112 年 國立成功大學生物科技與產業科學系碩士班《生物化學（含生物技術）》

本題主要在考察 B-DNA 和 A-DNA 的結構差異。這兩種 DNA 構型在螺旋方向、每圈的鹼基對數、鹼基對的傾斜角度以及溝的寬度等方面存在顯著差異。

A) B-DNA 是右旋螺旋，A-DNA 也是右旋螺旋。此選項錯誤。
B) B-DNA 每圈約有 10.5 個鹼基對，A-DNA 每圈約有 11 個鹼基對。題目中 A-DNA 9 個鹼基對的說法不正確。

核心觀念

本題考查以 mRNA 製備互補 DNA（complementary DNA, cDNA）並進行基因選殖的基本流程。由於成熟 mRNA 已經過 RNA 剪接，通常不含 intron，因此以 mRNA 製成的 cDNA 可代表真核生物基因的 coding sequence。

流程涉及三種酵素作用：

• Reverse transcriptase（逆轉錄酶）：以 mRNA 為模板合成第一股 cDNA，形成 RNA–DNA hybrid。
• Nuclease，主要指 RNase H 類活性：切除或切割 RNA–DNA hybrid 中的 RNA 股，留下 RNA 片段。
• DNA polymerase（DNA 聚合酶）：利用殘留的 RNA 片段作為 primers，合成第二股 DNA。
• 最後以 restriction endonuclease（限制酶） 產生適合接合的末端，再與載體進行 annealing 和 ligation。

解題方法

依照分子生物學上的先後關係排列：

1. 先取得 mRNA 並進行逆轉錄
   mRNA 被分離後，逆轉錄酶以 mRNA 為模板合成第一股 cDNA，形成 RNA–DNA hybrid，因此先是步驟 2。

2. 完成第一股 cDNA
   逆轉錄酶沿著 mRNA 模板延伸，直到抵達 mRNA 的 $5'$ 端，完成單股 cDNA，為步驟 4。

3. 切割 RNA 模板
   RNA–DNA hybrid 經 nuclease 處理，RNA 股被切成多個 RNA fragments，為步驟 3。

4. 合成第二股 cDNA
   這些 RNA fragments 可作為 primers，DNA polymerase 以第一股 cDNA 為模板合成第二股 DNA，為步驟 5。

本題考查蛋白質結構中特定胺基酸對二級結構的影響，特別是「螺旋破壞者」(helix-breaker)。

α-螺旋 (α-helix) 是一種常見的蛋白質二級結構，其形成與維持依賴於肽鏈的規律性捲曲，其中胺基酸側鏈的空間位阻和電子效應會影響其形成。某些胺基酸由於其特殊的側鏈結構，難以或不適合進入 α-螺旋結構，反而常出現在 β-轉角 (β-turn) 等結構中，因其能夠彎曲肽鏈，故被稱為「螺旋破壞者」。

• 脯胺酸 (Proline, Pro)：脯胺酸的側鏈是一個環，與 α-碳原子和胺基氮原子形成一個剛性的環。

核心觀念

本題考查基因突變的分類與其對蛋白質產物的影響，必須區分：

• Silent mutation（沉默突變）：編碼區的鹼基改變，但因遺傳密碼簡併性，所編碼的胺基酸不變。
• Missense mutation（錯義突變）：單一鹼基替換，使一個胺基酸被另一個胺基酸取代。
• Nonsense mutation（無義突變）：單一鹼基替換形成終止密碼子，使蛋白質提早終止。
• Frameshift mutation（移碼突變）：插入或刪除的鹼基數不是 3 的倍數，造成下游閱讀框改變。
• Permissive mutation（允許性突變）：通常指能提高蛋白質穩定性，使蛋白質容許其他原本不利的突變發生，因而維持蛋白質功能。

解題方法

逐一比對各選項的「突變類型」與「實際分子結果」：

1. 看突變位置是否符合該術語的定義。
2. 看鹼基替換、插入或刪除對密碼子與閱讀框的影響。
3. 特別注意 missense、nonsense 與 frameshift 的結果不可混淆。
4. 判斷 permissive mutation 是否與蛋白質熱力學穩定性增加有關。

