113 年 國立成功大學生命科學研究所乙組《分子生物學》
第 1 題
- Answer briefly the following questions:
Q1. What is the function of DNA helicases in DNA replication? (4 points)
Q2. What does "complementary" mean in DNA sequences? (4 points)
Q3. What is the main difference between animal and plant cytokinesis? (4 points)
Q4. What is the function of snoRNAs and where is their main cellular localization? (4 points)
Q5. Who won the Nobel Prize in Physiology or Medicine last year (2023) and what was their achievement? (4 points)
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本題為基礎分子生物學觀念的綜合性考題，涵蓋 DNA 複製、細胞分裂、RNA 功能與生化獎項等。
Q1. DNA helicases 的功能是在 DNA 複製過程中，解開雙股 DNA 的氫鍵，使雙股 DNA 分子分離，形成單股 DNA，以便作為 DNA 聚合酶的模板。此過程需要消耗 ATP。
Q2. 在 DNA 序列中，"complementary" (互補) 指的是兩條 DNA 鏈的鹼基配對規則。腺嘌呤 (A) 總是與胸腺嘧啶 (T) 配對，形成兩個氫鍵；鳥糞嘌呤 (G) 總是與胞嘧啶 (C) 配對，形成三個氫鍵。因此，如果一條 DNA 鏈的序列是 5'-AGCT-3'，那麼與之互補的另一條鏈的序列就是 3'-TCGA-5'。
Q3. 動物細胞和植物細胞在細胞分裂末期（胞質分裂, cytokinesis）的主要區別在於：
動物細胞：細胞膜從細胞的兩端向內凹陷，逐漸形成一個分裂溝，最終將母細胞分裂成兩個子細胞。
植物細胞：由於細胞壁的存在，植物細胞無法形成分裂溝。取而代之的是，在細胞的赤道板位置形成一個細胞板 (cell plate)，細胞板逐漸擴大並融合到周圍的細胞壁上，最終形成新的細胞壁，將母細胞分隔成兩個子細胞。
第 2 題
- You perform the PCR experiment to amplify the specific target DNA fragment.
Q1. Explain the principle of PCR using the following terms: template, primer(s), single strand. (4 points)
You set the reaction temperature as follows:
95°C 30 sec
(1)→ 95°c 30 sec
52°C 30 sec
(2)→72°C 2 min
7x30 cycles
72°c 30 sec
Q2. Why is the step (1) necessary for the PCR reaction? Briefly explain. (4 points)
Q3. After the step (2), what is the state of the fragments. Briefly draw it. (4 points)
Q4. In gel electrophoresis of the PCR product, you detected multiple bands including your target DNA fragment band. If you are trying to detect a single band by changing the reaction temperature, which step in the above setting should be changed and how? (4 points)
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本題考查聚合酶鏈式反應 (PCR) 的基本原理、步驟與優化。
Q1. PCR 的原理是利用 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 在體外模擬細胞內的 DNA 複製過程，以指數級增長特定的 DNA 片段。其基本要素包括：
- Template (模板): 含有目標 DNA 片段的 DNA 分子，PCR 過程將以此為模板進行複製。
- Primer(s) (引物): 短的單股 DNA 分子（通常 18-25 個鹼基），其序列與目標 DNA 片段的兩端互補，能夠與模板 DNA 結合，並提供 DNA 聚合酶開始合成新鏈的起始點。PCR 通常使用一對引物，分別結合在目標片段的兩端。
