112 年 國立成功大學生命科學研究所乙組《分子生物學》

本題主要在測試學生對分子生物學基本概念的理解。

a. 細胞週期檢查點 (Cell cycle checkpoints)：細胞週期是細胞從一次分裂到下一次分裂的完整過程，主要包含 G1 期、S 期、G2 期和 M 期。檢查點是細胞週期中的關鍵調控點，負責監測細胞是否準備好進入下一個階段，並在發現問題時啟動修復機制或誘導細胞凋亡，以確保遺傳物質的準確傳遞。主要的檢查點包括 G1 檢查點（決定是否進入 S 期）、G2 檢查點（檢查 DNA 複製是否完成且無損壞）和 M 檢查點（紡錘體組裝檢查點，確保染色體正確附著到紡錘體上）。

b. 半保留複製模型 (Semiconservative model of DNA replication)：此模型描述 DNA 複製的過程。每當 DNA 複製時，雙股螺旋會解開，每一股皆作為模板，合成一條新的互補股。因此，複製完成後的兩個子代 DNA 分子，每個都包含一條來自母代 DNA 的股，以及一條新合成的股。這個模型已由 Meselson-Stahl 實驗證實。

本題主要測試基因連鎖與重組、以及遺傳圖譜構建的概念。

a. 基因圖譜單位 (Map units) 的計算

首先，我們需要確定各表現型的基因型。題目說明 F₁ 代的表現型為紅果、黃花，且 F₁ 測試交配 (testcross) 的對象是「純合隱性個體」。這表示測試交配的親本基因型是隱性純合。假設控制果實顏色 (紅 vs. 金) 的基因是 A/a，控制花色 (黃 vs. 白) 的基因是 B/b。因為 F₁ 代的表現型是紅果、黃花，且測試交配的對象是隱性純合，所以 F₁ 的基因型可以推斷為 AaBb。測試交配的對象則是aabb (金果、白花)。

F₁ (AaBb) x aabb 的後代表現型及其對應基因型：

• 紅果、黃花：最可能為 AB/ab 或 Ab/aB 組合。
• 紅果、白花：最可能為 Ab/ab。
• 金果、黃花：最可能為 aB/ab。
• 金果、白花：最可能為 ab/ab。

根據 F₁ 的表現型 (紅果、黃花) 和測試交配的結果：

• 紅果、黃花 (51)：這是親本型 (parental phenotype)。
• 紅果、白花 (14)：這是重組型 (recombinant phenotype)。
• 金果、黃花 (10)：這是重組型 (recombinant phenotype)。
• 金果、白花 (45)：這是親本型 (parental phenotype)。

從親本型 (紅果黃花, 金果白花) 的數量 (51+45=96) 遠高於重組型 (紅果白花, 金果黃花) 的數量 (14+10=24)，可以判斷控制果色和花色的這兩個基因是連鎖的。

題目給的 F₁ 表現型是紅果、黃花。測試交配對象是金果、白花 (aabb)。
親本型後代表現為紅果黃花 (與 F₁ 相同) 和金果白花 (與測試交配親本相同)。
重組型後代表現為紅果白花 (與 F₁ 不同，花色改變) 和金果黃花 (與 F₁ 不同，果色改變)。

因此，F₁ 的基因型中，連鎖的組合應該是 AB 和 ab。
F₁ 基因型：$\frac{AB}{ab}$
測試交配：$\frac{AB}{ab} \times \frac{ab}{ab}$

本題考查真核生物 DNA 的包裝結構，要求解釋染色體、染色質、核小體和組蛋白之間的關係。

真核生物的 DNA 是一個非常長的雙股螺旋分子，為了能容納在細胞核內，它必須進行高度的壓縮和包裝。這個包裝過程涉及多層次的結構。

• DNA 分子 (DNA molecule)：這是最基本的單位，由雙股螺旋結構組成。
• 核小體 (Nucleosome)：這是 DNA 包裝的第一級結構。DNA 分子會纏繞在稱為組蛋白 (histone) 的蛋白質核心周圍。一個核小體由大約 147 個鹼基對的 DNA 纏繞在八個組蛋白分子（兩個 H2A、兩個 H2B、兩個 H3、兩個 H4）組成的核心上形成。這個結構看起來像串在 DNA 上的珠子，纏繞的 DNA 和組蛋白核心共同構成了核小體。
• 染色質 (Chromatin)：核小體通過連接 DNA (linker DNA) 和另一個組蛋白 (H1) 連結起來，形成更緊密的結構，稱為 30 奈米染色質纖維。

