109 年 國立成功大學生物科技與產業科學系《分子生物學》

此題考查對微衛星 DNA 的基本概念與定義。

微衛星 DNA (Microsatellite DNA) 是一種重複序列，其特徵是基本重複單元 (unit repeat) 的長度通常小於 6 個鹼基對 (base pairs, bp)，且這些單元以串聯重複 (tandem repeats) 的方式排列。這些重複序列在基因組中的總數量相當多，但通常位於非蛋白質編碼區域，例如基因的內含子 (introns) 或基因間區 (intergenic regions)。

微衛星 DNA 的重要特性包括：

1. 高變異性 (High mutability)：由於重複序列的性質，在 DNA 複製過程中容易發生滑動 (slippage) 現象，導致重複

此題考查對核糖開關 (riboswitch) 的定義與功能。

核糖開關 (Riboswitch) 是一種結構性的 RNA 區域，通常位於 mRNA 的非轉譯區 (untranslated region, UTR)，特別是 5' UTR。它能夠直接結合小分子配體 (ligand)，透過改變其二級結構來調控下游基因的表現。這種調控機制是一種順式作用 (cis-acting) 的基因表現調控方式，不需額外的蛋白質因子。

核糖開關的調控機制通常涉及兩種主要的結構域：

1. 配體結合域 (Ligand-binding domain)：這是 RNA 的一部分，負責特異性地辨識並結合特定的代謝物、離子或其他小分子。
2. 表達控制層 (Expression control layer)：這是 RNA 的另一部分，其結構會因配體結合而發生改變。

此題考查對同源重組 (homologous recombination) 的定義與機制。

同源重組 (Homologous Recombination, HR) 是一種重要的 DNA 修復和遺傳重組機制，發生在序列高度相似的 DNA 分子之間。它涉及 DNA 斷裂的精確修復，並在減數分裂過程中產生遺傳多樣性。

同源重組的關鍵步驟包括：

1. DNA 斷裂與末端處理 (DNA breakage and end resection)：首先，DNA 發生雙股斷裂 (double-strand break, DSB)。斷裂的末端會被核酸酶 (nucleases) 切除，產生單股的 DNA overhangs。
2. DNA 侵入 (DNA invasion)：其中一個單股 overhang 會在 RecA (在細菌中) 或 RAD51 (在真核生物中) 蛋白質的協助下，尋找並侵入一個同源的 DNA 分子（模板鏈，template strand）。

此題考查對轉錄抑制因子 (transcription repressor) 的定義與功能。

轉錄抑制因子 (Transcription repressor) 是一種蛋白質，它能夠結合到 DNA 的特定序列區域（通常是啟動子或增強子的上游或下游的操縱子 (operator) 或抑制區域 (silencer)），從而阻止或顯著降低 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 與啟動子結合，或阻礙 RNA 聚合酶的延伸作用，最終抑制目標基因的轉錄。

轉錄抑制因子的作用機制主要有幾種：

1. 阻礙 RNA 聚合酶結合：抑制因子直接結合在啟動子區域，物理性地阻礙 RNA 聚合酶與啟動子區域結合，使其無法開始轉錄。

此題考查對類代謝物阻遏 (catabolite repression) 的定義與機制，特別是在細菌中的應用。

類代謝物阻遏 (Catabolite repression)，又稱為葡萄糖效應 (glucose effect)，是細菌（尤其是大腸桿菌 E. coli）中一種重要的基因表現調控機制，用於優先利用葡萄糖等簡單碳源，並在這些簡單碳源耗盡時才開始代謝複雜碳源。最經典的例子是調控乳糖操縱子 (lac operon) 的表現。

其核心機制是透過細胞內 cAMP (環腺苷酸) 的濃度變化來實現的：

1. 葡萄糖濃度高時：細胞內葡萄糖濃度高時，會抑制腺苷酸環化酶 (adenylate cyclase) 的活性，導致 cAMP 的合成減少，細胞內 cAMP 濃度降低。
2. cAMP-CAP 複合物的形成：cAMP 在細胞內濃度低時，無法有效結合到貓尿嘧啶結合蛋白 (catabolite activator protein, CAP)，也稱為 catabolite repressor protein (CRP)。CAP 是一個二聚體蛋白質。
3. 調控基因表現：當 cAMP 濃度低時，CAP 無法與 cAMP 結合形成 cAMP-CAP 複合物。

