109 年 國立成功大學生命科學研究所乙組《分子生物學》

蛋白質的一級結構（primary structure）是指胺基酸殘基之間通過共價鍵連接而成的線性序列。在蛋白質合成過程中，胺基酸通過肽鍵（peptide bond）連接，形成多肽鏈。肽鍵是胺基酸的羧基與另一個胺基酸的胺基之間脫水縮合形成的共價鍵。

Frederick Sanger 在 1950 年代利用化學方法確定了胰島素（insulin）的完整胺基酸序列，這是蛋白質序列分析的開創性工作。他使用的主要方法包括：

1. 測定胺基酸組成：通過水解蛋白質，確定其中包含的胺基酸種類和比例。
2. 肽段定序：使用化學試劑（如 dansyl chloride）對蛋白質的 N 端進行標記，然後用胰蛋白酶等酶進行部分水解，產生一系列短肽段。
3. 分離和鑑定肽段：利用色層分析（chromatography）和電泳（electrophoresis）等技術分離這些肽段，並確定其胺基酸序列。

蛋白質的功能與其特定的三維結構（shape 或 conformation）密切相關。當維持蛋白質三維結構的非共價鍵（如氫鍵、離子鍵、疏水作用力）或共價鍵（如二硫鍵）被破壞時，蛋白質會失去其原有的空間構象，進而可能導致其功能喪失。這種三維結構的改變稱為蛋白質變性（denaturation）。

這個問題涉及孟德爾遺傳定律。一個 3:1 的表型比例（phenotypic ratio）在子代中出現，通常是在單基因遺傳中，親代（父母本）都是雜合子（heterozygous），且該性狀表現出完全顯性（complete dominance）的遺傳模式。

假設控制該性狀的基因有兩個等位基因（alleles），分別是顯性等位基因 A 和隱性等位基因 a。
若親代都是雜合子 Aa，則它們的配子（gametes）將帶有 A 或 a 等位基因，機率各為 1/2。
子代的基因型組合有：
AA (1/4)
Aa (1/4 + 1/4 = 1/2)
aa (1/4)
基因型比例為 1:2:1。

替代性 RNA 剪接（Alternative RNA splicing）是轉錄後修飾的一種重要機制，發生在真核生物中。在 RNA 剪接過程中，成熟的 mRNA 分子會去除內含子（introns）並連接外顯子（exons）。替代性剪接是指，同一前驅體 mRNA（pre-mRNA）分子可以通過不同的組合方式連接外顯子，從而產生多種不同的成熟 mRNA 分子。這些不同的 mRNA 分子可以被翻譯成結構和功能不同的蛋白質，或者相同蛋白質的不同異構體。

選項 A 和 D 錯誤，替代性剪接是 RNA 加工過程，與轉錄速率（transcription rate）無關，轉錄速率由 RNA 聚合酶等調控。

在細胞中，核糖體 RNA（rRNA）是含量最豐富的 RNA 類型。rRNA 是核糖體（ribosome）的主要結構和功能成分，負責蛋白質的合成。核糖體是細胞內蛋白質合成的場所，數量龐大，因此 rRNA 的含量也最高。

選項 A（mRNA）是信使 RNA，攜帶遺傳信息，但其含量相對較低，且壽命較短。

信號肽（signal peptide）或信號序列（signal sequence）是一段通常位於蛋白質 N 端、由 15-30 個疏水性胺基酸組成的短肽鏈。它的主要功能是指導新生多肽鏈進入特定的細胞器（如內質網 ER、線粒體、葉綠體、過氧化物酶體）或分泌到細胞外。

對於分泌蛋白和膜蛋白而言，信號肽會識別內質網膜上的信號識別顆粒（Signal Recognition Particle, SRP），並將攜帶信號肽的多肽鏈連同核糖體一同導向內質網的腔（cisternal space）或膜上。

限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）分析是一種利用限制性內切酶（restriction enzyme）識別特定 DNA 序列並將其切割的特性，來檢測 DNA 序列變異的方法。該方法的基本原理是：不同的等位基因（alleles）可能在限制性內切酶的識別位點上存在差異。如果一個等位基因含有某種限制性內切酶的識別位點，而另一個等位基因不含有，那麼用該酶切割這兩種 DNA 後，產生的 DNA 片段長度就會不同。通過凝膠電泳分離這些不同長度的片段，就可以區分不同的等位基因。