選項分析

A) silent: change of a single base in the non-coding intron region of a gene

錯誤。

Silent mutation 通常是發生在蛋白質編碼區的鹼基替換，雖然密碼子改變，但所對應的胺基酸不變，例如：

$$\text{GAA} \rightarrow \text{GAG}$$

兩者皆編碼麩胺酸（Glu）。

內含子屬於非編碼區，該處的單一鹼基變化應稱為 intronic mutation。若突變影響剪接訊號，甚至可能造成異常剪接，不能直接稱為 silent mutation。

B) missense: substitution of a single base results in a premature stop codon

錯誤。

單一鹼基替換若形成提前出現的終止密碼子，屬於 nonsense mutation，不是 missense mutation。

例如：

$$\text{UAU} \rightarrow \text{UAA}$$

原本的 UAU 編碼酪胺酸，UAA 則是終止密碼子，會使蛋白質提早終止。

Missense mutation 的特徵是：

$$\text{一個胺基酸} \rightarrow \text{另一個胺基酸}$$

本題考查蛋白質糖基化 (glycosylation) 的位點，特別是 N-linked 糖基化和 O-linked 糖基化。

• N-linked 糖基化 (N-linked glycosylation)：這種糖基化發生在天冬醯胺 (Asparagine, Asn) 的醯胺基氮原子上。通常，N-linked 糖基化發生在序列 Asn-X-Ser 或 Asn-X-Thr 中，其中 X 是任何胺基酸，但 P (脯胺酸) 通常除外。
• O-linked 糖基化 (O-linked glycosylation)：這種糖基化發生在絲胺酸 (Serine, Ser) 或蘇胺酸 (Threonine, Thr) 的羥基氧原子上。有時也會發生在酪胺酸 (Tyrosine, Tyr) 或羥離胺酸 (Hydroxylysine) 上，但在常見的定義中，Ser 和 Thr 是主要的位點。

本題考查脂肪酸的命名和分類。

脂肪酸的命名法 18:2c49,12 表示：

• 18：表示脂肪酸含有 18 個碳原子。
• 2：表示該脂肪酸含有 2 個雙鍵。
• c49,12：表示雙鍵的位置。'c' 表示順式 (cis) 構型，雙鍵分別位於第 9 和第 12 個碳原子之間（從羧基端開始計數）。

根據雙鍵的數量，脂肪酸可以分類：

• 飽和脂肪酸 (saturated fatty acid)：分子中不含雙鍵。
• 不飽和脂肪酸 (unsaturated fatty acid)：分子中含一個或多個雙鍵。
  • 單元不飽和脂肪酸 (monounsaturated fatty acid)：含一個雙鍵。

核心觀念

本題考查細胞膜物質運輸的分類與定義，判斷重點包括：

• 是否需要膜蛋白
• 是否順著或逆著濃度梯度／電化學梯度
• 是否直接消耗 ATP
• 運輸的物質是否適合直接穿過脂雙層

物質運輸主要分為以下幾類：

1. 簡單擴散（simple diffusion）
   小型、非極性或脂溶性分子直接穿過脂雙層，順著濃度梯度移動，不需膜蛋白，也不消耗 ATP。

2. 促進性擴散（facilitated diffusion）
   物質透過離子通道或載體蛋白，順著濃度梯度或電化學梯度移動，不消耗 ATP。

3. 初級主動運輸（primary active transport）
   直接利用 ATP 水解所釋放的能量，將物質逆著濃度梯度或電化學梯度運輸。

4. 次級主動運輸（secondary active transport）
   不直接水解 ATP，而是利用另一種離子順著其電化學梯度移動時釋放的能量，帶動另一物質逆梯度運輸。

