111 年 國立成功大學生命科學研究所乙組《分子生物學》

此題考查 DNA 的鹼基配對規則。在雙股 DNA 中，腺嘌呤 (Adenine, A) 的含量會等於胸腺嘧啶 (Thymine, T) 的含量，而鳥糞嘌呤 (Guanine, G) 的含量會等於胞嘧啶 (Cytosine, C) 的含量。這個規則又稱為 Chargaff's rule。

核心觀念

1. 限制酶與迴文序列（Palindromic sequence）：第二型限制性核酸內切酶（Type II restriction endonucleases）通常辨識具有雙重旋轉對稱性（twofold rotational symmetry / $C_2$ symmetry）的雙股 DNA 序列。即一條鏈在 $5' \rightarrow 3'$ 方向的序列與其反向互補鏈在 $5' \rightarrow 3'$ 方向的序列完全相同。
2. 切位頻率的統計機率模型：在鹼基隨機均勻分布（$\text{A}=\text{T}=\text{C}=\text{G}=25\%$）的假設下，長度為 $n$ 個鹼基的特定序列，其隨機出現機率為 $\left(\frac{1}{4}\right)^n$，即平均每 $4^n\text{ bp}$ 出現一次。
3. 相容性黏狀末端（Compatible sticky/cohesive ends）與同尾酶（Isocaudomers）：不同的限制酶若辨識不同序列，但切割後能產生互補且相容的單股突出端（overhang），則兩者的黏狀末端可藉由 Watson-Crick 鹼基配對形成氫鍵並進行接合（ligation）。

解題方法

a. Palindromic（迴文序列）之定義

在分子生物學中，「迴文序列」是指一段雙股 DNA 序列，當分別沿著兩條互補鏈各自的 $5' \rightarrow 3'$ 方向讀取時，其核苷酸序列完全相同（即具有中心反向對稱軸）。

以題目給定的 SalI 辨識序列為例：
$5'\text{-G T C G A C-}3'$
$3'\text{-C A G C T G-}5'$

• 上股由 $5' \rightarrow 3'$ 讀取為：$\text{G-T-C-G-A-C}$
• 下股由 $5' \rightarrow 3'$ 讀取為：$\text{G-T-C-G-A-C}$
  兩者完全一致，此特徵即稱為迴文。

b. SalI 辨識位在基因組中出現的計算頻率

步驟與推導：

1. 假設條件：假設基因組中四種去氧核糖核苷酸（$\text{A, T, C, G}$）隨機且均勻分布，各鹼基出現機率均為 $p = \frac{1}{4}$。
2. 機率計算：SalI 辨識序列為特定之 $6\text{ bp}$ 序列（$\text{GTCGAC}$），各位置之鹼基出現視為獨立事件，故該特定六核苷酸序列出現的理論機率 $P$ 為：
   $P = \left(\frac{1}{4}\right)^6 = \frac{1}{4096} \approx 2.44 \times 10^{-4}$
3. 頻率／間隔（Frequency / Expected Occurrence）：
   在雙股 DNA 隨機序列中，平均每 $4^6 = 4096\text{ bp}$（約每 $4.1\text{ kb}$）會出現一個 SalI 切位。

c. SalI 與 XhoI 切割產生的黏狀末端能否相互黏合及原因

步驟與推導：

1. 分析 SalI 之切割產物：
   SalI 辨識 $5'\text{-GTCGAC-}3'$ 並在 $\text{G}$ 與 $\text{T}$ 之間切開，產生帶有 $4\text{ nt}$ 的 $5'$ 突出端（$5'\text{ overhang}$）：
   $5'\text{-G}\quad\quad\quad\quad\quad 5'\text{-TCGAC-}3'$

核心觀念

DNA 複製時，**解旋酶（helicase）**會在複製叉將雙股 DNA 的鹼基對分開，使兩條親代股成為模板。由於 DNA 雙股結構具有螺旋性，複製叉前方的 DNA 會因持續解旋而產生扭轉張力與超螺旋。