本題考查如何利用 PCR 和限制酶來區分野生型和突變型的 DNA 序列差異，特別是單一鹼基的替換。

a. 區分野生型與突變型 A

題目指出突變 A 是單一鹼基交換 (C 變為 T)。我們需要觀察給定的序列，找到這個變化的位置。
觀察野生型序列：
5′- GATATC TGGATCAGAACAAAGCTTTACTTGCTTAGCATATGTCGACGGAA CCTTTT ··· 3′
↓
觀察突變型 A 序列：
5′- GATATC TGGATCAGAACAAAGCTTTACTTGCTTAGCATATGTCGACGGAA CCTTTT ··· 3′

仔細比對兩段序列，發現兩者完全相同。這與題目描述的「突變 A 是單一鹼基交換 (C 變為 T)」不符。如果題目給的序列圖示是正確的，那麼這個突變點並未顯示出來，或者這個突變點不在給定的短序列範圍內。

假設題目給的序列圖示有誤，並根據「單一鹼基交換 (C to T)」進行推論。

我們需要尋找一個方法，利用 PCR 和限制酶來檢測這個單一鹼基的改變。關鍵在於找到一個限制酶，它能夠識別野生型或突變型序列中的特定位點，並且該位點的識別序列恰好包含這個發生變化的鹼基。

步驟：

1. 設計 PCR 引子 (Primer Design)：設計一對 PCR 引子，其擴增區域必須包含預期發生突變的鹼基位點。引子設計的目標是使 PCR 能夠有效地擴增出包含此位點的 DNA 片段。
2. 進行 PCR 擴增 (PCR Amplification)：使用野生型和突變型 A 的 DNA 作為模板，分別進行 PCR 擴增，得到包含目標位點的 DNA 片段。
3. 限制酶消化 (Restriction Enzyme Digestion)：
   • 尋找合適的限制酶：關鍵在於找到一個限制酶，其識別序列恰好包含突變點，並且這個突變點的改變會影響限制酶的切割。
   • 情況一：突變點改變了限制酶的識別位點。例如，野生型序列包含限制酶 X 的識別序列，而突變 A 的序列中，由於 C 變為 T，破壞了識別序列，導致限制酶 X 無法切割。反之，也可能野生型不被切割，而突變型由於 C 變為 T 產生了新的切割位點。
   • 情況二：突變點不直接影響識別位點，但改變了切割後產生的片段大小。這種情況較少見，通常是影響了識別位點。

具體操作與預期結果 (假設突變點恰好影響一個限制酶的切割)：

• 尋找限制酶：假設我們找到一個限制酶，它識別序列 GATC，並且在野生型序列中，這個位點是 GATC (假設 C 在此位點)。而突變 A 中，這個 C 變成了 T，使得識別序列變成了 GATT，這個序列不再是酶的識別位點。
  • 在給定的序列中，GATC 出現在開頭。如果這個 C 是突變點，那麼野生型和突變型 A 的序列應該是不同的。
  • 假設：野生型序列中，在某個位置有一個 C，被某個限制酶識別。突變 A 中，這個 C 變成了 T。
  • 例如：假設有一個限制酶，它識別序列 GATC。野生型序列中，某個 GATC 位點被正確切割。而突變 A 中，這個 C 變成了 T，變成了 GATT，這個位點就不再被該酶切割。
  • 如果突變位點是序列中的 GATC 中的 C：
    • 野生型：5′- GATATC... (假設這個 C 是突變點)
    • 突變 A：5′- GATATC... (假設這個 C 變成了 T)
    • 如果酶識別 GATC，而突變是 C->T，那麼野生型是 GATC，突變型是 GATT。
    • 野生型 DNA 經過 PCR 擴增後，再用識別 GATC 的酶消化，會在該位點被切開。
    • 突變型 A DNA 經過 PCR 擴增後，由於 GATT 不被識別，就不會在該位點被切開。
    • 通過瓊脂糖凝膠電泳，可以觀察到野生型 DNA 被酶切後產生較小的片段，而突變型 A DNA 則保持較大的片段（或未被切割的條帶）。

本題考查剪接體 (spliceosome) 中 U1 和 U6 snRNP 的功能，以及 5' 剪接位點序列突變對其結合的影響。

核心觀念：真核生物 mRNA 前驅體 (pre-mRNA) 的剪接是通過一個複雜的蛋白質-RNA 複合體——剪接體來完成的。剪接體由多個小核核糖核蛋白 (snRNPs) 構成，其中 U1 snRNP 和 U6 snRNP 在識別剪接位點方面起著關鍵作用。5' 剪接位點 (5' splice site) 是剪接體識別並切割內含子 (intron) 的起始點，通常具有保守的序列 GUAAGU。