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解題方法

逐一比對各選項中的三個關鍵描述：

1. 運輸是否需要膜蛋白？
2. 物質移動方向是順梯度還是逆梯度？
3. 能量來源是否為 ATP 直接水解？

其中最容易判斷的方法是先找「ATP hydrolysis」：

• 直接使用 ATP 水解能量：屬於初級主動運輸。
• 利用離子梯度，不直接使用 ATP：屬於次級主動運輸。
• 順著梯度且不耗能：屬於被動運輸，包括簡單擴散與促進性擴散。

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選項分析

A) simple diffusion: uses concentration gradient to move highly polar molecules and ions across membranes

錯誤。

簡單擴散確實是利用濃度梯度，使物質由高濃度處移向低濃度處；但高度極性的分子與離子通常無法直接穿過疏水性的脂雙層核心。

簡單擴散適合運輸：

• 氧氣、二氧化碳等小型非極性分子
• 類固醇等脂溶性分子
• 少量水分子

離子與高度極性分子通常需要通道蛋白或載體蛋白協助，因此 A 對簡單擴散的物質描述錯誤。

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B) facilitated diffusion: uses proteins such as ion channels to move substances against their concentration gradient across a membrane

錯誤。

促進性擴散確實會利用離子通道或載體蛋白，但其運輸方向是順著濃度梯度或電化學梯度，而非逆著梯度。

促進性擴散的特色為：

• 需要膜蛋白
• 不直接消耗 ATP
• 物質由高濃度移向低濃度
• 離子移動時須考慮電位差，因此是順著電化學梯度

「against their concentration gradient」是主動運輸的特徵，因此 B 錯誤。

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本題考查細胞內生化反應的細胞器定位。

• A) fatty acid oxidation (脂肪酸氧化)：主要發生在粒線體 (mitochondria) 中，通過 β-氧化途徑將脂肪酸分解產生乙醯輔酶A (acetyl-CoA)，然後進入檸檬酸循環。在過氧化體 (peroxisomes) 中也發生部分脂肪酸氧化，特別是長鏈脂肪酸。內質網 (endoplasmic reticulum) 主要參與脂質合成和蛋白質修飾。此選項錯誤。
• B) RNA synthesis (RNA 合成)：在真核細胞中，RNA 的合成（轉錄）主要發生在細胞核 (nucleus) 中，由 RNA 聚合酶催化。

本題考查糖解作用 (glycolysis) 中可逆反應的識別。糖解作用是一個複雜的代謝途徑，其中一些反應是高度放能的、不可逆的，這些反應通常是代謝調控的關鍵點。其他反應則相對接近平衡狀態，是可逆的。

糖解作用的關鍵不可逆反應由以下三個酶催化：

1. 己醣激酶 (Hexokinase)：催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸。
2. 磷酸果糖激酶 (Phosphofructokinase, PFK)：催化果糖-6-磷酸磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸。這是糖解作用的限速酶和關鍵調控點。
3. 丙酮酸激酶 (Pyruvate kinase)：催化磷酸烯醇丙酮酸 (PEP) 轉化為丙酮酸，同時生成 ATP。

核心觀念

本題考查「氧化還原酵素的分類」以及丙酮酸經由氧化脫羧作用轉變為二氧化碳的酵素類型。

丙酮酸進入粒線體後，首先由丙酮酸去氫酶複合體催化：

$$\text{Pyruvate}+\text{CoA}+\text{NAD}^+ \rightarrow \text{Acetyl-CoA}+\text{CO}_2+\text{NADH}+\text{H}^+$$

此反應同時包含：

1. 丙酮酸脫去一個羧基，釋放 $\text{CO}_2$；
2. 剩餘碳骨架被氧化；
3. 電子轉移給 $\text{NAD}^+$，形成 $\text{NADH}$。

因此，將丙酮酸氧化並最終轉換成二氧化碳的關鍵酵素，屬於去氫酶（dehydrogenase）。

解題方法

判斷酵素名稱時，應先確認題幹的核心動詞是 oxidation（氧化），而非單純的脫羧。

去氫酶催化受質失去氫原子或電子，並將電子轉移給 $\text{NAD}^+$、$\text{FAD}$ 等電子受體。丙酮酸氧化過程中，丙酮酸去氫酶複合體使丙酮酸發生氧化脫羧，產生乙醯輔酶 A、二氧化碳與還原型 $\text{NADH}$。