- Single strand (單鏈): PCR 過程需要將雙股 DNA 模板變性 (denature) 成單鏈，才能讓引物結合，並讓 DNA 聚合酶進行延伸。變性通常通過高溫（如 95°C）實現。
PCR 的循環過程包含三個主要步驟：
- 變性 (Denaturation)：將雙股 DNA 模板加熱至高溫（約 95°C），破壞鹼基間的氫鍵，使雙鏈 DNA 分解為單鏈 DNA。
- 退火 (Annealing)：將溫度降低（通常在 50-65°C 之間），使引物能夠與模板 DNA 上互補的區域結合。
- 延伸 (Extension)：將溫度升高至 DNA 聚合酶的最適溫度（如 72°C），DNA 聚合酶從引物的 3' 端開始，沿著模板 DNA 的方向合成新的 DNA 鏈。
重複這些步驟（通常 25-35 個循環）可以使目標 DNA 片段以指數級增長。
Q2. 步驟 (1) 是指 PCR 循環中的「變性 (Denaturation)」步驟，通常設定在 95°C。這個步驟是 PCR 的關鍵，因為：
- 它能將 PCR 反應體系中的所有雙股 DNA（包括模板 DNA 和前一個循環產生的雙鏈 DNA）變性為單鏈 DNA。
- 只有單鏈 DNA 才能讓引物 (primer) 結合上去，並作為 DNA 聚合酶合成新鏈的模板。
- 如果沒有充分的變性，引物就無法有效結合，DNA 聚合酶也無法進行延伸，PCR 反應將無法進行或效率極低。
Q3. 步驟 (2) 是指 PCR 循環中的「延伸 (Extension)」步驟，通常設定在 72°C。在這個步驟之後，DNA 聚合酶已經從引物開始，沿著模板鏈合成了一段新的 DNA 鏈。
- 對於模板鏈而言：從引物結合位點到模板鏈的終點，都已經合成了一條互補的新鏈。
- 對於引物而言：引物本身也被延伸了。
- 狀態：從最初的雙股 DNA 模板，經過變性、退火，然後在延伸步驟後，會產生新的雙股 DNA 分子，這些新生成的 DNA 片段長度由引物的結合位點決定。
經過一個循環 (1-2-3)，每一個目標 DNA 區域都會被複製一次。
第 3 題
- Answer the following questions:
Q1. Given the following genotypes for two parents, AaBBCc × AabbCc, assume that all traits exhibit simple
dominance and independent assortment. What proportion of the progeny of this cross will be expected to
phenotypically resemble the first parent with the genotype AaBBCc? (3 points)
Q2. Which of the following is a major difference between prokaryotic cells and eukaryotic cells? (3 points)
A) Prokaryotic cells have cell walls, while eukaryotic cells do not.
B) Eukaryotic cells have flagella, while prokaryotic cells do not.
C) Eukaryotic cells have membrane-bound organelles, while prokaryotic cells do not.
D) Prokaryotic cells are generally larger than eukaryotic cells.
Q3. Which of the following facts did Hershey and Chase make use of in trying to determine whether DNA
or protein is the genetic material? (3 points)
A) DNA contains sulfur, whereas protein does not.
B) DNA contains phosphorus, whereas protein does not.
C) DNA contains nitrogen, whereas protein does not.
Q4. The beginning of anaphase is indicated by which of the following processes? (3 points)
A) Loss of kinetochores from the chromatids.
B) Attachment of sister chromatids to each other by cohesin.
C) Disappearance of the nuclear membrane.
D) Enzymatic cleavage of cohesin.
