的程序性死亡。

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一、凋亡的概觀

凋亡是一種受控的程式化細胞死亡，特徵包括細胞縮小、染色質濃縮、核碎裂、膜泡形成（apoptotic bodies）及不引發炎症反應。其執行核心為 caspase（半胱天酶）級聯活化，由上游訊號啟動。

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二、外在路徑（Extrinsic pathway）

步驟	主要分子	為什麼會這樣
(1) 死亡受體結合	Fas (CD95), TNFR1, TRAIL‑R 與其配體（FasL, TNF‑α, TRAIL）結合	配體‑受體結合使受體的死亡域（death domain, DD）聚集，形成信號複合體。
(2) 死亡誘導複合體（DISC）形成	FADD（Fas‑associated death domain protein）與 procaspase‑8/10 透過 DD/DED 交互結合	DISC 把 procaspase‑8/10 拉近，促進自我切割活化。
(3) initiator caspase 激活	caspase‑8（或 caspase‑10）被切割成活化形態	活化的 caspase‑8 為 initiator caspase，可直接切割 downstream effector caspases。
(4) 執行級聯（與內在路徑交叉）	caspase‑8 直接活化 caspase‑3/7，或切割 Bid 成 tBid，促使線粒體外源性路徑啟動	tBid 轉移至線粒體，增加膜通透性，形成 MOMP（mitochondrial outer membrane permeabilization），連結外在與內在路徑。
(5) 執行 caspase 執行細胞解體	caspase‑3/7 裂解核蛋白、細胞骨架、DNA 修復酶等	產生核碎裂、細胞骨架解體，形成 apoptotic bodies。

【答案】 外在路徑以死亡受體‑配體結合啟動 DISC，活化 initiator caspase‑8，進一步激活執行 caspase（caspase‑3/7）或透過 Bid 交叉內在路徑，最終完成細胞凋亡。

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三、內在路徑（Intrinsic pathway）

步驟	主要分子	為什麼會這樣
(1) 細胞內應激刺激	DNA 損傷、缺氧、微管破壞、細胞因子等	這些刺激改變 Bcl‑2 家族 成員的表達與活化狀態。
(2) Bcl‑2 家族調控	抗凋亡蛋白 Bcl‑2、Bcl‑XL 與 促凋亡蛋白 Bax、Bak、Bid、Bad	促凋亡成員（Bax/Bak）在刺激下向線粒體外膜插入，形成孔洞；抗凋亡成員阻止此過程。