113 年 國立成功大學醫學檢驗生物技術研究所《分子生物學及細胞生物學》

核心觀念

本題考查限制酶的辨識序列與切割方式：

• EcoRI 辨識序列為 $5'-$GAATTC$-$3'$，上下股錯位切割，產生具有 5' 單股突出端的黏性末端。
• EcoRV 辨識序列為 $5'-$GATATC$-$3'$，上下股在同一位置切割，產生平整的 鈍性末端。

限制酶切割位置可用「^」表示。

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解題方法

先在題目提供的上股序列中尋找辨識序列，再依照互補股的切割位置畫出兩段雙股 DNA。

EcoRI

EcoRI 的切割方式為：

$$5' \cdots G^AATTC \cdots 3'$$ $$3' \cdots CTTAA^G \cdots 5'$$

上下股切割位置錯開，因此形成 5 個鹼基的 5' 突出端。

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(a) EcoRI 產生的兩段 DNA

原序列切割位置：

$$5' \text{ATCGATAATGCG}^ \text{AATTCGACATAGATATCATTTGGACC} 3'$$

本題主要考察 Sanger 定序法的原理、方法、應用，以及與次世代定序技術的比較。

Sanger 定序法的原理與方法：

Sanger 定序法，又稱為鏈終止法 (chain termination method)，由 Frederick Sanger 於 1977 年開發。其原理基於 DNA 聚合酶在合成 DNA 時，會將核苷酸 (dNTPs) 依據模板鏈進行配對聚合。Sanger 定序法利用了特殊的核苷酸：雙去氧核苷三磷酸 (dideoxynucleotide triphosphates, ddNTPs)。ddNTPs 與一般的 dNTPs 不同之處在於，它們在 3' 端缺少一個羥基 (-OH)，因此一旦 ddNTPs 被納入正在合成的 DNA 鏈中，DNA 聚合酶就無法再添加下一個核苷酸，從而導致 DNA 鏈的合成終止。

方法學：

1. 模板 DNA 製備： 需要純化的單股 DNA 模板。
2. 反應混合物： 包含：
   • 模板 DNA
   • DNA 聚合酶 (如 Taq polymerase)
   • 引子 (primer)：與模板 DNA 的起始端互補配對，提供 DNA 聚合酶開始合成的起始點。
   • 四種去氧核苷三磷酸 (dNTPs)：dATP, dGTP, dCTP, dTTP，這是 DNA 合成所需的正常組成。
   • 四種雙去氧核苷三磷酸 (ddNTPs)：ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP。這四種 ddNTPs 通常會被標記上不同的螢光染料。
3. 反應過程： 在 PCR 條件下進行。DNA 聚合酶以模板 DNA 為模板，以引子為起始點，開始合成新的 DNA 鏈。合成過程中，會隨機地將 dNTPs 或 ddNTPs 納入新鏈。一旦 ddNTPs 被納入，DNA 合成就會終止。由於 ddNTPs 的濃度遠低於 dNTPs，因此會產生一系列不同長度、但都在某個特定鹼基位置終止的 DNA 片段。
4. 片段分離與檢測： 這些不同長度的 DNA 片段會被分離。傳統上使用膠體電泳 (gel electrophoresis) 進行分離，利用 ddNTPs 標記的不同放射性同位素或螢光染料來檢測。現代的 Sanger 定序則使用螢光標記的 ddNTPs，並通過自動化毛細管電泳 (capillary electrophoresis) 進行分離。
5. 序列判讀： 根據電泳分離出的 DNA 片段長度以及它們所帶的螢光信號，可以推斷出 DNA 的鹼基序列。長度最短的片段對應於第一個終止點，最長的片段對應於最後一個終止點。通過掃描螢光信號，可以讀取每個終止點的鹼基。