丙酮酸去氫酶複合體包含三個主要酵素：

• E1：丙酮酸去氫酶，負責脫羧；
• E2：二氫硫辛醯轉乙醯酶，負責乙醯基轉移；
• E3：二氫硫辛醯去氫酶，負責再氧化並將電子轉移至 $\text{NAD}^+$。

雖然複合體中的 E1 具有脫羧功能，但整體反應的本質是氧化脫羧，題目問的是催化氧化反應的酵素類型，因此答案為去氫酶。

選項分析

A) oxygenase

本題考查不同組織對葡萄糖和脂肪酸作為能量來源的利用能力。

• A) skeletal muscle (骨骼肌)：在運動時，骨骼肌主要利用葡萄糖和脂肪酸作為能量來源。靜止時，脂肪酸是主要的能量來源。運動強度增加時，葡萄糖的利用增加。
• B) cardiac muscle (心肌)：心肌是高度依賴能量的組織，其主要的能量來源是脂肪酸。在葡萄糖濃度很高時，心肌也可以利用葡萄糖。
• C) liver (肝臟)：肝臟具有代謝靈活性，可以利用葡萄糖、脂肪酸和胺基酸作為能量來源。肝臟在血糖濃度較高時可以儲存葡萄糖（糖原合成），在血糖濃度較低時可以釋放葡萄糖（糖原分解和糖質新生）。肝臟也可以進行脂肪酸氧化。

本題考查膽固醇合成途徑中的調控步驟。

膽固醇合成是一個複雜的多步驟過程，其中一些關鍵步驟受到嚴格調控，以維持細胞內膽固醇的穩態。

膽固醇合成的主要調控步驟是 HMG-CoA 還原酶 (HMG-CoA reductase) 催化的反應。
這個反應是將 HMG-CoA 還原為 mevalonate。
$\text{HMG-CoA} \xrightarrow{\text{HMG-CoA reductase}} \text{Mevalonate}$
HMG-CoA 還原酶是膽固醇合成途徑的限速酶，其活性受到多種因素的調控，包括：

• 轉錄調控：膽固醇水平升高會抑制 HMG-CoA 還原酶基因的轉錄。
• 蛋白質降解：膽固醇水平升高會加速 HMG-CoA 還原酶的降解。

本題考查原核生物和真核生物 mRNA 的起始密碼子及其對應的胺基酸。

• 原核生物 (Prokaryotes)：在原核生物中，起始密碼子通常是 AUG，它編碼 N-甲醯甲硫胺酸 (N-formylmethionine, fMet)。N-甲醯甲硫胺酸在參與蛋白質合成後，通常會被去除，或者其甲醯基被去除，留下甲硫胺酸 (methionine)。因此，原核生物蛋白質合成的起始胺基酸是 N-甲醯甲硫胺酸。
• 真核生物 (Eukaryotes)：在真核生物中，起始密碼子通常也是 AUG，它編碼 甲硫胺酸 (methionine, Met)。真核生物的起始甲硫胺酸沒有被甲醯化。

本題考查 lambda (λ) 噬菌體的基因調控，特別是 CI 蛋白的作用。

λ 噬菌體是一種病毒，在感染宿主細菌後，可以選擇整合到細菌基因組中（裂解週期，lytic cycle）或維持潛伏狀態（溶源週期，lysogenic cycle）。