**拓撲異構酶（topoisomerase）**的功能，是暫時切開 DNA 的一股或兩股，讓 DNA 鏈旋轉或通過，再將切口重新接合，以改變 DNA 的拓撲狀態。因此在 DNA 複製過程中，拓撲異構酶可解除複製叉前方累積的扭轉張力，避免 DNA 過度超螺旋而阻礙複製叉前進。

常見分類如下：

• 第一型拓撲異構酶（topoisomerase I）：通常切開單股 DNA，讓另一股通過或使 DNA 鏈旋轉，以解除超螺旋。
• 第二型拓撲異構酶（topoisomerase II）：切開雙股 DNA，讓另一段雙股 DNA 通過，再重新接合；細菌的 DNA gyrase 即屬於第二型拓撲異構酶。

解題方法

判斷各選項所描述的功能，並將其與 DNA 複製所需的酵素分工對照：

1. 延長新生 DNA 鏈：由 DNA 聚合酶負責。
2. 重新形成鹼基對之間的氫鍵：不是拓撲異構酶的主要功能。
3. 解除複製叉前方因 DNA 解旋造成的扭轉張力：由拓撲異構酶負責。
4. 合成 RNA 引子：由引子酶（primase）負責。

因此，正確描述是「解除複製叉前方的 DNA 張力」。

選項分析

A) elongating new DNA at a replication fork by adding nucleotides to the existing chain

錯誤。此功能由 **DNA 聚合酶（DNA polymerase）**執行。DNA 聚合酶會依據模板股，將去氧核苷酸以共價鍵接到新生 DNA 鏈的 $3'$ 端，使 DNA 鏈沿著 $5' \to 3'$ 方向延長。

拓撲異構酶不負責辨識模板序列，也不負責添加核苷酸。

B) reattaching the hydrogen bonds between the base pairs in the double helix

錯誤。DNA 的鹼基配對主要依靠氫鍵，包括：

此題考查 DNA 和 RNA 的鹼基差異，特別是胸腺嘧啶 (Thymine, T) 和尿嘧啶 (Uracil, U) 的結構與功能。

a. What is a difference in structure between uracil and thymine?
尿嘧啶 (Uracil, U) 和胸腺嘧啶 (Thymine, T) 都是嘧啶鹼基，它們在結構上的主要差異在於：胸腺嘧啶在嘧啶環的第 5 個碳原子上帶有一個甲基 (-CH3)，而尿嘧啶則沒有。

具體來說：

• 尿嘧啶 (Uracil): 2,4-二氧代嘧啶 (pyrimidine-2,4-dione)。
• 胸腺嘧啶 (Thymine): 5-甲基-2,4-二氧代嘧啶 (5-methylpyrimidine-2,4-dione)。

這個結構上的微小差異（第 5 個碳上的甲基）對於 DNA 和 RNA 的穩定性及功能有重要影響。

【答案】胸腺嘧啶 (Thymine) 在其嘧啶環的第 5 個碳原子上帶有一個甲基 (-CH3)，而尿嘧啶 (Uracil) 在該位置則沒有甲基，只有一個氫原子。

b. Justify the biological reason for the presence of uracil in RNA but not in DNA.
DNA 中使用胸腺嘧啶 (T) 而非尿嘧啶 (U) 是為了提高 DNA 的穩定性並增強 DNA 損傷的檢測能力。

原因如下：

1. 胞嘧啶脫氨基 (Deamination of Cytosine) 的問題：
   胞嘧啶 (Cytosine, C) 在自然情況下會發生脫氨基反應，轉變成尿嘧啶 (Uracil, U)。
   如果 DNA 中含有尿嘧啶，那麼當胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶時，DNA 修復系統將難以區分這個「真正的」尿嘧啶（來自脫氨基的胞嘧啶）和 DNA 中原本就存在的尿嘧啶。這會導致修復系統無法準確地識別和移除錯誤的尿嘧啶，進而可能引起突變。

此題考查蛋白質結構的四級結構 (quaternary structure) 的定義。

蛋白質的結構可以分為四個層次：一級結構 (primary structure)、二級結構 (secondary structure)、三級結構 (tertiary structure) 和四級結構 (quaternary structure)。