Q5. In a diploid cell with 5 chromosome pairs, how many sister chromatids will be found in a nucleus at
prophase of mitosis? (10points)
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本題涵蓋遺傳學、細胞生物學與分子生物學的綜合知識。
Q1. 此題為遺傳學中的連鎖與獨立分配問題。
父母基因型為 AaBBCc × AabbCc。
假設基因 A/a, B/b, C/c 分別控制三個獨立的性狀，且表現為簡單顯隱性。
我們要計算子代中表現型與第一個親本 (AaBBCc) 相同的比例。
第一個親本的表現型取決於其基因型 Aa, BB, Cc。
- 基因 A/a：顯性表現為 A_，隱性表現為 aa。親本為 Aa，表現為顯性。
- 基因 B/b：親本為 BB，表現為顯性。
- 基因 C/c：親本為 Cc，表現為顯性。
因此，親本 AaBBCc 的表現型為顯性-顯性-顯性。
我們要計算子代中具有顯性-顯性-顯性表現型的比例。
我們分別計算每個基因座的子代比例：
-
A/a 基因座：親本為 Aa × Aa。
子代基因型：1/4 AA, 1/2 Aa, 1/4 aa。
表現型：A_ (顯性) 的比例為 1/4 + 1/2 = 3/4。 aa (隱性) 的比例為 1/4。
親本 AaBBCc 的 A 基因型是 Aa，表現為顯性。所以子代中表現型為顯性的比例是 3/4。 -
B/b 基因座：親本為 BB × bb。
子代基因型：1/2 Bb, 1/2 Bb。 都是 Bb。
表現型：Bb 表現為顯性。所以子代中表現型為顯性的比例是 1。
（注意：原題目給的親本是 AaBBCc × AabbCc。第一個親本是 BB，表現為顯性。第二個親本是 bb，表現為隱性。所以 BB x bb 的子代基因型都是 Bb，表現型都是顯性。這個比例是 1。） -
C/c 基因座：親本為 Cc × Cc。
子代基因型：1/4 CC, 1/2 Cc, 1/4 cc。
表現型：C_ (顯性) 的比例為 1/4 + 1/2 = 3/4。 cc (隱性) 的比例為 1/4。
親本 AaBBCc 的 C 基因型是 Cc，表現為顯性。所以子代中表現型為顯性的比例是 3/4。
由於基因表現為獨立分配，子代中表現型與親本 AaBBCc (顯性-顯性-顯性) 相同的總比例為各基因座顯性表現比例的乘積：
比例 = (A_ 比例) × (B_ 比例) × (C_ 比例)
比例 = (3/4) × (1) × (3/4) = 9/16。
【答案】9/16
Q2. 此題考查原核細胞與真核細胞的主要區別。
A) 原核細胞有細胞壁，但許多真核細胞（如動物細胞）沒有細胞壁。植物細胞和真菌細胞有細胞壁，但其成分與原核細胞不同。所以這不是一個普遍的區別。
B) 真核細胞（如真核鞭毛蟲）有鞭毛，但原核細胞（如細菌）也有鞭毛，只是結構和運動機制不同。所以這不是一個主要區別。
C) 真核細胞具有膜結合細胞器 (membrane-bound organelles)，例如細胞核、粒線體、內質網、高基氏體等。這些細胞器被膜包圍，具有特定的功能。原核細胞則沒有膜結合細胞器，其遺傳物質位於擬核區 (nucleoid region)，沒有核膜包圍，也沒有其他膜包圍的細胞器。這是原核和真核細胞最根本的區別之一。
D) 原核細胞通常比真核細胞小，而不是反過來。
第 4 題
- Consider a bacterial promoter with -35 and -10 elements. What assay is best to show that RNA
polymerase binds to centered on the -35 and -10 positions upstream of the start site of transcription? (10points)
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本題考查細菌轉錄起始機制，特別是如何證明 RNA 聚合酶與啟動子 (promoter) 的結合。
核心觀念：要證明 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 結合到細菌啟動子 (promoter) 的特定位置（-35 和 -10 區域），我們需要設計一個實驗，能夠檢測到這種結合，並且能夠定位這種結合。
最佳實驗方法是 DNA 腳印分析 (DNA Footprinting Assay)，也稱為保護實驗 (Protection Assay)。