• CI 蛋白 (Lambda repressor)：CI 蛋白是 λ 噬菌體的阻遏蛋白 (repressor)，它在溶源週期的維持中起關鍵作用。CI 蛋白可以結合到 λ 噬菌體的 PRM (promoter for repressor maintenance) 和 PL (promoter for lysis) 啟動子區域。
  • 結合到 PRM：CI 蛋白可以正向調控自身基因 (CI gene) 的表達，維持 CI 蛋白的持續產生，從而維持溶源狀態。
  • 結合到 PL：CI 蛋白結合到 PL 啟動子，阻止 RNA 聚合酶結合，從而抑制裂解週期相關基因（如 N 基因）的表達。
• 裂解週期 (Lytic cycle)：在裂解週期中，λ 噬菌體會大量複製，並最終裂解宿主細胞。這個過程由 PL 和 PR 啟動子驅動，表達裂解相關基因。
• 溶源週期 (Lysogenic cycle)：在這個階段，λ 噬菌體基因組整合到細菌基因組中，並處於沉默狀態。CI 蛋白是維持這個狀態的關鍵。

題目問的是「High concentration of CI protein in the cell ____ expression of the ____」。

本題考查 Shine-Dalgarno 序列的功能。

Shine-Dalgarno (SD) 序列是原核生物 mRNA 上的一個核糖體結合位點，位於起始密碼子 (AUG) 的上游（約 6-12 個核苷酸）。這個序列富含嘌呤（A 和 G），其序列與 16S rRNA（核糖體小亞基 30S 的一部分）的 3' 端序列 (AGGA) 互補。

SD 序列的功能是：

1. 招募核糖體：SD 序列與 16S rRNA 的互補配對，幫助核糖體（特別是 30S 小亞基）結合到 mRNA 上。
2. 確定起始位點：通過與 16S rRNA 的精確配對，SD 序列能夠準確地將核糖體定位在起始密碼子 AUG 的位置，從而確保蛋白質合成的正確起始。

選項分析：
A) the 30S subunit with the 50S subunit of the ribosome：30S 和 50S 亞基組裝成完整的 70S 核糖體，這個過程與 SD 序列無關。

PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一種體外擴增特定 DNA 片段的技術，其過程包含三個主要的溫度階段，每個階段都有特定的生化反應發生。

PCR 循環的三個溫度階段及其過程如下：

1. 變性 (Denaturation)：

   • 溫度：約 94-98°C。
   • 過程：在這個高溫階段，雙鏈 DNA 分子中的氫鍵被破壞，導致 DNA 雙螺旋結構解開，形成單鏈 DNA。這個變性步驟是為了使引物能夠結合到目標 DNA 模板上。

2. 退火 (Annealing)：

   • 溫度：約 50-65°C（具體溫度取決於引物的長度、GC 含量和鹽濃度等因素）。
   • 過程：在這個較低的溫度下，PCR 引物（短的單鏈 DNA 分子）能夠與模板 DNA 上的互補序列結合（退火）。每個引物都設計為與目標 DNA 片段的兩端互補，以便在其兩側進行擴增。

創造轉基因動物 (transgenic animal) 涉及將外源 DNA（轉基因）導入動物細胞，並確保該 DNA 整合到動物基因組中，且能夠在動物體內表達。以下是一個常見的創建轉基因小鼠的例子，通常使用顯微注射技術：

目標： 創建一隻轉基因小鼠，其肝臟細胞能夠表達一種外源的螢光蛋白（例如 GFP，Green Fluorescent Protein）。

步驟：

1. 構建轉基因載體 (Construct the Transgenic Vector)：

   • 首先，需要從一個 DNA 庫中分離出編碼 GFP 的基因。
   • 然後，將 GFP 基因與一個驅動子 (promoter) 進行連接。驅動子是啟動基因轉錄的 DNA 序列，選擇一個在肝臟細胞中特異性表達的驅動子（例如，Albumin promoter 或 Tet promoter 系統）至關重要，這樣 GFP 才能在目標組織中表達。
   • 在 GFP 基因的 3' 端，還可以連接一個終止子 (terminator) 序列，以確保轉錄和翻譯的正確終止。
   • 將這些組分克隆到一個質粒載體上，該載體具有在哺乳動物細胞中複製和整合的能力。