分析基因表達的常見技術包括檢測 mRNA（基因轉錄的產物）或蛋白質（基因翻譯的產物）。題目問的是「多肽序列」（polypeptide sequences）的轉移到膜上進行分析，這指的是蛋白質的檢測。

Southern blotting 用於檢測 DNA。
Northern blotting 用於檢測 RNA。
Western blotting 用於檢測蛋白質。

核心觀念

本題考查以核酸互補配對原理分析基因表現與功能的技術。

核酸分子可依鹼基互補原則形成穩定的雙股結構：

• DNA 中：$A$ 與 $T$ 配對，$G$ 與 $C$ 配對。
• RNA 與 DNA 雜交時：RNA 的 $A$ 與 DNA 的 $T$ 配對，RNA 的 $U$ 與 DNA 的 $A$ 配對，$G$ 與 $C$ 配對。

因此，只要利用一段已知序列的標記 DNA 探針，便能透過互補配對辨認目標核酸，進一步判定特定基因是否表現，以及其在細胞或組織中的位置。

解題方法

判斷各選項是否以「互補核酸探針與目標序列雜交」作為核心原理。若技術的主要目的，是在細胞或組織中定位特定 mRNA，便是利用帶有標記的互補 DNA 探針與目標 RNA 雜交，此技術為 in situ hybridization。

本題依一般單選題命題意旨，選擇能直接以核酸互補性在組織中偵測基因表現位置的技術：

所以答案為 D。

選項分析

A) Northern blotting

Northern blotting 用來分析特定 RNA 的大小與相對含量。其流程通常包括：

1. 以電泳分離 RNA。
2. 將 RNA 轉移至膜上。
3. 加入帶有標記、可與目標 RNA 互補的核酸探針。
4. 透過雜交訊號偵測特定轉錄本。

因此，Northern blotting 的確也使用核酸鹼基互補性；不過它主要提供的是 RNA 的大小與表現量資訊，而不是在細胞或組織中的空間位置。依本題單選命題所要辨認的典型技術，並非最佳答案。

B) use of RNAi

RNA interference, RNAi 利用與目標 mRNA 互補的 small interfering RNA（siRNA）或相關 RNA 分子，引導 RNA-induced silencin

桃莉羊（Dolly the sheep）的克隆是利用體細胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）技術實現的。該技術的關鍵步驟如下：

1. 獲取供體細胞核：從一個成年綿羊（桃莉羊的母親）的乳腺細胞（體細胞）中分離出細胞核。
2. 獲取去核卵母細胞：從另一隻成年綿羊（卵母細胞供體）中獲取卵母細胞，並去除其細胞核。
3. 核移植：將來自體細胞的細胞核注射到去核的卵母細胞中。
4. 刺激發育：通過電脈衝或其他方法刺激融合後的細胞，使其開始分裂並發育。

酵母菌（特別是釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae）的交配型轉換（mating type switch）是一種獨特的基因調控機制，允許單倍體酵母菌在特定情況下改變其交配型，從而實現有性繁殖。這種轉換發生在二倍體酵母菌形成過程中，或在單倍體酵母菌需要尋找配偶時。

核心概念：
酵母菌有兩種交配型：a 型 (a mating type) 和 $\alpha$ 型 ($\alpha$ mating type)。這兩種交配型由位於 MAT 區域（mating type locus）的一對基因決定：MATa 和 MAT$\alpha$。MAT 區域有三個基因位點：HML$\alpha$、HMRa 和 MAT。

• HML$\alpha$ 和 HMRa 是兩個「沉默」的基因座位，它們儲存著交配型信息（$\alpha$ 和 a），但通常不表達。
• MAT 區域是唯一一個「表達」交配型基因的位點。MAT 區域可以包含 MATa 或 MAT$\alpha$ 兩個等位基因中的一個。
• MAT 區域的旁邊有兩個「沉默信息調節區」（Silent Information Regulators, SIRs）：SIR3 和 SIR4，它們與 SIR2（一種 NAD+-依賴性的去乙醯化酶）協同作用，在 HML 和 HMR 位點周圍形成異染色質（heterochromatin）結構，從而抑制這些位點的基因表達。