Sanger 定序如何協助決定 DNA 序列：
Sanger 定序透過產生一系列特定終止點的 DNA 片段，並利用標記來識別這些終止點的鹼基。這些片段的長度差異（通常以一個鹼基為單位）和對應的螢光信號，經過電腦分析，就能重建出原始 DNA 模板的序列。

Sanger 定序的優點與限制，與次世代定序 (NGS) 的比較：

Sanger 定序的優點：

1. 準確性高： 對於單一基因或短片段的定序，Sanger 定序的準確性非常高，通常可達 99.99%。

本題主要探討兩種研究基因功能的基本策略：正向遺傳學 (forward genetics) 和反向遺傳學 (reverse genetics)。

正向遺傳學 (Forward Genetics)：

• 策略 (Strategy)： 從表現型 (phenotype) 出發，尋找導致該表現型改變的基因。也就是「由表及裡」。
• 方法學 (Methodologies)：
  1. 誘導突變 (Mutagenesis)： 利用化學誘變劑 (如 EMS, ENU)、物理誘變劑 (如輻射、UV 光) 或轉座子 (transposons) 等方法，隨機地在生物體內誘導基因突變。
  2. 篩選 (Screening)： 觀察或篩選出具有特定異常表現型 (如生長遲緩、形態異常、對特定藥物敏感等) 的個體。
  3. 突變體定位與鑑定 (Mutant mapping and identification)：
     • 遺傳連鎖分析 (Genetic linkage analysis)： 通過雜交和後代分析，將突變基因定位到染色體上的特定區域。
     • 分子標記 (Molecular markers)： 利用已知的 DNA 標記 (如 SSR, SNP) 來進一步精確定位突變位點。
     • 基因克隆與定序 (Gene cloning and sequencing)： 將定位區域內的基因克隆出來，並定序以找出導致表現型改變的具體突變基因。
• 應用 (Applications)：
  • 發現新的基因及其功能。
  • 研究複雜的生物途徑和調控網絡。
  • 尋找與疾病相關的基因。
  • 在模式生物 (如果蠅、斑馬魚、酵母菌、模式植物) 中廣泛應用，以揭示基本生物學過程。

反向遺傳學 (Reverse Genetics)：

• 策略 (Strategy)： 從一個已知的基因序列出發，通過人為地改變該基因的表達或序列，觀察其對表現型的影響，從而推斷該基因的功能。也就是「由裡及表」。
• 方法學 (Methodologies)：
  1. 基因敲除 (Gene knockout)： 利用同源重組或 CRISPR/Cas9 等技術，使目標基因失活，觀察表現型變化。
  2. 基因敲低 (Gene knockdown)： 利用 RNA interference (RNAi)，如小的干擾 RNA (siRNA) 或短髮夾 RNA (shRNA)，降低目標基因的 mRNA 水平，從而減少蛋白質產量。
  3. 基因過度表達 (Gene overexpression)： 將目標基因以增強子 (enhancer) 驅動的方式進行過度表達，觀察表現型變化。
  4. 基因突變誘導 (Site-directed mutagenesis)： 通過定點突變技術，人為地改變目標基因的特定位點，觀察這些突變對蛋白質功能和生物體表現型的影響。
  5. 基因編輯 (Gene editing)： 如 CRISPR/Cas9 系統，可以精確地在基因組的特定位置引入插入、刪除或替換突變。

本題旨在釐清不同類型基因突變的定義與區別，特別是點突變 (point mutation) 的幾種形式，以及移碼突變 (frame shift mutation)。

基因突變 (Genetic Mutation)： 基因突變是指 DNA 序列發生的永久性改變。這些改變可能影響蛋白質的結構、功能，進而影響生物體的表現型。

點突變 (Point Mutation)：
點突變是指 DNA 分子中單一核苷酸對的改變。這包括鹼基的替換 (substitution)、插入 (insertion) 或刪除 (deletion)，但通常是指單一鹼基的替換。