此題考查對假基因 (pseudogene) 的定義與來源。

假基因 (Pseudogene) 是指一個曾經具有正常基因功能，但由於發生了突變（如點突變、插入、刪除、重排等）而喪失了其正常功能的 DNA 序列。在序列上，它與一個功能性基因高度相似，但由於突變，它無法產生有功能的蛋白質或 RNA。

假基因的形成主要有兩種途徑：

1. 非加工假基因 (Non-processed pseudogenes)：這是最常見的一種。它們是由於基因內部發生了無義突變 (nonsense mutation)、移碼突變 (frameshift mutation) 或啟動子區域發生突變，導致無法正常轉錄或轉譯，或產生了無功能的蛋白質。這些突變可能發生在基因複製、修復或演化過程中。

此題考查對組蛋白修飾的理解，包括一種具體修飾的描述及其在染色質功能上的影響。

染色質 (chromatin) 是 DNA 與組蛋白 (histones) 結合形成的複合物，其結構的緊密程度（鬆散或緻密）直接影響基因的轉錄活性。組蛋白的 N 端尾巴 (N-terminal tails) 是進行化學修飾的主要位點，這些修飾統稱為組蛋白後轉譯修飾 (histone post-translational modifications, PTMs)，它們共同構成了「組蛋白密碼」(histone code)。

常見的組蛋白修飾包括乙醯化 (acetylation)、甲基化 (methylation)、磷酸化 (phosphorylation)、泛素化 (ubiquitination) 等。這裡我們選擇組蛋白乙醯化 (Histone Acetylation) 來進行說明。

組蛋白乙醯化 (Histone Acetylation)：

• 修飾位點：組蛋白（特別是 H2A, H2B, H3, H4）的 N 端尾巴上，特別是離胺酸 (lysine, K) 殘基。
• 作用機制：由組蛋白乙醯轉移酶 (Histone Acetyltransferases, HATs) 催化，將乙醯基 (acetyl group) 從乙醯輔酶 A (acetyl-CoA) 轉移到離胺酸的 ε-amino 基團上。

此題考查對染色質免疫沉澱 (ChIP) 技術的定義及其在分子生物學研究中的目的。

ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) 是一種實驗技術，用於確定特定的蛋白質（例如轉錄因子、組蛋白修飾酶）在細胞核內與 DNA 的結合位置。它結合了細胞固定、染色質片段化、免疫學分離以及 DNA 定量分析等步驟。

ChIP 的基本步驟：

1. 細胞固定 (Crosslinking)：使用甲醛 (formaldehyde) 等交聯劑，在細胞內將蛋白質與其結合的 DNA 分子共價連接起來。
2. 染色質片段化 (Chromatin Fragmentation)：通過超音波處理 (sonication) 或酶切，將交聯後的染色質打斷成較小的片段（通常為幾百到一千個鹼基對）。
3. 免疫沉澱 (Immunoprecipitation)：使用針對目標蛋白質的特異性抗體，將與該蛋白質結合的 DNA 片段從細胞裂解液中沉澱出來。
4. DNA 分離與純化 (DNA Isolation and Purification)：從免疫沉澱複合物中釋放結合的 DNA，並進行純化。
5. DNA 定量與分析 (DNA Quantification and Analysis)：
   • ChIP-qPCR：使用定量 PCR (qPCR) 來檢測特定已知 DNA 區域（例如某個基因的啟動子）是否富集，從而確認目標蛋白質是否結合於該區域。

此題考查對 CRISPR/Cas9 技術作用機制的理解，以及其在生物學研究或應用中的一個具體例子。

CRISPR/Cas9 技術的作用機制：
CRISPR/Cas9 是一種源自細菌適應性免疫系統的基因編輯技術，它能夠精確地在基因組的特定位置引入 DNA 斷裂，從而實現基因的敲除 (knockout)、敲入 (knock-in) 或修改。該系統主要包含兩個關鍵組件：

1. Cas9 蛋白質 (Cas9 nuclease)：這是一種 DNA 酶，能夠切割雙股 DNA。它在 CRISPR/Cas9 系統中扮演「剪刀」的角色。
2. 導向 RNA (guide RNA, gRNA)：這是一個短的 RNA 分子，由兩部分組成：
   • crRNA (CRISPR RNA)：約 20 個鹼基對的序列，具有「目標識別序列」，能夠與待編輯基因組區域的互補 DNA 序列配對，引導 Cas9 蛋白質到達目標位點。
   • tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)：一個輔助 RNA，與 crRNA 結合，並與 Cas9 蛋白質形成一個穩定的複合物。在實驗室中，這兩部分 RNA 通常被設計成一個單一的融合分子，稱為單導向 RNA (single guide RNA, sgRNA)。