轉換機制：
交配型轉換的發生依賴於一個稱為 HO（Homing endonuclease）基因的表達。HO 基因是一種內切酶，它在 MAT 區域產生一個雙鏈斷裂（double-strand break, DSB）。這個 DSB 發生在 MAT 區域的邊緣，緊鄰著 MAT 區域的基因信息。

1. HO 基因的表達：HO 基因的表達受到細胞週期和細胞信號的嚴格調控，通常只在單倍體細胞的 G1 期末期表達。
2. 產生雙鏈斷裂 (DSB)：HO 酶識別並切割 MAT 區域內的一個特定序列（E 區）。

大腸桿菌（E. coli）的 DNA 聚合酶 I（DNA Pol I）和 DNA 聚合酶 III（DNA Pol III）在 DNA 複製和修復過程中扮演著不同的角色，它們的外切酶活性（exonuclease activities）的差異是理解其功能差異的關鍵。

DNA 聚合酶 III (DNA Pol III)：

• 主要功能：DNA Pol III 是 E. coli 中主要的 DNA 複製酶，負責合成新的 DNA 鏈。它具有高度的合成能力（processivity），能夠連續合成長鏈 DNA。
• 外切酶活性：DNA Pol III 擁有 3' $\rightarrow$ 5' 外切酶活性。這是一種校對（proofreading）功能。當 DNA Pol III 在合成 DNA 時，如果錯誤地加入了一個不配對的鹼基，其 3' $\rightarrow$ 5' 外切酶活性會識別這個錯誤，將錯誤的鹼基從新合成鏈的 3' 末端切除，然後再重新合成。這個校對功能極大地提高了 DNA 複製的準確性。

DNA 聚合酶 I (DNA Pol I)：

• 主要功能：DNA Pol I 在 DNA 複製中也扮演重要角色，特別是在岡崎片段（Okazaki fragment）的成熟過程中，以及在 DNA 修復過程中。它不像 DNA Pol III 那樣是主要的合成酶，而是更像一個「清潔工」。
• 外切酶活性：DNA Pol I 具有 兩種外切酶活性：
  1. 5' $\rightarrow$ 3' 外切酶活性：這是 DNA Pol I 最獨特的活性之一。它允許 DNA Pol I 從 DNA 鏈的 5' 末端開始，移除一個核苷酸，然後緊接著在同一個 3' 末端合成新的核苷酸。這種活性在岡崎片段的連接中至關重要：當 DNA Pol III 完成一個岡崎片段的合成後，在片段之間會留下一個 RNA 引物（primer）。

基因轉換 (Gene Conversion)

定義：
基因轉換是一種非對稱的遺傳事件，發生在同源染色體或同源基因座之間。在這個過程中，一個基因座的 DNA 序列會「轉換」成另一個基因座的序列。簡單來說，就是一個等位基因（allele）的序列會「複製」並「替換」掉另一個等位基因的序列，而沒有發生通常意義上的重組（如交叉互換）。這導致了非孟德爾式的遺傳比例，例如，在四分子分析（tetrad analysis）中，原本應該是 2:2 的等位基因比例變成了 3:1 或 1:3。

機制：
基因轉換最廣泛接受的機制模型是基於 DNA 雙鏈斷裂修復 (Double-Strand Break Repair, DSBR) 模型，尤其是在 錯配修復 (Mismatch Repair, MMR) 的參與下。