U1 snRNP 的功能：U1 snRNP 包含一個 RNA 分子 (U1 snRNA)，其序列與 5' 剪接位點的保守序列 (GUAAGU) 具有互補性。在剪接的起始階段，U1 snRNP 通過其 U1 snRNA 與 pre-mRNA 的 5' 剪接位點序列進行鹼基配對，從而將剪接體招募到該位點。

U6 snRNP 的功能：U6 snRNP 也是剪接體的重要組成部分，它在剪接過程中發揮催化活性，並與 5' 剪接位點和分支點 (branch point) 相互作用。U6 snRNP 的 RNA 部分也能與 5' 剪接位點區域有一定程度的相互作用，儘管 U1 的作用更為直接和關鍵。

序列變化：

• 野生型 5' 剪接位點：5′-GUAAGU-3′
• 突變型 5' 剪接位點：5′-GUAUGU-3′

分析突變的影響：

1. 對 U1 snRNP 結合的影響：

   • U1 snRNA 的序列通常是 5'-UAUCAGUAGAGU-3' 左右，其中 5' 端的一部分序列（約 6-8 個核苷酸）可以與 5' 剪接位點進行鹼基配對。

   • 野生型 5' 剪接位點 (GUAAGU) 與 U1 snRNA 的互補區域（例如 5'-UACUACU-3'）可以形成穩定的配對：
     5′- GUAAGU-3′ (pre-mRNA)
     3′- AUACAA-5′ (U1 snRNA)
     (這裡假設 U1 snRNA 的配對區域是 3'-AUACAA-5'，這是一個簡化的例子，實際配對區域可能更長且複雜)

   • 突變型 5' 剪接位點 (GUAUGU) 與 U1 snRNA 的配對能力會減弱：
     5′- GUAUGU-3′ (pre-mRNA)
     3′- AUACAA-5′ (U1 snRNA)
     在 GUAUGU 中，第二個 A 被 U 取代，第三個 A 被 U 取代。如果 U1 snRNA 的配對序列是 3'-AUACAA-5'，那麼 GUAUGU 與 U1 snRNA 的配對會變成：
     5′- GUAUGU-3′ (pre-mRNA)
     3′- AUACAA-5′ (U1 snRNA)
     配對： G-U, U-A, A-C (不配對), U-A, G-A (不配對), U-A (不配對)
     可以看到，突變導致了幾個鹼基對的改變，特別是 A-C 和 G-A 的配對變成了 U-A 和 U-A 的配對，或者 A-C 的配對變成了 A-A 的配對。
     *更精確的說，U1 snRNP 的 5' 端與 5' 剪接位點的配對通常是幾個鹼基的互補。野生型的 GUAAGU，如果 U1 snRNA 的配對序列是 3'-CAUUCU-5' (這是另一種可能的配對區域)，那麼它與 GUAAGU 的配對是：
     5'-GUAAGU-3'
     3'-CAUUCU-5'
     G-C, U-A, A-U, A-U, G-C, U-U
     這個配對看起來並不理想。
     *更常見的 U1 snRNA 配對區域是與 5' 剪接位點的最後幾個鹼基（AG）以及之前的幾個鹼基互補。例如，U1 snRNA 的 5' 端序列 AG/GT (在 5' 剪接位點的下游) 和 GUA (在 5' 剪接位點的上游)。
     *讓我們以保守序列 GUAAGU 為例，U1 snRNA 的 6-8 個核苷酸與之配對。假設 U1 snRNA 的配對序列是 3'-UACUAC-5'。
     野生型：5'-GUAAGU-3'
     U1 snRNA: 3'-UACUAC-5'
     配對：G-C, U-A, A-U, A-C(不配), G-U, U-C(不配)
     這個配對也不理想。

     • 標準的 5' 剪接位點識別：U1 snRNP 通過其 U1 snRNA 的 5' 末端（約 6-8 個核苷酸）與 pre-mRNA 的 5' 剪接位點進行鹼基配對。這個配對區域通常是與 5' 剪接位點序列最後的 AG 互補，以及前面的幾個鹼基互補。
     • 對於 5'-GUAAGU-3'，U1 snRNA 的配對序列（例如 3'-CAUUCU-5'）可以與 GUAAGU 的末端 AG 進行配對，以及前面的 GU 進行配對。
     • 對於 5'-GUAUGU-3'，突變的 A 變為 U，以及前面的 A 變為 U。
     • 更關鍵的是，U1 snRNA 的序列通常與 5' 剪接位點的保守序列 GUAAGU 的最後幾個鹼基（AG）以及之前的幾個鹼基（UA）進行配對。
     • 讓我們假設 U1 snRNA 的互補序列是 UACUAC。
       • 野生型 5'-GUAAGU-3'：與 3'-UACUAC-5' 的配對是 G-C, U-A, A-U, A-C(錯), G-U, U-C(錯)。