作用過程：

• sgRNA 的目標識別序列會與基因組中與之互補的 DNA 序列（靶序列）配對。
• Cas9 蛋白質需要識別靶序列旁邊的特定短序列，稱為 PAM (Protospacer Adjacent Motif)，例如在 S. pyogenes 的 Cas9 中，PAM 序列是 5'-NGG-3'（N 為任意鹼基）。PAM 序列是 Cas9 識別並結合到 DNA 的關鍵信號。
• 一旦 sgRNA 找到靶序列並存在正確的 PAM 序列，Cas9 蛋白質就會發生構象變化，並在靶序列的特定位置（通常在 PAM 序列的下游約 3 個鹼基處）切割雙股 DNA，產生雙股斷裂 (double-strand break, DSB)。

DNA 修復與基因編輯：
細胞會試圖修復這個 DSB。主要的修復途徑有兩種：

1. 非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ)：這是一種易出錯的修復途徑，在連接斷裂末端時，經常會引入小的插入或刪除 (insertions or deletions, indels)。

此題考查對 microRNA (miRNA) 的作用機制及其在生物體內的至少兩種功能。

miRNA 的作用機制：
microRNA (miRNA) 是一類長度約 21-23 個核苷酸的短非編碼 RNA 分子，它們在真核生物中廣泛存在，並在多種細胞過程中發揮重要的調控作用。miRNA 的調控主要通過與目標 mRNA 的 3' 非轉譯區 (3' untranslated region, 3' UTR) 進行鹼基配對來實現。

miRNA 的生合成和作用過程大致如下：

1. 轉錄：miRNA 基因首先被轉錄成較長的初級轉錄本 (pri-miRNA)，通常具有莖環結構 (stem-loop structure)。
2. 核內加工：在細胞核內，由複合物 Drosha-DGCR8 (Pasha) 催化，將 pri-miRNA 加工成一個約 70 個核苷酸的莖環前體 (pre-miRNA)。
3. 輸出與核外加工：pre-miRNA 通過核孔複合物輸出到細胞質。在細胞質中，由 Dicer 蛋白質進一步切割，將莖環結構打開，形成一個約 22 個核苷酸的雙股 RNA 分子，稱為 miRNA-miRNA* 雙鏈。
4. RISC 複合物形成：其中一條鏈（通常是 miRNA 鏈）被整合到一個蛋白質複合物中，稱為 RNA 誘導的沉默複合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC 中的關鍵成分是 Argonaute (Ago) 蛋白質。
5. 目標 mRNA 結合與調控：RISC 複合物中的 miRNA 作為導向分子，尋找與其序列部分互補的 mRNA 分子。
   • 不完全配對 (Imperfect pairing)：在動物中，miRNA 通常與目標 mRNA 的 3' UTR 進行不完全配對。這種情況下，miRNA 的結合會抑制目標 mRNA 的轉譯效率（translation repression），或促進其不穩定性，導致 mRNA 被降解。
   • 完全配對 (Perfect pairing)：在植物中，miRNA 通常與目標 mRNA 進行完全配對。

此題考查 DNA 和 RNA 在鹼基組成上的差異，特別是胸腺嘧啶 (T) 和尿嘧啶 (U) 的區別及其演化上的意義。

DNA 和 RNA 在組成上最顯著的差異之一是鹼基的選擇。DNA 中的嘧啶鹼基是胞嘧啶 (Cytosine, C) 和胸腺嘧啶 (Thymine, T)，而 RNA 中的嘧啶鹼基是胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。腺嘌呤 (A) 和鳥糞嘌呤 (G) 在兩者中均有。

為什麼 DNA 使用胸腺嘧啶 (T)，而 RNA 使用尿嘧啶 (U)？

這個問題的根源在於胞嘧啶 (C) 的脫氨基化 (deamination)。

1. 胞嘧啶 (C) 的脫氨基化：胞嘧啶可以自發地發生脫氨基化反應，轉變成尿嘧啶 (U)。這個反應過程如下：
   C + H₂O → U + NH₃
   這個反應是相對常見的，並且會將胞嘧啶「變成」尿嘧啶。