1. 產生雙鏈斷裂 (DSB)：通常，同源染色體上的一個基因座（例如，一個基因的兩個等位基因，或者緊密連鎖的兩個基因）中的一個 DNA 鏈會隨機產生一個雙鏈斷裂 (DSB)。這個 DSB 可以由內源性（如 HO 酶在酵母菌交配型轉換中）或外源性因素引起。
2. DNA 鏈延伸與模板使用：斷裂的 DNA 末端被切除，暴露出單鏈的 3' overhang。這些 3' overhang 會尋找同源序列（來自另一個等位基因或緊密連鎖的基因）作為模板，並在其上進行鏈延伸（DNA synthesis）。
3. 形成糾纏結構 (Holliday Junction)：當延伸的鏈與模板鏈結合後，會形成一個稱為 Holliday junction 的糾纏結構。
4. DNA 聚合酶填補空隙：DNA 聚合酶會填補在鏈延伸過程中產生的任何空隙。
5. 錯配修復 (MMR)：在 DSBR 過程中，如果模板序列與原來斷裂鏈的序列不完全匹配（例如，由於存在不同的等位基因），就會產生 DNA 錯配。細胞內的錯配修復系統（MMR）會識別這些錯配。
6. 非對稱切除與替換：MMR 系統會識別錯配區域，並從一個 DNA 鏈上切除一小段 DNA 序列，然後用正確的序列（來自模板鏈）進行替換。

核酶體介導的 RNA 剪接 (Spliceosome-Mediated RNA Splicing)

核心概念：
在真核生物中，基因在轉錄後會產生前體 mRNA（pre-mRNA），其中包含編碼區（外顯子, exons）和非編碼區（內含子, introns）。RNA 剪接是移除內含子的過程，將外顯子連接起來，形成成熟的 mRNA。這個過程主要由一個大型、複雜的分子機器——核酶體 (spliceosome) 完成。核酶體由一組稱為小核核糖核蛋白 (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) 的分子和許多蛋白質因子組成。

核酶體的組成：
主要的 snRNPs 是 U1, U2, U4, U5, U6。它們包含小核 RNA（snRNAs）和一系列蛋白質。這些 snRNAs 是 RNA 剪接反應的催化核心，它們能夠識別 pre-mRNA 上的特定剪接信號序列，並與之結合，將核酶體組裝到 pre-mRNA 上。

剪接信號序列：
內含子和外顯子的連接處（剪接位點）通常有特定的保守序列：

1. 5' 剪接位點 (5' splice site)：通常是 GU 序列，位於內嵌子的 5' 端。
2. 3' 剪接位點 (3' splice site)：通常是 AG 序列，位於內嵌子的 3' 端。
3. 分支位點 (branch point)：位於內嵌子內部，通常是一個富含嘧啶的區域，其中包含一個腺嘌呤（A）殘基。這個腺嘌呤的 2'-OH 基團在剪接過程中起關鍵作用。

剪接過程的步驟：
核酶體介導的 RNA 剪接是一個高度協調的過程，涉及一系列的 RNA-RNA 和 RNA-蛋白質相互作用，以及 snRNPs 的組裝和離解。大致可以分為以下幾個階段：

1. 早期組裝 (Early Assembly)：
   • U1 snRNP 識別 5' 剪接位點：U1 snRNP 結合到 pre-mRNA 的 5' 剪接位點 (GU)。
   • U2 snRNP 識別分支位點：U2 snRNP 結合到分支位點區域，並引導一個關鍵的腺嘌呤（A）殘基暴露其 2'-OH 基團。這個過程需要輔助因子（如 U2AF）的幫助。

基因敲除 (Gene Knock-out) 與基因敲低 (Gene Knock-down)

基因敲除和基因敲低都是用於研究基因功能的重要實驗技術，它們通過降低或消除特定基因的表達或活性，來觀察其對細胞或生物體造成的表型變化，從而推斷該基因的功能。儘管目的相似，但它們的機制和效果有顯著區別。

1. 基因敲除 (Gene Knock-out)