本題考查原核生物 mRNA 與真核生物 mRNA 的結構和功能的異同。

核心觀念：mRNA (messenger RNA) 是將 DNA 的遺傳信息轉錄為蛋白質序列的信使分子。原核生物和真核生物在細胞結構、基因結構和表達調控方面存在顯著差異，這也反映在它們的 mRNA 分子上。

比較 (Compare) - 相同點：

1. 基本功能：兩者的基本功能都是作為模板，指導核糖體進行蛋白質合成。
2. 三聯體密碼子 (Codon)：mRNA 的序列由三聯體密碼子組成，每個密碼子對應一個特定的氨基酸（或終止信號）。
3. 轉錄與翻譯的耦合 (Coupling of transcription and translation)：在原核生物中，轉錄和翻譯是緊密偶聯的，即 mRNA 一旦合成出來，核糖體就可以立即在其上進行翻譯。在真核生物中，由於細胞核的存在，轉錄和翻譯是分離的，但 mRNA 在細胞質中被翻譯。
4. 核糖體結合位點 (Ribosome Binding Site)：兩者都含有核糖體結合位點，用於招募核糖體開始翻譯。在原核生物中，這是 Shine-Dalgarno 序列；在真核生物中，這是 5' 端帽結構。

對比 (Contrast) - 不同點：

特徵	原核生物 mRNA (Prokaryotic mRNA)	真核生物 mRNA (Eukaryotic mRNA)
基因結構	單順操子 (Monocistronic) 或多順操子 (Polycistronic)；基因通常沒有內含子。	單順操子 (Monocistronic)；基因包含外顯子 (exons) 和內含子 (introns)。
轉錄後修飾	極少或無。mRNA 分子在轉錄完成後幾乎立即可用於翻譯。	大量修飾：<br>1. 5' 端加帽 (5' capping)：添加一個特殊的 7-甲基鳥苷酸 (m⁷GTP)。

本題考查基因表達調控的層級，以及為何轉錄起始是最常見的調控層級。

核心觀念：基因表達是指細胞通過基因中的遺傳信息合成功能性產物（通常是蛋白質，但也包括 RNA）的過程。這個過程受到嚴格的調控，以確保細胞在適當的時間、適當的地點產生適當量的功能分子。基因表達的調控可以發生在多個層級，從 DNA 到最終產物。

基因表達調控的可能層級：

1. 基因組層級：DNA 的結構改變（如染色質重塑、DNA 甲基化）。
2. 轉錄層級：
   • 轉錄起始 (Transcription initiation)：啟動子、增強子、沉默子的作用，轉錄因子的結合。
   • 轉錄延長 (Transcription elongation)：RNA 聚合酶的移動。
   • 轉錄終止 (Transcription termination)。
3. 轉錄後修飾層級：mRNA 的加工（加帽、剪接、加尾）、mRNA 的穩定性、mRNA 的運輸。
4. 翻譯層級：核糖體結合、起始、延長、終止。
5. 翻譯後修飾層級：蛋白質的摺疊、修飾（如磷酸化、糖基化）、降解。

為何轉錄起始是最常見的調控層級？

轉錄起始之所以是最常見和最有效的基因表達調控層級，主要有以下幾個原因：

1. 能量效率 (Energy Efficiency)：
   • 一旦轉錄開始，並且 RNA 聚合酶開始合成 mRNA，就已經消耗了大量的能量和資源（如核苷酸三磷酸 ATP, UTP, CTP, GTP）。
   • 如果在轉錄起始階段就能有效阻止轉錄，就可以避免浪費這些資源來合成不需要的 mRNA 分子。
   • 相比之下，如果在轉錄後期或翻譯階段才進行調控，那麼已經合成的 mRNA 或蛋白質就可能被浪費，效率較低。

本題考查真核生物中小 RNA (short RNAs) 在基因沉默中的機制，包括 siRNA、miRNA 和 piRNA。

核心觀念：小 RNA 是長度約 20-30 個核苷酸的非編碼 RNA 分子，它們在基因表達調控中扮演重要角色，特別是通過 RNA 干涉 (RNA interference, RNAi) 或類似機制來抑制基因表達，這種現象稱為基因沉默 (gene silencing)。 siRNA、miRNA 和 piRNA 是主要的幾類小 RNA。