實驗原理與步驟：
-
製備標記的 DNA 模板：
- 首先，合成一段包含細菌啟動子區域（包括 -35 和 -10 元素）的 DNA 序列。
- 對這段 DNA 的一條鏈進行放射性同位素（如 32P）標記，通常是在 DNA 的一端進行標記。這樣可以確保我們能檢測到 DNA 的存在，並進行後續的分析。
-
進行結合實驗：
- 將標記好的 DNA 模板與細菌 RNA 聚合酶（通常是全酶 holoenzyme，包含 σ 因子）在適當的緩衝條件下混合。
- 讓 RNA 聚合酶與 DNA 模板結合一段時間，形成 RNA 聚合酶-DNA 複合物。
-
酶解 DNA：
- 在 RNA 聚合酶-DNA 複合物形成後，加入一種低濃度的 DNA 酶，例如 DNase I。
- DNase I 會隨機地切割暴露在外的 DNA 鏈。
-
分析切割產物：
- 對照組：對沒有加入 RNA 聚合酶的標記 DNA 模板進行相同的 DNase I 處理和低濃度酶解。
- 實驗組：對與 RNA 聚合酶形成複合物的標記 DNA 模板進行 DNase I 處理和低濃度酶解。
- 終止酶解反應。
- 從實驗組和對照組的 DNA 中分離出 DNA 片段。
第 5 題
- Explain the basis of interaction between small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) and the pre-mRNA splicing substrate. (10points)
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本題考查 RNA 剪接 (RNA splicing) 的機制，特別是小核核糖核蛋白 (snRNPs) 如何識別和執行剪接反應。
核心觀念：RNA 剪接是真核生物 mRNA 前體 (pre-mRNA) 加工過程中的一個重要步驟，旨在去除內含子 (introns) 並連接外顯子 (exons)，從而生成成熟的 mRNA。這個過程主要由一個大型的蛋白質-RNA 複合物——剪接體 (spliceosome) 執行，而剪接體的核心組件就是由小核核糖核蛋白 (snRNPs) 構成。
snRNPs 的組成與種類：
snRNPs 是一類由小核 RNA (small nuclear RNA, snRNA) 和一系列蛋白質組成的核糖核蛋白複合物。主要的剪接體 snRNPs 包括 U1, U2, U4, U5, U6。其中，U1, U2, U4, U6 snRNPs 參與剪接反應的識別和催化，U5 snRNP 則主要負責外顯子的連接。
snRNPs 與 pre-mRNA 剪接底物的相互作用基礎：
snRNPs 與 pre-mRNA 剪接底物的相互作用主要基於鹼基配對 (base pairing) 和蛋白質-RNA 相互作用 (protein-RNA interactions)。
- 識別剪接位點 (Splicing Site Recognition)：
- U1 snRNP 的作用：U1 snRNP 中的 U1 snRNA 具有一段序列（約 10-15 個核苷酸），能夠與 pre-mRNA 的 5' 剪接位點 (5' splice site) 進行鹼基配對。5' 剪接位點通常具有保守的 GU 序列。這種鹼基配對是識別 5' 剪接位點的第一步。
- U2 snRNP 的作用：U2 snRNP 中的 U2 snRNA 能夠識別 pre-mRNA 中的分支位點 (branch point site)，該位點通常位於 3' 剪接位點附近，並且包含一個腺嘌呤 (A) 核苷酸。U2 snRNA 的一個特定區域與分支位點的 A 核苷酸進行鹼基配對，同時也與 5' 剪接位點的 GU 序列進行有限的配對。這個配對使得分支位點的 A 核苷酸的 2'-OH 基團暴露出來，為後續的剪接反應做好準備。
第 6 題
- You are screening E. coli for suppressor mutations for a mutant of your gene of interest. The mutation
currently causes the protein encoded by your gene to be not expressed is a nonsense mutation. If one
suppressor mutation is located in the gene encoding a less common tRNA^Leu, Why is it more likely that a