• 定義：基因敲除是指通過遺傳工程手段，使目標基因的 DNA 序列發生永久性的、不可逆的改變，導致該基因無法被轉錄或翻譯，或者其產物（蛋白質）完全失活。換句話說，是將目標基因「敲除」，使其在基因組中「不存在」或「無功能」。
• 機制：
  • 同源重組 (Homologous Recombination)：在早期研究中，主要通過在胚胎幹細胞 (ES cells) 中利用同源重組技術，將目標基因的編碼區替換為一個選擇標記基因（如新黴素抗性基因），從而破壞基因的開放閱讀框（open reading frame, ORF）。
  • CRISPR-Cas9 系統：近年來，CRISPR-Cas9 基因編輯技術極大地簡化和提高了基因敲除的效率。通過設計特異性的 guide RNA (gRNA)，Cas9 核酸酶可以在目標基因的特定位點產生雙鏈斷裂 (DSB)。細胞在修復這個 DSB 時，如果沒有提供修復模板，就有可能發生隨機的插入或刪除（indels），從而導致基因移碼突變（frameshift mutation）或提前終止，使基因失活。如果提供了含有特定序列的修復模板，則可以精確地替換或刪除目標基因。
• 效果：基因被永久性地失活。
• 優點：
  • 可以徹底、永久地消除基因功能。
  • 適用於研究基因的生理功能，特別是當基因產物是必需的時。
  • 可用於構建基因敲除動物模型，研究基因在個體發育和生理過程中的作用。
• 缺點：
  • 技術複雜，特別是傳統的同源重組方法，需要篩選大量的細胞。
  • CRISPR-Cas9 雖然效率高，但仍可能存在脫靶效應（off-target effects）。
  • 對於某些必需基因，完全敲除可能導致胚胎致死，難以研究其在特定組織或發育階段的功能。
  • 無法研究基因的部分功能或劑量效應（dosage effect）。

2. 基因敲低 (Gene Knock-down)

• 定義：基因敲低是指通過技術手段，使目標基因的 mRNA 水平或蛋白質水平暫時性地降低，而不是永久性地消除。其目的是「降低」基因的表達量，而不是完全「敲除」。
• 機制：
  • RNA 干擾 (RNA Interference, RNAi)：這是最常用的基因敲低技術。通過導入外源性的雙鏈 RNA (dsRNA) 或小干擾 RNA (siRNA)，或表達小結構 RNA (shRNA)，這些 RNA 分子會與細胞內的目標 mRNA 結合，導致 mRNA 被核酸酶降解，或者抑制其翻譯成蛋白質。
  • 反義寡核苷酸 (Antisense Oligonucleotides, ASOs)：ASOs 是短鏈的單鏈 DNA 或 RNA，其序列與目標 mRNA 互補。ASOs 可以結合到目標 mRNA 上，通過 RNase H 誘導 mRNA 降解，或者阻止翻譯。
  • 基因表達的暫時性抑制：某些轉錄因子或 microRNA 的調控也可以用於暫時性地降低基因表達。

表觀遺傳學 (Epigenetics)

定義：
表觀遺傳學（Epigenetics）是指研究在不改變 DNA 序列本身的基礎上，遺傳信息的改變如何影響基因表達和細胞表現型的學科。這些改變是可遺傳的（在細胞分裂或世代間），並且通常是可逆的。簡單來說，表觀遺傳學研究的是「在基因之上」的調控機制，它決定了哪些基因在何時、何地、以何種程度被表達，而 DNA 的鹼基序列本身並未發生改變。

表觀遺傳學的關鍵機制：
表觀遺傳學主要通過三種相互關聯的分子機制來調控基因表達：

1. DNA 甲基化 (DNA Methylation)：

   • 機制：這是最為人熟知的表觀遺傳學標記。在哺乳動物中，DNA 甲基化主要發生在胞嘧啶（C）的第 5 個碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC）。這種修飾通常發生在 CpG 二核苷酸序列（一個 C 後面緊接著一個 G）上，這些 CpG 位點在基因組中常聚集成 CpG islands，尤其是在基因的啟動子區域。
   • 調控基因表達：
     • 沉默基因：當 CpG islands 發生高甲基化時，通常會抑制基因的轉錄。甲基化可以直接阻止轉錄因子結合到啟動子區域，或者招募甲基化結合蛋白（methyl-CpG-binding domain proteins, MBDs），這些蛋白進一步招募抑制性蛋白質複合物，導致組蛋白去乙醯化和染色質緻密化（形成異染色質），從而使基因沉默。
     • 維持基因沉默：DNA 甲基化還可以通過 DNA 甲基轉移酶（DNMTs）在 DNA 複製時被「維持」下來，確保子代細胞繼承親代細胞的甲基化模式和基因表達狀態。