點突變可分為以下幾種，取決於其對蛋白質序列的影響：

1. 同義突變 (Silent Mutation)：

   • 定義： 即使 DNA 序列發生了改變，但由於密碼子的簡併性 (degeneracy of the genetic code)，該突變不會改變所編碼的胺基酸序列。
   • 影響： 通常對蛋白質功能沒有明顯影響。
   • 範例： DNA 序列由 CCC 變為 CCG，兩者都編碼脯胺酸 (Pro)。

2. 錯義突變 (Missense Mutation)：

   • 定義： 該突變導致一個密碼子改變，進而編碼一個不同的胺基酸。
   • 影響： 影響程度取決於新胺基酸的性質及其在蛋白質中的位置。
     • 保守性錯義突變 (Conservative missense mutation)： 新的胺基酸與原來胺基酸的化學性質相似 (如都帶正電、都疏水)，對蛋白質功能影響較小。
     • 非保守性錯義突變 (Non-conservative missense mutation)： 新的胺基酸與原來胺基酸的性質差異很大，可能嚴重影響蛋白質的摺疊、穩定性或活性。
   • 範例： 正常序列編碼丙胺酸 (Ala)，突變後編碼纈胺酸 (Val)。

3. 無義突變 (Nonsense Mutation)：

   • 定義： 該突變導致一個編碼胺基酸的密碼子轉變為一個終止密碼子 (stop codon)，如 UAA, UAG, UGA。
   • 影響： 導致蛋白質合成在該點終止，產生一個截短的、通常是無功能的蛋白質。
   • 範例： 正常編碼酪胺酸 (Tyr) 的密碼子 UAC，突變為終止密碼子 UAG。

移碼突變 (Frameshift Mutation)：
移碼突變是指 DNA 序列中，鹼基的插入 (insertion) 或刪除 (deletion) 導致讀碼框 (reading frame) 發生偏移。這種突變通常涉及插入或刪除的鹼基數不是三個的倍數。

• 定義： 插入或刪除非三個鹼基倍數的核苷酸，改變了從突變點開始後所有密碼子的解讀。
• 影響：
  • 改變後續所有胺基酸： 由於讀碼框的移動，突變點之後的所有密碼子都會被錯誤解讀，導致蛋白質序列發生巨大改變。
  • 可能提前引入終止密碼子： 移碼經常會導致在新的讀碼框中出現一個隨機的終止密碼子，進而產生一個截短的蛋白質。

本題主要考察細胞週期的各個時期、週期調控的關鍵分子（Cyclins 和 CDKs）以及細胞週期檢查點 (checkpoints) 的作用。

細胞週期的階段 (Stages of the Cell Cycle)：
細胞週期是細胞從一次分裂到下一次分裂的過程，主要分為兩個大階段：間期 (Interphase) 和分裂期 (M phase)。

1. 間期 (Interphase)： 細胞生長和 DNA 複製的階段，佔細胞週期的大部分時間。

   • G1 期 (Gap 1 phase)：
     • 細胞從 M 期分裂結束後進入。
     • 細胞體積增大，合成蛋白質和 RNA，為 DNA 複製做準備。
     • 細胞在此期會決定是否進入 S 期，或進入 G0 期 (暫時或永久停止分裂的狀態)。
   • S 期 (Synthesis phase)：
     • DNA 複製的階段。每個染色體都會精確地複製一份，形成兩個姐妹染色分體 (sister chromatids)，由著絲粒 (centromere) 連接。
   • G2 期 (Gap 2 phase)：
     • DNA 複製完成後進入。
     • 細胞繼續生長，合成支持分裂所需的蛋白質（如微管蛋白）。
     • 細胞準備進入 M 期。