• 一級結構：蛋白質中胺基酸的線性序列。
• 二級結構：蛋白質局部區域的規則性摺疊，如 $\alpha$-螺旋 (alpha-helix) 和 $\beta$-摺疊片 (beta-sheet)，由肽鍵之間的氫鍵維持。

核心觀念

本題考查減數分裂各階段的染色體與紡錘體變化。判斷重點如下：

• 前期 I（prophase I）：同源染色體配對形成四分體，可能發生互換，因此可見交叉現象。
• 中期 I（metaphase I）：同源染色體成對排列於赤道板。
• 後期 I（anaphase I）：同源染色體分離；但每條染色體仍由兩條姊妹染色分體組成。
• 前期 II（prophase II）：減數分裂第一次後形成兩個單倍體細胞，染色體仍為複製狀態。
• 中期 II（metaphase II）：染色體單獨排列於赤道板。
• 後期 II（anaphase II）：姊妹染色分體分離，成為獨立染色體。

解題方法

依序觀察圖中的三項特徵：

1. 是否有同源染色體配對或交叉互換。
2. 同源染色體是在赤道板排列，還是已向兩極分離。
3. 姊妹染色分體是否已分開。

圖中 D 顯示同源染色體配對並有交叉互換，符合前期 I。圖中 A 顯示姊妹染色分體向兩極分離，符合後期 II。

各圖的階段判定為：

此題考查轉錄調控 (transcriptional regulation) 的基本機制，特別是啟動子 (promoter) 的作用以及蛋白質與啟動子的交互作用。

轉錄是將 DNA 的遺傳信息轉錄成 RNA 的過程，這個過程受到嚴格的調控，以確保基因在適當的時間、地點和水平上表達。轉錄調控主要發生在轉錄起始階段，而啟動子是調控轉錄起始的關鍵 DNA 序列。

啟動子 (Promoter) 的作用：
啟動子是位於基因起始轉錄位點上游（通常是 5' 端）的一段 DNA 序列。它的主要功能是：

1. 識別和結合 RNA 聚合酶 (RNA polymerase)：啟動子中的特定序列（如 TATA box、-10 sequence、-35 sequence 等，在原核生物和真核生物中有所不同）能夠被 RNA 聚合酶或其輔助因子（如轉錄因子）識別並結合。
2. 確定轉錄起始位點和方向：RNA 聚合酶結合到啟動子後，能夠準確地識別並起始轉錄的位點，並確定轉錄的方向。
3. 影響轉錄效率：啟動子序列的結構和特性會影響 RNA 聚合酶結合的穩定性和轉錄起始的頻率，從而決定基因的表達水平。

蛋白質與啟動子的交互作用：
許多蛋白質，特別是轉錄因子 (transcription factors)，與啟動子區域發生交互作用，對轉錄進行精確調控。這些蛋白質可以分為兩大類：

1. 基礎轉錄因子 (Basal transcription factors)：
   這些因子是真核生物轉錄起始所必需的，它們與 RNA 聚合酶 II 一起組成基礎轉錄複合物 (basal transcription complex)。它們結合到啟動子上的特定位點（如 TATA box），幫助 RNA 聚合酶 II 正確結合並起始轉錄，但它們通常不能顯著增強或抑制轉錄。

2. 調節性轉錄因子 (Regulatory transcription factors)：
   這些因子是實現基因表達精確調控的關鍵。它們可以分為激活因子 (activators) 和阻遏因子 (repressors)。

   • 激活因子 (Activators)：這些蛋白質通常結合到啟動子區域的特定增強子 (enhancer) 或啟動子上的特定調控序列。它們通過以下機制激活轉錄：
     • 增強 RNA 聚合酶的結合或起始效率。

此題考查抗生素 (antibiotics) 如何抑制細菌的轉譯 (translation) 以及其對細菌細胞的特異性。

轉譯 (Translation) 的過程簡介：
轉譯是將 mRNA 的遺傳信息轉變成蛋白質的過程。這個過程主要在核糖體 (ribosome) 上進行，涉及 mRNA、tRNA、胺基酸以及一系列的輔助因子。核糖體由大亞基 (large subunit) 和小亞基 (small subunit) 組成，它讀取 mRNA 的密碼子，並引導 tRNA 將對應的胺基酸添加到生長中的多肽鏈上。