2. 組蛋白修飾 (Histone Modifications)：

   • 機制：DNA 在細胞核內被纏繞在組蛋白（histones）周圍，形成核小體（nucleosomes），進而構成染色質（chromatin）。組蛋白的 N 端尾部可以被多種化學基團修飾，包括乙醯化（acetylation）、甲基化（methylation）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等。
   • 調控基因表達：
     • 乙醯化 (Acetylation)：組蛋白乙醯化（通常由組蛋白乙醯轉移酶, HATs, 催化）會中和組蛋白尾部帶正電的賴氨酸殘基，降低組蛋白與帶負電的 DNA 之間的結合力。這會使染色質結構鬆弛（形成常染色質, euchromatin），有利於轉錄因子和 RNA 聚合酶接近 DNA，從而促進基因轉錄。組蛋白去乙醯化（由組蛋白去乙醯化酶, HDACs, 催化）則相反，會使染色質緻密化，抑制基因表達。
     • 甲基化 (Methylation)：組蛋白甲基化（由組蛋白甲基轉移酶, HMTs, 催化）可以對基因表達產生激活或抑制的雙重效應，這取決於甲基化發生的組蛋白位點和甲基化的程度（單甲基化、雙甲基化、三甲基化）。例如，H3K4me3（組蛋白 H3 賴氨酸 4 的三甲基化）通常與基因激活相關，而 H3K9me3 和 H3K27me3 則與基因沉默和異染色質形成相關。

RNA 干擾 (RNA Interference, RNAi)

定義：
RNA 干擾（RNAi）是一種在真核生物中普遍存在的、由雙鏈 RNA (dsRNA) 誘導的、後轉錄水平的基因沉默機制。它通過靶向和降解特定的信使 RNA (mRNA) 或抑制其翻譯，來達到降低目標基因表達的目的。RNAi 是一種高度特異性的基因調控方式。

核心機制：
RNAi 的核心機制涉及兩種主要的小 RNA 分子：小干擾 RNA (small interfering RNAs, siRNAs) 和 微小 RNA (microRNAs, miRNAs)。儘管它們的來源和初始生成途徑略有不同，但它們的作用方式在後期是相似的，都是與 RISC 複合物結合，並引導該複合物靶向並沉默目標 mRNA。

1. dsRNA 的產生與加工：

   • siRNA 途徑：通常由外源性的 dsRNA（如病毒 RNA）或內源性的反轉錄轉座子、或實驗室導入的 dsRNA 產生。dsRNA 被一個稱為 Dicer 的核糖核酸酶切割成約 21-25 個鹼基對的 dsRNA 小片段，即 siRNA。
   • miRNA 途徑：miRNA 前體（pri-miRNA）在細胞核內由 Drosha-DGCR8 複合物加工成約 70 個核苷酸的 pre-miRNA，然後輸出到細胞質。在細胞質中，Dicer 將 pre-miRNA 加工成約 21-25 個鹼基對的 dsRNA 小片段，即 miRNA。

2. RISC 複合物的形成與激活：

   • siRNA 或 miRNA 的 dsRNA 雙鏈會與一個稱為 RNA 誘導的沉默複合物 (RNA-induced silencing complex, RISC) 的蛋白質複合物結合。
   • RISC 複合物中的一種核心蛋白（如 Argonaute, Ago）會解旋 dsRNA，並選擇性地保留其中一個鏈（通常是具有較低 5' 端結合能的鏈，稱為引導鏈 guide strand），而另一條鏈（乘客鏈 passenger strand）則被降解。
   • 帶有引導鏈的 RISC 複合物（通常稱為 miRISC 或 siRISC）就成為一個能夠識別目標 mRNA 的活性複合物。

3. 靶向與沉默：

   • siRNA：引導鏈 siRNA 與目標 mRNA 之間存在完全或近乎完全的鹼基互補性。一旦結合，RISC 複合物中的 Argonaute 蛋白（具有核酸酶活性）會切割目標 mRNA，導致其被降解。