2. 分裂期 (M phase)： 細胞進行核分裂 (mitosis) 和細胞質分裂 (cytokinesis) 的階段。

   • 核分裂 (Mitosis)： 染色體被精確地分離到兩個子核中。包括：
     • 前期 (Prophase)： 染色質凝縮成可見的染色體；核膜開始解體；紡錘體開始形成。
     • 前中期 (Prometaphase)： 核膜完全解體；紡錘體微管附著到染色體著絲粒上。
     • 中期 (Metaphase)： 染色體排列在細胞中央的赤道板 (metaphase plate) 上。
     • 後期 (Anaphase)： 姐妹染色分體分離，並向細胞兩極移動。
     • 末期 (Telophase)： 染色體到達細胞兩極，開始解凝縮；核膜重新形成；紡錘體消失。
   • 細胞質分裂 (Cytokinesis)： 細胞質分裂成兩個子細胞。通常在末期開始，並在 M 期結束後完成。

Cyclins 和 Cyclin-Dependent Kinases (CDKs) 在細胞週期調控中的作用：

Cyclins 和 CDKs 是細胞週期進展的關鍵調控因子。CDKs 是酶，其活性需要與細胞週期蛋白 (Cyclins) 結合才能發揮催化作用。不同的 Cyclin-CDK 複合物在細胞週期的不同階段具有不同的活性，它們通過磷酸化 (phosphorylation) 目標蛋白質來啟動或抑制細胞週期的特定事件。

• CDKs (Cyclin-Dependent Kinases)： 是一類蛋白激酶，它們本身在細胞週期中濃度相對恆定，但其活性受到細胞週期蛋白的嚴格調控。
• Cyclins (細胞週期蛋白)： 是一類在細胞週期中濃度週期性變化的蛋白質。它們的合成和降解受到嚴格調控，其濃度變化決定了 CDK 複合物的活性。

本題旨在闡述分子生物學中心法則 (Central Dogma of Molecular Biology)，並解釋其如何描述生物體內遺傳信息的流動。

分子生物學中心法則 (Central Dogma of Molecular Biology)：

分子生物學中心法則由 Francis Crick 在 1958 年提出，並在 1970 年進一步闡述。它描述了生物體內遺傳信息的傳遞方向，是分子生物學中最核心的概念之一。

中心法則指出，遺傳信息的流動通常是單向的，即從 DNA → RNA → 蛋白質。

1. DNA 複製 (Replication)：

   • 過程： DNA 分子可以自我複製，產生相同的 DNA 分子。
   • 信息流動： DNA → DNA。
   • 作用： 確保遺傳信息在細胞分裂時能夠精確地傳遞給子細胞，維持物種的遺傳穩定性。

2. 轉錄 (Transcription)：

   • 過程： DNA 的遺傳信息被轉錄成 RNA 分子（主要是信使 RNA, mRNA）。
   • 信息流動： DNA → RNA。
   • 作用： 將 DNA 中儲存的遺傳密碼「抄寫」出來，以便在細胞質中（或原核生物的細胞質中）指導蛋白質的合成。

3. 轉譯 (Translation)：

   • 過程： mRNA 上的遺傳密碼被解讀，指導核糖體合成特定的蛋白質分子。
   • 信息流動： RNA → 蛋白質。
   • 作用： 將 RNA 中的信息轉化為具有特定功能的蛋白質，蛋白質是執行細胞內絕大多數功能的分子機器。

中心法則如何描述遺傳信息的流動：

中心法則描繪了一個從儲存遺傳信息的分子 (DNA) 到傳遞信息的分子 (RNA) 再到執行功能的分子 (蛋白質) 的層次結構。

• DNA 作為遺傳信息的藍圖： DNA 攜帶了生物體發育和生存所需的所有遺傳指令，它能夠自我複製，確保這些指令在代代相傳中保持穩定。
• RNA 作為信息的信使和調控者： RNA 在中心法則中扮演著多重角色。

核心觀念

本題要求說明染色體的兩個層面：

1. 分子組成：染色體由 DNA、組蛋白、非組蛋白及少量 RNA 組成。
2. 結構特徵：DNA 經過多層次折疊與壓縮，形成具有核小體、染色質迴圈、著絲點與端粒等特徵的高度組織化結構。