抗生素抑制轉譯的一般機制：
許多抗生素通過干擾轉譯過程的不同環節來抑制細菌的生長。這些機制可以概括為以下幾類：

1. 結合核糖體小亞基 (30S subunit)：

   • 氨基糖苷類 (Aminoglycosides)，如鏈黴素 (streptomycin)、慶大黴素 (gentamicin)：它們結合到核糖體 30S 小亞基的 16S rRNA 上。這種結合會干擾起始複合物的形成，導致 mRNA 讀碼錯誤 (misreading)，或加速終止密碼子的識別，從而抑制蛋白質合成。
   • 四環黴素類 (Tetracyclines)，如四環黴素 (tetracycline)：它們結合到 30S 小亞基，並阻止帶有胺基酸的 tRNA (aminoacyl-tRNA) 結合到 mRNA 的 A 位點 (aminoacyl site)，從而阻止肽鏈的延伸。

2. 結合核糖體大亞基 (50S subunit)：

   • 大環內酯類 (Macrolides)，如紅黴素 (erythromycin)：它們結合到 50S 大亞基的 23S rRNA 上，並阻礙肽醯轉移酶 (peptidyl transferase) 的活性，阻止胺基酸之間的肽鍵形成，或阻止正在延伸的肽鏈從 P 位點 (peptidyl site) 移到 E 位點 (exit site)，從而阻礙肽鏈的延伸。
   • 氯黴素 (Chloramphenicol)：它也結合到 50S 大亞基，並可逆轉地抑制肽醯轉移酶的活性，阻止肽鍵形成。
   • 林可黴素類 (Lincosamides)，如克林黴素 (clindamycin)：它們結合到 50S 大亞基，並與大環內酯類有相似的作用機制，干擾肽鏈延伸。
   • 噁唑烷酮類 (Oxazolidinones)，如利奈唑胺 (linezolid)：它們結合到 50S 大亞基的起始階段，阻止起始複合物的形成。

核心觀念

本題考查剪接體中 U1 snRNP 與 U6 snRNP 對 5′ splice site（5′剪接位點）序列特異性的辨識。

正常 5′ splice site 常見序列為：

其中：

• U1 snRNP 在剪接早期先與 5′ splice site 配對，負責辨識與定位。
• U6 snRNP 隨後取代 U1，與 5′ splice site 形成新的 RNA–RNA 配對，參與催化中心形成。
• U1 與 U6 對 5′ splice site 的最佳辨識序列不完全相同，因此單一鹼基改變可能使兩者的結合能力朝相反方向變化。

題目將序列由：

改為：

也就是第 4 個核苷酸由 A 改成 U。

解題方法

判斷方式是分別比較突變後序列與 U1、U6 的偏好序列：

1. 先看突變是否偏離 U1 偏好的 5′-GUAAGU-3′。
2. 再看突變後是否更符合 U6 偏好的 5′ splice site 辨識模式。
3. 在 in vitro protein–RNA binding assay 中，直接觀察 RNA 序列改變對各 snRNP 結合親和力的影響，不需考慮完整細胞內剪接步驟。