三種小 RNA 及其機制：

1. 小干擾 RNA (siRNA, small interfering RNA)

   • 來源：通常來自外源雙鏈 RNA (dsRNA)，例如病毒感染或實驗引入的 dsRNA。在某些情況下，也可以來自內源性的基因，但其啟動途徑與 miRNA 不同。
   • 產生過程：外源 dsRNA 被 Dicer 酶切割成約 21-23 nt 的 siRNA。siRNA 與 RISC (RNA-induced silencing complex) 中的 Argonaute (Ago) 蛋白結合。
   • 機制：
     • mRNA 降解 (mRNA degradation)：siRNA 的一個股（導向股，guide strand）與細胞內 mRNA 上的同源序列進行精確的鹼基配對。RISC 複合體中的 Argonaute 蛋白（通常是 Ago2）具有核酸酶活性，能夠切割與 siRNA 配對的 mRNA，導致其降解。
     • 染色質沉默 (Chromatin silencing)：在某些生物中（如植物、酵母），siRNA 也可以引導 RISC 複合體作用於細胞核內的 DNA 或組蛋白，通過 DNA 甲基化、組蛋白修飾等方式，關閉相應基因的轉錄，這是一種表觀遺傳學的調控。
   • 特點：通常用於抵抗病毒和轉座子，以及在實驗室中進行基因功能研究。其配對通常是精確的。

2. 微小 RNA (miRNA, microRNA)

   • 來源：來自內源性的基因，編碼形成稱為 pri-miRNA 的長鏈 RNA。
   • 產生過程：
     • pri-miRNA 在細胞核中被 Drosha 酶切割成約 70 nt 的 pre-miRNA。
     • pre-miRNA 隨後被運輸到細胞質，在那裡被 Dicer 酶切割成約 21-23 nt 的雙鏈 miRNA。
     • miRNA 的一個股（導向股）與 RISC 複合體結合。
   • 機制：

本題考查原核生物（細菌）的轉錄終止機制。

核心觀念：轉錄終止是 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 在識別到特定的終止信號後，從 DNA 模板上脫離，釋放新合成的 RNA 分子，並與 DNA 模板分離的過程。細菌的轉錄終止主要有兩種機制：ρ (rho) 因子依賴性終止和 ρ 因子非依賴性（或稱內源性）終止。

1. ρ 因子非依賴性 (Rho-independent) 轉錄終止

這種機制也稱為內源性終止 (intrinsic termination)，是細菌中最常見的終止機制。它依賴於 DNA 模板序列本身，不需要額外的蛋白質因子。此機制涉及兩個關鍵的結構特徵：

• 富含 GC 的髮夾環結構 (GC-rich hairpin loop)：在轉錄產生的 RNA 分子上，緊鄰終止信號下游的位置，會形成一個穩定的髮夾環結構。這個髮夾環是由 RNA 分子內部的鹼基互補配對形成的，其結構通常富含 GC 鹼基對，因此非常穩定。
• 緊鄰髮夾環的寡聚尿嘧啶序列 (Uracil-rich sequence)：在 RNA 分子中，髮夾環結構的下游緊接著一串寡聚尿嘧啶 (poly-U) 序列（例如 UUUUUU）。

機制步驟：

1. RNA 聚合酶轉錄：RNA 聚合酶沿著 DNA 模板進行轉錄。
2. 髮夾環形成：當 RNA 聚合酶轉錄到包含富含 GC 區域的序列時，RNA 分子會在其自身內部形成一個穩定的髮夾環結構。
3. RNA-DNA 雜交鏈不穩定：髮夾環結構的形成會導致 RNA 聚合酶的移動受阻。同時，在髮夾環下游的寡聚尿嘧啶序列與 DNA 模板上的寡聚腺嘌呤 (poly-A) 序列形成的 RNA-DNA 雜交鏈非常不穩定。這是因為 U-A 鹼基對只有兩個氫鍵，而 G-C 鹼基對有三個氫鍵，使得 U-A 雜交鏈的結合力較弱。
4. RNA 釋放：不穩定的 U-A 雜交鏈無法將 RNA 分子牢固地固定在 DNA 模板上。當 RNA 聚合酶遇到這個不穩定的區域時，髮夾環結構的空間位阻也會影響 RNA 聚合酶的活性。最終，RNA 聚合酶會從 DNA 模板上脫離，釋放新合成的 RNA 分子。

2. ρ 因子依賴性 (Rho-dependent) 轉錄終止