染色體並非單純裸露的 DNA，而是「DNA—蛋白質複合體」，其主要功能是保存遺傳資訊、調控基因表現，並確保細胞分裂時遺傳物質正確分配。

分子組成

1. DNA

真核生物染色體的遺傳物質是線性雙股 DNA 分子。DNA 由許多去氧核糖核苷酸連接而成，每一條 DNA 股包含：

• 去氧核糖
• 磷酸基
• 含氮鹼基：A、T、G、C

DNA 的鹼基序列攜帶遺傳資訊，並包含基因、調控序列、著絲點序列、端粒序列及大量非編碼區域。

在細胞週期的 $S$ 期完成 DNA 複製後，一條染色體會形成兩條遺傳上相同的姊妹染色單體，兩者在著絲點區域相連。

2. 組蛋白

組蛋白是染色體中最重要的結構蛋白，富含帶正電的離胺酸與精胺酸，能與帶負電的 DNA 磷酸骨架結合。

基本組蛋白包括：

• $H2A$
• $H2B$
• $H3$
• $H4$
• $H1$

其中 $H2A$、$H2B$、$H3$、$H4$ 各兩個分子組成組蛋白八聚體：

$$(H2A)_2(H2B)_2(H3)_2(H4)_2$$

約 $146$ 個鹼基對的 DNA 會纏繞組蛋白八聚體約 $1.65$ 圈，形成一個核小體。相鄰核小體之間由 linker DNA 連接，而 $H1$ 主要結合於核小體入口與出口附近，協助染色質進一步壓縮。

組蛋白的胺基端尾部可接受多種化學修飾，例如：

• 乙醯化
• 甲基化
• 磷酸化
• 泛素化

這些修飾會影響染色質的鬆緊程度與基因轉錄活性，形成重要的表觀遺傳調控機制。

3. 非組蛋白

非組蛋白種類繁多，主要包括：

• 染色質結構蛋白
• 轉錄因子
• DNA 複製與修復蛋白
• DNA 拓撲異構酶
• cohesin
• condensin
• 染色質重塑複合體

其中：

• cohesin 維持姊妹染色單體的連結。
• condensin 協助有絲分裂與減數分裂時染色體的高度凝縮。
• DNA 拓撲異構酶 調節 DNA 超螺旋與拓撲張力。
• 染色質重塑蛋白 改變核小體位置或結構，調節 DNA 的可近性。

4. 少量 RNA

染色體中也可含有少量與染色質結合的 RNA，例如參與染色質組織、基因沉默與異染色質形成的非編碼 RNA。端粒酶的 RNA 成分則可作為端粒 DNA 合成的模板。

染色體的層次結構

1. DNA 雙股螺旋

最基本的結構是 DNA 雙股螺旋。裸露 DNA 的長度遠大於細胞核直徑，因此必須透過多層次包裝加以壓縮。

2. 核小體

DNA 纏繞組蛋白八聚體形成核小體，呈現類似「串珠」的結構。核小體是染色質包裝的基本單位，也可限制轉錄因子與 RNA polymerase 接近 DNA。

3. 高階染色質纖維

核小體可進一步折疊形成高階染色質結構。傳統教科書常以約 $30$ nm 的染色質纖維描述此階段；現代研究顯示，細胞內染色質並非所有區域都形成規則一致的 $30$ nm 纖維，而是依蛋白質、DNA 序列與細胞狀態形成較具動態性的組織。

4. 染色質迴圈與染色體領域

染色質纖維可形成許多迴圈，固定於含有 cohesin、condensin 及其他非組蛋白的支架或軸向結構上。這些迴圈會進一步組成染色體領域，使基因與其調控元件在空間上產生特定關聯。