原始序列正是 U1 偏好的序列：

因此改成 5′-GUAUGU-3′ 後，U1 的鹼基配對與序列辨識將受到破壞，U1 結合能力下降。

相對地，5′-GUAUGU-3′ 更符合 U6 對 5′ splice site 的辨識與配對偏好。因此 U6 snRNP 對突變序列的結合能力上升。

U1 snRNP 的結合變化

U1 snRNP 原本偏好辨識：

突變後第 4 位由 A 改為 U：

這會降低 U1 snRNA 與 5′ splice site 之間的互補性與序列適配程度，因此：

此題考查分子生物學實驗設計，目標是鑑定一個原核生物阻遏蛋白 (repressor) 與其 DNA 結合位點（操作子, operator）的特異性區域。

實驗目標：
確定阻遏蛋白結合到 DNA 的精確序列或區域。

實驗原理：
阻遏蛋白與操作子之間的結合是特異性的，通常涉及蛋白質與 DNA 序列的物理接觸。我們可以利用這個結合的特異性來設計實驗。常用的方法包括：

1. DNA 腳印法 (DNA Footprinting)：這是鑑定蛋白質與 DNA 結合位點的經典方法。
2. 核酸酶保護分析 (Nuclease Protection Assay)：類似於 DNA 腳印法。
3. 質體結合實驗 (Plasmid Binding Assay) 或凝膠遷移實驗 (Gel Mobility Shift Assay, EMSA)：用於證明結合，但腳印法更適合定位。

這裡我們將設計一個基於 DNA 腳印法 的實驗，因為它能直接定位蛋白質結合的 DNA 區域。

實驗設計 (DNA Footprinting Assay)：

1. 材料準備：
a. 阻遏蛋白 (Repressor protein)：純化的目標阻遏蛋白。
b. DNA 模板：包含該操縱子的 DNA 片段。這個 DNA 片段應該足夠長，以覆蓋預期的操作子區域，並包含其上游和下游的序列。可以通過 PCR 擴增來獲得，或者從質體中酶切獲得。
c. 放射性標記的 DNA：為了能夠檢測結合位點，我們需要將 DNA 模板的一端或兩端用放射性同位素（如 $^{32}$P）進行標記。通常是標記一個 DNA 片段的 5' 端。
d. 核酸酶：如 DNase I。
e. 緩衝液：提供適宜的離子強度、pH 值和離子（如 $Mg^{2+}$）條件，模擬細胞內環境。
f. 阻遏蛋白結合的誘導物或阻遏物：如果阻遏蛋白的活性受小分子效應物（inducer 或 corepressor）影響，則需要準備這些分子，以確保阻遏蛋白處於能夠結合 DNA 的狀態（即處於「阻遏」狀態）。題目提到「under condition similar to those normally found for repression in the cell」，這意味著我們應該在阻遏蛋白能夠結合 DNA 的條件下進行實驗。

2. 實驗步驟：

a.  **DNA 標記**：
    *   選擇一段包含預期操作子的 DNA 片段。
    *   使用放射性同位素（如 $^{32}$P）對該 DNA 片段的一條鏈的 5' 端進行標記。可以通過 T4 DNA 多聚酶在填補鈍端或切口時進行標記，或者使用 T4 多核苷酸激酶 (polynucleotide kinase) 進行 5' 端磷酸化標記。

b.  **蛋白質-DNA 結合反應**：
    *   設置兩組反應管：
        *   **實驗組 (Repressor + DNA)**：在適當的緩衝液中，將標記的 DNA 與純化的阻遏蛋白混合。確保蛋白質與 DNA 的濃度比例能夠形成穩定的蛋白質-DNA 複合物，並模擬細胞內的濃度條件。如果需要，加入阻遏物。
        *   **對照組 (DNA only)**：在相同的緩衝液和條件下，僅將標記的 DNA 加入，不加阻遏蛋白。這用於檢測 DNA 在沒有蛋白質存在時的核酸酶切割模式。

c.  **部分核酸酶消化 (Partial DNase I Digestion)**：
    *   在實驗組和對照組的反應混合物中，加入極少量（過量會導致 DNA 完全降解）的 DNase I。
    *   反應時間要足夠短，以確保 DNA 被隨機切割，但不會被完全切碎。目標是讓平均每個 DNA 分子只被切一刀。
    *   反應結束後，立即加入 EDTA 等螯合劑終止反應。

d.  **蛋白質去除**：
    *   對實驗組的樣品，通過加入蛋白酶（如蛋白酶 K）並加熱來消化蛋白質，釋放出被蛋白質保護的 DNA 片段。

e.  **DNA 純化**：
    *   從所有反應管中純化 DNA 片段。

f.  **變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 (Denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)**：