2. DNA 中的問題：如果 DNA 分子中含有尿嘧啶 (U)，那麼一旦 C 脫氨基變成 U，DNA 聚合酶在複製時就無法區分原始的 C 和由 C 脫氨基產生的 U。它可能會錯誤地將 U 作為一個正常的鹼基，並在其互補鏈上配對一個 A。這樣，一個原本是 C-G 的鹼基對，就會錯誤地變成 T-A 鹼基對，導致基因突變。
   為了避免這種情況，DNA 分子演化出了機制來識別和修復這種由 C 脫氨基產生的 U。DNA 中的 U 如果被偵測到，就會被 DNA 修復系統（如 DNA 糖苷酶）識別並移除，然後 DNA 聚合酶會填補空缺，並通常會重新插入一個 C，從而維持基因組的穩定性。

3. DNA 中使用胸腺嘧啶 (T) 的演化優勢：胸腺嘧啶 (T) 是尿嘧啶 (U) 的一個甲基化衍生物。它與腺嘌呤 (A) 配對，而不是與鳥糞嘌呤 (G) 配對。更重要的是，胸腺嘧啶 (T) 的甲基化使其與尿嘧啶 (U) 在化學結構上有所不同。

   • 區分來源：DNA 中的 T 絕大多數情況下是來自於 T 的合成途徑，而不是 C 的脫氨基化。

此題考查對小核核糖核蛋白 (snRNP) 的定義及其在 RNA 剪接中的功能。

小核核糖核蛋白 (snRNP)：
小核核糖核蛋白 (small nuclear ribonucleoprotein, snRNP；發音為 "snurp") 是一類由小核 RNA (small nuclear RNA, snRNA) 和一系列蛋白質組成的複合物。這些 snRNP 存在於真核細胞的細胞核中，並且是剪接體 (spliceosome) 的主要組成部分。

根據其組成的 snRNA 的不同，主要有幾種 snRNP，其中對 RNA 剪接至關重要的包括 U1 snRNP, U2 snRNP, U4/U6 snRNP, 和 U5 snRNP。

snRNPs 在 RNA 剪接中的作用：
RNA 剪接是真核生物 mRNA 前體 (pre-mRNA) 加工過程中的一個關鍵步驟，它移除內含子 (introns)，並將外顯子 (exons) 連接起來，形成成熟的 mRNA。這個過程由一個大型的蛋白質-RNA 複合物——剪接體 (spliceosome) 完成，而 snRNPs 是剪接體的核心結構和催化單元。

剪接體組裝和催化剪接的過程大致如下：

1. 識別剪接位點：

   • U1 snRNP 結合到 pre-mRNA 的 5' 剪接位點 (5' splice site)，這個位點通常以 GU 序列開頭。
   • U2 snRNP 結合到分支位點 (branch point site)，該位點位於 3' 剪接位點附近，通常包含一個腺嘌呤 (A) 核苷酸。U2 snRNP 的結合會使分支點 A 核苷酸的 2'-OH 基團暴露出來，為後續的剪接反應做準備。

2. 組裝剪接體：

   • 在 U1 和 U2 snRNP 的基礎上，其他 snRNPs（U4/U6 snRNP 和 U5 snRNP）以及數十種非剪接體蛋白質 (non-snRNP splicing factor

此題考查對核糖體 (ribosome) 上 tRNA 結合位點的理解，包括 A, P, E 三個位點各自的功能。

核糖體是蛋白質合成（轉譯）的細胞器，它負責將 mRNA 的遺傳密碼轉譯成蛋白質的胺基酸序列。核糖體由兩個亞基（大亞基和小亞基）組成，其上具有三個 tRNA 結合位點，分別是 A 位 (aminoacyl-tRNA binding site)、P 位 (peptidyl-tRNA binding site) 和 E 位 (exit site)。

這三個位點在蛋白質合成過程中，按照 mRNA 的移動方向，依序容納 tRNA 分子，並執行特定的功能：

1. A 位 (Aminoacyl-tRNA binding site)：

   • 功能：這是新進入核糖體、攜帶下一個要加入多肽鏈的胺基酸的胺醯-tRNA (aminoacyl-tRNA) 的結合位點。
   • 過程：當 mRNA 上的密碼子 (codon) 被小亞基識別後，一個與該密碼子互補的胺醯-tRNA 會被帶入 A 位。胺醯-tRNA 的反密碼子 (anticodon) 與 mRNA 上的密碼子進行鹼基配對。如果配對成功，胺醯-tRNA 就會穩定地結合在 A 位。