5. 有絲分裂期染色體

在有絲分裂中期，染色體達到高度凝縮狀態，通常可觀察到：

• 兩條姊妹染色單體
• 連接兩條姊妹染色單體的著絲點區域
• 著絲點上的動粒
• 連接著絲點與染色體末端的短臂 $p$ 與長臂 $q$
• 位於染色體兩端的端粒

本題要求詳細闡述三種重要的分子生物學技術：Western blot、Real-time PCR 和 RT-PCR 的實驗步驟及研究目的。

(1) Western Blot Analysis (蛋白質免疫印跡法)

目的 (Purpose)：
Western blot 是一種用於檢測特定蛋白質豐度、大小和相對相對量的技術。它通過結合蛋白質樣品與抗體來實現，因此可用於：

• 檢測特定蛋白質是否存在。
• 比較不同條件下（如處理前後、不同組織、不同細胞株）特定蛋白質的表達水平。
• 確認蛋白質的大小（通過分子量標記）。
• 研究蛋白質的翻譯後修飾（如磷酸化，可使用特定磷酸化抗體）。

實驗步驟 (Methodological Steps)：

1. 樣品製備 (Sample Preparation)：

   • 從細胞或組織中提取總蛋白質。通常使用細胞裂解液 (lysis buffer) 裂解細胞，釋放蛋白質。裂解液中常含有去垢劑 (detergent) 以溶解細胞膜、鹽類 (salt) 以維持離子強度、緩衝劑 (buffer) 以維持 pH，以及蛋白酶抑制劑 (protease inhibitors) 和磷酸酶抑制劑 (phosphatase inhibitors) 以防止蛋白質降解或去磷酸化。
   • 樣品需進行蛋白質定量（如 Bradford 或 BCA 法），以確保上樣量一致。

2. 蛋白質變性與電泳 (Protein Denaturation and Electrophoresis)：

   • 將蛋白質樣品與樣品緩衝液 (sample buffer) 混合，樣品緩衝液通常含有：
     • SDS (Sodium dodecyl sulfate)：一種陰離子去垢劑，能使蛋白質變性（破壞二級和三級結構）並使其帶上均勻的負電荷。
     • β-巰基乙醇 (β-mercaptoethanol) 或 DTT (dithiothreitol)：還原劑，破壞蛋白質內部的二硫鍵，進一步使蛋白質完全變性。
     • 甘油 (glycerol)：增加樣品密度，使其在電泳時沉到底部。
     • 溴酚藍 (bromophenol blue)：染料，用於監測電泳進程。
   • 將樣品進行加熱變性（通常 95-100°C，5-10 分鐘）。
   • 使用 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 進行蛋白質分離。蛋白質在電場中，以其分子量大小為依據，從負極向正極移動。分子量越小的蛋白質移動越快。
   • 通常會同時上樣一個 蛋白質分子量標記 (molecular weight marker)，以便之後對目標蛋白質的大小進行估算。

3. 蛋白質轉印 (Protein Transfer / Blotting)：

   • 將電泳分離後的蛋白質從聚丙烯醯胺凝膠 (polyacrylamide gel) 轉移到一個固體載體膜上，常用的是 硝酸纖維素膜 (nitrocellulose membrane) 或 PVDF 膜 (polyvinylidene difluoride membrane)。
   • 轉印過程通常在電場中進行（電轉印, electroblotting），利用蛋白質帶負電的特性，使其從凝膠轉移到帶正電的膜上。

4. 封阻 (Blocking)：

   • 為了防止抗體非特異性地結合到膜上，需要用一種封阻劑（通常是含有 5% 脱脂奶粉或 BSA 的緩衝液）在室溫下孵育膜約 1 小時，以封閉膜上未被蛋白質佔據的結合位點。

5. 一抗孵育 (Primary Antibody Incubation)：

   • 使用針對目標蛋白質的 一抗 (primary antibody)，在低溫（如 4°C）或室溫下孵育膜數小時至過夜。一抗會特異性地結合到目標蛋白質上。
   • 孵育後，用洗滌緩衝液（如 TBST 或 PBST，含有 Tween-20）洗滌膜數次，以去除未結合的一抗。