less common tRNA^Leu carries a suppressor mutation than a very commonly used tRNA^Leu? (10points)
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本題考查基因突變、蛋白質表現、終止密碼子 (nonsense codon) 和 tRNA 突變的互斥突變 (suppressor mutation) 機制。
核心觀念：
- 終止突變 (Nonsense mutation)：在基因的編碼區引入了一個終止密碼子 (stop codon)，導致蛋白質合成在該點提前終止，產生截短的、通常無功能的蛋白質。
- 互斥突變 (Suppressor mutation)：第二個突變發生在另一個基因上，其效果是恢復了第一個突變基因所導致的表型缺陷。
- tRNA 的作用：tRNA 分子負責將胺基酸運輸到核糖體，並根據 mRNA 的密碼子配對，將胺基酸添加到新生蛋白質鏈中。每個 tRNA 都與一種特定的胺基酸結合，並能識別一種或多種密碼子。
問題核心：為什麼一個「不常用」的 tRNA^Leu 的突變比一個「常用」的 tRNA^Leu 的突變更有可能成為終止突變的互斥突變？
解釋：
-
終止密碼子與 tRNA 的識別：
- 一個終止突變會將一個原來的密碼子（編碼某個胺基酸）變成一個終止密碼子（UAA, UAG, UGA）。
- 要「壓制」這個終止突變，就需要一個 tRNA 分子能夠識別這個終止密碼子，並將「錯誤」的胺基酸添加到蛋白質鏈上，從而允許蛋白質合成繼續進行，儘管可能產生一個帶有錯誤胺基酸的蛋白質。
-
tRNA 的簡併性 (Degeneracy of the Genetic Code)：
- 遺傳密碼具有簡併性，意味著一種胺基酸可以被多個不同的密碼子編碼。
- 對於一種特定的胺基酸，可能有多個不同的 tRNA 分子（isoacceptor tRNAs）能夠識別編碼該胺基酸的不同密碼子。例如，亮氨酸 (Leucine, Leu) 有多個密碼子（UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG）和對應的 tRNA。
-
「常用」 vs. 「不常用」的 tRNA^Leu：
- 常用 tRNA^Leu：這通常是指能夠識別最常見的編碼亮氨酸的密碼子的 tRNA。例如，如果 CUU 是最常見的密碼子，那麼能夠識別 CUU 的 tRNA^Leu 就是常用的。
- 不常用 tRNA^Leu：這可能指能夠識別較少見的編碼亮氨酸的密碼子的 tRNA，或者其本身的豐度較低。
-
互斥突變的機制：
- 情況一：突變 tRNA 識別終止密碼子。
- 如果一個 tRNA 分子的反密碼子 (anticodon) 發生突變，使其能夠識別一個終止密碼子（例如 UAG），同時該 tRNA 仍然能夠結合其對應的胺基酸（例如 Leu）。
- 當 mRNA 上出現 UAG 終止密碼子時，這個突變的 tRNA^Leu^UAG 就能與之配對，並將亮氨酸加入到蛋白質鏈中，而不是終止合成。
- 情況二：突變 tRNA 改變了對原密碼子的識別。
- 這在終止突變的互斥中比較少見，主要還是指 tRNA 識別了終止密碼子。
- 情況一：突變 tRNA 識別終止密碼子。
-
為什麼「不常用」的 tRNA^Leu 更容易突變成互斥突變？
- 假設：一個終止突變產生了 UAG 密碼子。
- 如果存在一個「常用」的 tRNA^Leu，它可能已經在細胞中以高豐度存在，並且能夠非常有效地結合到 mRNA 的 UAG 位置。但是，這個「常用」的 tRNA^Leu 的反密碼子可能原本就不是專門用於識別 UAG 的（因為 UAG 是終止密碼子）。
- 如果存在一個「不常用」的 tRNA^Leu，例如它識別的密碼子是 UUA，而 UAG 是終止密碼子。如果這個 tRNA^Leu 的反密碼子發生突變，使其能夠識別 UAG，同時仍然攜帶亮氨酸。
- 關鍵點在於「突變」。一個「不常用」的 tRNA^Leu，如果其反密碼子發生了改變（例如，原本識別 UUA 的反密碼子突變成能識別 UAG），這個突變的 tRNA^Leu 就能夠作為一個互斥突變。
- 更深層次的原因：
第 7 題
- In the laboratory, you want to purify a protein that is normally toxic in E. coli cells. Your advisor suggests
the gene encoding your protein into an expression vector that uses the araBAD promoter. Why is