2. P 位 (Peptidyl-tRNA binding site)：

   • 功能：這個位點結合了攜帶正在生長的多肽鏈的胜肽醯-tRNA (peptidyl-tRNA)。在轉譯的起始階段，第一個胺醯-tRNA（通常是 fMet-tRNA 在細菌中，或 Met-tRNA 在真核生物中）結合在 P 位。

此題考查對轉錄調控中順式作用元件 (cis-elements) 和反式作用因子 (trans-factors) 的定義與區別。

轉錄調控是細胞控制基因表現的關鍵機制，它涉及 DNA 序列與蛋白質因子之間的相互作用。這些相互作用可以分為順式作用元件和反式作用因子兩大類。

1. 順式作用元件 (Cis-elements)：

   • 定義：順式作用元件是指位於基因組 DNA 序列上的特定區域，它們能夠被反式作用因子識別並結合，從而影響基因的轉錄活性。它們是 DNA 本身的一部分。
   • 位置：這些元件通常位於目標基因的附近，包括：
     • 啟動子 (Promoter)：位於基因起始轉錄位點 (transcription start site, TSS) 上游，是 RNA 聚合酶結合並開始轉錄的核心區域。
     • 增強子 (Enhancer)：可以位於基因上游、下游或內含子中，即使距離很遠，也能通過 DNA 迴繞 (DNA looping) 與啟動子相互作用，顯著提高轉錄效率。
     • 沉默子 (Silencer)：與增強子作用類似，但它們結合反式作用因子後，會抑制或降低基因的轉錄活性。
     • 操縱子 (Operator)：在原核生物中，是轉錄抑制因子結合的 DNA 區域，位於啟動子附近。
   • 特性：順式作用元件的調控作用是「順式」的，即它們只能影響其所在的同一條 DNA 分子（順式作用）。

2. 反式作用因子 (Trans-factors)：

   • 定義：反式作用因子是指能夠結合到順式作用元件上，並調控基因轉錄的蛋白質分子。

此題考查對細菌 SOS 響應 (SOS response) 的理解，這是一種應對 DNA 損傷的應激反應。

SOS 響應 (SOS Response)：
SOS 響應是細菌（如大腸桿菌 E. coli）在面臨嚴重的 DNA 損傷時啟動的一種複雜的、廣泛的基因表現調控網絡。當 DNA 遭受如紫外線照射、化學物質誘變等導致大量 DNA 損傷時，細胞會啟動 SOS 響應來試圖修復這些損傷，並在必要時啟用一些「最後手段」的、可能導致突變的 DNA 合成機制，以確保基因組的存活。

SOS 響應的調控機制：
SOS 響應的核心調控者是 RecA 蛋白質和 LexA 蛋白質。

1. LexA 蛋白質：LexA 是一個轉錄抑制因子，它能夠結合到數十個 SOS 響應基因的啟動子區域，抑制這些基因的轉錄。
2. RecA 蛋白質：RecA 蛋白質在細胞正常狀態下主要參與 DNA 同源重組修復。當 DNA 發生損傷時，單鏈 DNA (ssDNA) 會在 RecA 蛋白質上積累。
3. RecA 的激活與 LexA 的自切割：積累的單鏈 DNA 會激活 RecA 蛋白質，使其從一個單體形式轉變為一個絲狀的、具有聚合酶活性的絲狀體 (filamentous form)。活化的 RecA 絲狀體能夠與 LexA 蛋白質結合，並觸發 LexA 蛋白質的自身切割 (autoproteolysis)。
4. SOS 基因的表達：LexA 的自身切割會導致其失去結合 DNA 的能力，從而釋放被抑制的 SOS 響應基因。這些基因的表達水平因此急劇升高。

SOS 響應的關鍵基因及其功能：
SOS 響應網絡包含許多基因，其中一些關鍵基因包括：

• umuDC 基因 (後來的 dinP/umuD, dinJ/umuC)：編碼的蛋白質是誘變性 DNA 聚合酶 V (DNA polymerase V, Pol V) 的組成部分。