6. 二抗孵育 (Secondary Antibody Incubation)：

   • 使用一種與一抗的物種來源不同的 二抗 (secondary antibody)。該二抗通常會與一種酶（如辣根過氧化物酶 HRP, Horseradish Peroxidase 或鹼性磷酸酶 AP, Alkaline Phosphatase）或螢光分子偶聯。
   • 二抗會結合到一抗的 Fc 段上。
   • 孵育後，再次用洗滌緩衝液洗滌膜數次，以去除未結合的二抗。

7. 信號檢測 (Signal Detection)：

   • 如果二抗偶聯有酶（如 HRP），則加入相應的底物 (substrate)。HRP 會催化底物發生化學反應，產生可見光信號（發光 chemiluminescence 或顯色 colorimetric）。
   • 使用成像系統（如 CCD 相機或膠片）捕捉信號。
   • 如果二抗偶聯有螢光分子，則使用特定波長的光激發螢光，並記錄螢光信號。
   • 信號的強度與目標蛋白質的豐度成正比。

(2) Real-time PCR (定量 PCR, qPCR)

目的 (Purpose)：
Real-time PCR (或稱 quantitative PCR, qPCR) 是一種用於實時監測 PCR 擴增過程的技術，能夠定量測量起始模板 DNA 或 RNA 的量。常用於：

• 定量分析基因表達水平（通常從 RNA 開始，需要 RT 步驟）。
• 檢測和定量病毒載量。
• 研究基因拷貝數變異 (copy number variation)。
• SNP 分型。

實驗步驟 (Methodological Steps)：

1. 樣品製備 (Sample Preparation)：

   • 提取總 DNA 或總 RNA。
   • 如果從 RNA 開始，需要先進行反轉錄 (RT) 步驟，將 RNA 轉化為 cDNA（見 RT-PCR 部分）。

2. PCR 混合液配製 (PCR Reaction Setup)：

   • 包含：
     • 模板 DNA (cDNA)。
     • 特異性引子對 (forward and reverse primers)：設計來擴增目標 DNA 區域。
     • DNA 聚合酶：通常是熱循環酶，對 PCR 條件穩定。
     • dNTPs：PCR 的核苷酸原料。
     • PCR 緩衝液。
     • 熒光染料 (Fluorescent Dye) 或 熒光探針 (Fluorescent Probe)： 這是 Real-time PCR 的關鍵。
       • 熒光染料法 (如 SYBR Green)： SYBR Green 是一種能夠嵌入雙鏈 DNA 的熒光染料。隨著 PCR 產物的增加，結合的染料也越多，產生的熒光信號越強。

核心觀念

本題要求從四個面向比較 DNA 與 RNA：

1. 化學結構：糖、含氮鹼基、鏈狀形式。
2. 穩定性：對鹼、水解、核酸酶與環境因素的耐受程度。
3. 功能性：主要承擔資訊儲存、傳遞、表現或催化等功能。
4. 細胞內角色：兩者在複製、轉錄、翻譯及基因調控中的分工。

DNA 與 RNA 都是由核苷酸聚合而成的核酸。每個核苷酸包含：

$$\text{含氮鹼基}+\text{五碳糖}+\text{磷酸基}$$

核苷酸之間以 $3'\rightarrow5'$ 磷酸二酯鍵連接，因此核酸鏈具有固定方向性，通常由 $5'$ 端延伸至 $3'$ 端。

解題方法

本題適合採用「結構差異 → 穩定性差異 → 功能與細胞角色」的因果順序作答。先指出 DNA 與 RNA 的分子差異，再說明這些差異如何造成穩定性及生物功能的不同，最後補充兩者在細胞中的實際分工。