此題考查 microRNA (miRNA) 和 small interfering RNA (siRNA) 的來源和生成途徑的差異。miRNA 和 siRNA 都是小分子 RNA，在基因沉默 (gene silencing) 中發揮重要作用，但它們的起源和生物合成途徑有所不同。

1. 來源 (Source):

• miRNA (microRNA)：

  • 內源性 (Endogenous)：miRNA 主要來源於細胞自身基因組中編碼的特定 RNA 基因。這些基因轉錄出來的初級轉錄本 (pri-miRNA) 經過一系列的加工修飾，最終形成成熟的 miRNA。
  • 來源基因：miRNA 的編碼基因可以位於蛋白質編碼基因的內含子或外顯子之間，也可以是獨立的基因。它們通常不直接編碼蛋白質，而是最終生成具有調控功能的 miRNA。

• siRNA (small interfering RNA)：

  • 外源性或內源性 (Exogenous or Endogenous)：siRNA 的來源相對更廣泛。
    • 外源性：最常見的是來自外源的雙鏈 RNA (dsRNA)，例如病毒 RNA 基因組、轉錄的 dsRNA 載體，或實驗上引入的 dsRNA。
    • 內源性：在某些生物體中，也可以由內源性的重複序列 (transposable elements)、重複基因的轉錄本，或通過 RNA 聚合酶 II 或 III 轉錄產生的長鏈 dsRNA 生成 siRNA。
  • 雙鏈 RNA (dsRNA)：siRNA 的直接前體是長鏈的雙鏈 RNA。

2. 生成途徑 (Generation Pathway):

• miRNA 的生成途徑 (miRNA Biogenesis)：

  1. 轉錄 (Transcription)：miRNA 基因在細胞核內由 RNA 聚合酶 II 或 III 轉錄，產生一個稱為 pri-miRNA 的長鏈單鏈 RNA 前體。pri-miRNA 通常包含一個髮夾狀 (hairpin-like) 的二級結構。
  2. 初級加工 (Nuclear Processing)：在細胞核內，一個稱為 Drosha 的酶（一種 RNase III 型核酸酶）與 DGCR8 (Pasha) 蛋白質複合物一起，識別 pri-miRNA 的髮夾結構，並將其剪切成一個較短的、約 70-100 個核苷酸的 RNA 分子，稱為 pre-miRNA。pre-miRNA 仍然包含一個髮夾結構。
  3. 輸出到細胞質 (Export to Cytoplasm)：pre-miRNA 被 Exportin-5 運輸到細胞質中。
  4. 次級加工 (Cytoplasmic Processing)：在細胞質中，另一個 RNase III 型核酸酶，稱為 Dicer，識別 pre-miRNA 的髮夾結構，並將其剪切成一個約 20-25 個核苷酸的雙鏈 RNA 分子，稱為 miRNA/miRNA 雙鏈*。
  5. 成熟與載體蛋白結合 (Maturation and RISC Loading)：miRNA/miRNA* 雙鏈中的一條鏈（通常是 miRNA）被整合到一個稱為 RNA 誘導的沉默複合物 (RNA-induced silencing complex, RISC) 的蛋白質複合物中，由 Argonaute (Ago) 蛋白作為核心。另一條鏈（miRNA*）通常被降解。
  6. 基因沉默 (Gene Silencing)：成熟的 miRNA-RISC 複合物通過與靶標 mRNA 的鹼基配對，介導基因沉默，通常是通過抑制翻譯或誘導 mRNA 的降解。

• siRNA 的生成途徑 (siRNA Biogenesis)：

  1. 雙鏈 RNA (dsRNA) 的產生：siRNA 的直接前體是長鏈的雙鏈 RNA (dsRNA)。這段 dsRNA 可以是外源性的（如病毒感染）或內源性的（如重複序列轉錄）。
  2. Dicer 酶的加工 (Dicer Processing)：在細胞質中，Dicer 酶（同樣是 RNase III 型核酸酶）識別並將長鏈 dsRNA 剪切成約 20-25 個核苷酸的短雙鏈 RNA 分子，即 siRNA。這個過程與 miRNA 生成中的 Dicer 步驟相似，但前體不同。