it ideal to use the araBAD promoter for expression of your gene of interest in E. coli cells? (10points)
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本題考查基因表現調控，特別是利用細菌的 araBAD 啟動子進行誘導式表現。
核心觀念：
- 誘導式表現 (Inducible Expression)：在許多實驗中，我們需要控制蛋白質的產生時間和數量。誘導式表現系統允許我們在需要時才開啟基因的轉錄和翻譯，而在不需要時則將其關閉。
- 毒性蛋白質 (Toxic Protein)：如果一個蛋白質在細胞內持續高濃度存在會對細胞造成毒害，那麼我們需要一個能夠嚴格控制其表現的系統，以避免在表達前就殺死宿主細胞。
araBAD 啟動子 (araBAD promoter) 的特性：
araBAD 啟動子是 E. coli 中參與阿拉伯糖 (arabinose) 代謝的操縱子 (operon) 的一部分。它是一個雙向調控 (bidirectionally regulated) 的啟動子，其表現受到阿拉伯糖代謝物（如阿拉伯糖本身或阿拉伯糖的代謝產物）的嚴格調控。
araBAD 啟動子如何工作：
-
阿拉伯糖 (Arabinose) 存在時：
- 阿拉伯糖會與 AraC 蛋白質結合。AraC 是一個雙功能調節蛋白，它既是啟動子，也是阻遏蛋白 (repressor)。
- 當阿拉伯糖存在時，AraC 蛋白質會改變構象，並與啟動子區域的 AraI 位點結合。
- AraC 蛋白質的結合會募集 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 到啟動子，並促進 RNA 聚合酶與啟動子的結合，從而開啟轉錄。
- 因此，當添加阿拉伯糖時，araBAD 操縱子的基因（包括 araB、araA、araD）會開始表現。
-
阿拉伯糖不存在時：
- AraC 蛋白質不與阿拉伯糖結合，而是以另一種構象結合到啟動子區域的 AraO1 位點（一個位於 araBAD 啟動子上游的阻遏位點）。
第 8 題
- Explain why E. coli lacZ is often used as a reporter gene in S. cerevisiae but not in E. coli cells. (10points)
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本題考查報告基因 (reporter gene) 的應用，特別是 lacZ 基因在不同生物體中的使用情況。
核心觀念：
- 報告基因 (Reporter Gene)：一個基因，其產物易於檢測和定量，通常用於研究其他基因的表現情況、蛋白質-蛋白質相互作用或研究細胞過程。
- E. coli lacZ 基因：編碼 β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，這種酶能夠水解無色底物如 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 產生藍色產物，或水解 ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) 產生黃色產物。因此，lacZ 基因常用來監測啟動子的活性或基因的表達。
問題分析：為什麼 lacZ 常用作酵母 (Saccharomyces cerevisiae, 簡稱 S. cerevisiae) 的報告基因，但在 E. coli 細胞中卻「不常用」（或更準確地說，在某些特定情況下不首選）？
解釋：
- lacZ 在 E. coli 中的內源性 (Endogenous) 存在：
- E. coli 細胞自然帶有一個內源性的 lacZ 基因。這個基因是 lac 操縱子的一部分，參與乳糖代謝。
- 因此，如果我們在 E. coli 中引入一個外源的 lacZ 報告基因，我們將無法區分是內源的 lacZ 在表現，還是外源的 lacZ 在表現。
- 如果我們想研究一個啟動子在 E. coli 中的活性，我們通常需要將這個啟動子連接到一個沒有內源性 lacZ 的 E. coli 菌株，或者使用一個能夠區分內源和外源 lacZ 產物的報告系統。
- 常見的解決方案：
- 使用突變株：使用一個 lacZ 基因缺失 (lacZ knockout) 的 E. coli 菌株，然後將待研究的啟動子與外源的 lacZ 基因連接，這樣表現的藍色/黃色產物就一定是來自外源的報告基因。
- 使用其他報告基因：在 E. coli 中，更常用的報告基因系統包括：