一、化學結構

1. 五碳糖不同

DNA 含有去氧核糖（deoxyribose），RNA 含有核糖（ribose）。

兩者最關鍵的差別位於糖的 $2'$ 碳：

• DNA 的 $2'$ 碳接氫原子，結構上可表示為 $2'$-H。
• RNA 的 $2'$ 碳接羥基，結構上為 $2'$-OH。

這個 $2'$-OH 是 DNA 與 RNA 在化學穩定性上產生重大差異的主要原因。

2. 含氮鹼基不同

DNA 的四種鹼基為：

$$A,\ T,\ G,\ C$$

RNA 的四種鹼基為：

$$A,\ U,\ G,\ C$$

其中：

• DNA 使用胸腺嘧啶（thymine, T）。
• RNA 使用尿嘧啶（uracil, U）。
• A、G、C 兩者皆有。

T 與 U 的差異在於 T 比 U 多一個甲基。DNA 使用 T，有助於細胞辨識由胞嘧啶自發去胺形成的尿嘧啶，避免突變累積。

3. 鏈狀形式不同

DNA 通常以兩股反向平行的雙股螺旋存在：

$$5'\rightarrow3'$$

與

$$3'\leftarrow5'$$

兩股之間透過互補鹼基配對：

$$A=T,\qquad G\equiv C$$

RNA 多數以單股形式存在，但單股 RNA 能藉由自身互補序列形成莖環、髮夾及其他複雜的二級與三級結構。部分 RNA 也能形成雙股區域，因此「RNA 一定是完全直線的單股」並不正確。

4. 結構比較

特徵	DNA	RNA
五碳糖	去氧核糖	核糖
$2'$ 碳	$2'$-H	$2'$-OH
特有鹼基	T	U
常見形式	雙股螺旋	單股，能形成複雜摺疊
鹼基配對	A-T、G-C	A-U、G-C
主要方向性	$5'\rightarrow3'$	$5'\rightarrow3'$

二、穩定性

1. RNA 的 $2'$-OH 使其容易鹼水解

在鹼性環境中，RNA 的 $2'$-OH 可失去質子形成 $2'$-O⁻。接著 $2'$-O⁻ 會攻擊相鄰磷酸二酯鍵，使 RNA 骨架斷裂，形成含有 $2',3'$-環磷酸中間物的產物。

因此 RNA 可發生鹼催化水解：

$$2'\text{-OH}\rightarrow 2'\text{-O}^- \rightarrow \text{攻擊磷酸二酯鍵} \rightarrow \text{RNA 骨架斷裂}$$

DNA 缺少 $2'$-OH，無法以相同機制進行快速的鹼催化骨架斷裂，所以 DNA 在鹼性條件下相對穩定。

2. DNA 雙股結構增加穩定性

DNA 的雙股螺旋具有：

• 互補鹼基配對形成的氫鍵；
• 鹼基堆疊作用；
• 雙股結構對單股損傷的互補參考。

當 DNA 一股受損時，另一股仍可作為修復模板。因此 DNA 適合長期保存遺傳資訊。

3. RNA 通常較不穩定

RNA 不僅具有容易水解的 $2'$-OH，許多 RNA 以單股形式存在，亦容易受到：

• RNase；
• 高溫；
• 鹼性環境；
• 核糖核苷酸骨架水解

的影響。

不過，RNA 的穩定性會受到結構與修飾影響。例如 tRNA、rRNA 具有高度摺疊結構與多種鹼基修飾，穩定性高於一般未摺疊的 RNA。部分病毒 RNA 也能在細胞內長期存在。

4. 穩定性與功能的關聯

DNA 化學穩定、可被精確複製，適合擔任長期遺傳資訊儲存庫。

RNA 化學穩定性較低、可快速合成與降解，適合擔任短期訊息傳遞、翻譯媒介、調控分子與催化分子。

三、功能性

1. DNA 的主要功能

DNA 的核心功能是儲存與傳遞遺傳資訊，主要包括：

（1）遺傳資訊儲存