2. 製備外源 DNA (Prepare the Exogenous DNA)：

   • 將構建好的轉基因載體在細菌中進行大量擴增，然後純化得到高質量的線性 DNA 鏈。在顯微注射前，通常會用限制酶將載體切成線性片段，去除質粒的複製起點等，以促進整合。

3. 顯微注射 (Microinjection)：

   • 從懷孕的雌性小鼠中收集受精卵（通常是受精後約 0.5 天的單細胞胚胎）。
   • 使用精密的顯微操作儀器，將製備好的線性轉基因 DNA 溶液，通過極細的玻璃針，直接注射到受精卵的雄性原核 (male pronucleus) 中。這是最常見且成功率較高的方法，因為原核是細胞核發育的關鍵時期。

4. 胚胎移植 (Embryo Transfer)：

   • 注射了 DNA 的受精卵（轉基因或非轉基因）被培養一段時間，然後移植到假孕的雌性小鼠的輸卵管中。

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 是一種常用的蛋白質分析技術，用於分離、檢測和初步鑑定蛋白質。其基本原理是利用電場分離帶電分子，並通過凝膠基質來進一步分離。

基本概念：

1. SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)：

   • SDS 是一種陰離子去污劑。
   • 在蛋白質樣品中加入 SDS，並進行加熱處理，SDS 會與蛋白質結合，破壞其三級和四級結構，使其變性成線性多肽鏈。
   • SDS 會以大約每 2 個胺基酸結合 1 個 SDS 分子的比例結合，為蛋白質帶上統一的負電荷。
   • 因此，SDS 處理後的蛋白質樣品，其淨電荷與蛋白質分子大小的比例幾乎是恆定的。

2. PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)：

   • 聚丙烯醯胺凝膠 (Polyacrylamide Gel, PAG)：是一種由丙烯醯胺單體和交聯劑（如 N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺, bis-acrylamide）聚合而成的凝膠基質。
   • 凝膠濃度：聚丙烯醯胺凝膠的濃度（通常表示為 %T，總單體濃度，和 %C，交聯劑比例）可以通過改變單體和交聯劑的比例來調整。較高的凝膠濃度可以分離較小的蛋白質，而較低的濃度則適合分離較大的蛋白質。凝膠基質就像一個篩子，孔徑大小決定了分離能力。
   • 電泳 (Electrophoresis)：將蛋白質樣品鋪在凝膠的一端，然後施加一個電場。由於 SDS 使蛋白質帶負電荷，它們會在電場作用下向正極（陽極）移動。
   • 分離原理：在電場作用下，帶負電的蛋白質分子在凝膠基質中移動。較小的蛋白質能夠更容易地穿過凝膠的孔隙，移動速度較快；而較大的蛋白質則會受到凝膠基質的阻礙，移動速度較慢。因此，蛋白質根據其分子大小（分子量）被分離開來，在凝膠中形成不同的條帶。

3. 樣品製備 (Sample Preparation)：

   • 將蛋白質樣品與 SDS、還原劑（如 DTT 或 β-巰基乙醇，用於斷裂蛋白質內的二硫鍵）和緩衝液混合，並加熱處理。

ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) 是一種用於研究 DNA 與蛋白質（如轉錄因子、組蛋白修飾等）之間相互作用的實驗技術。它能夠確定特定蛋白質在細胞核內與哪些 DNA 片段結合。

基本概念：

ChIP 技術的核心是利用特異性抗體來捕獲與目標蛋白質結合的 DNA 片段。其主要步驟如下：

1. 交聯 (Crosslinking)：

   • 目的：在細胞內，DNA 和蛋白質之間通過氫鍵、離子鍵等非共價鍵結合。為了在細胞裂解後仍能維持這種結合，需要使用化學交聯劑（最常用的是甲醛, formaldehyde）來形成共價鍵，將蛋白質與其結合的 DNA 穩定地連接起來。
   • 過程：將細胞在體內或體外用甲醛處理一段時間，甲醛會在蛋白質和 DNA 之間形成亞甲基橋。

2. 細胞裂解與 DNA 打斷 (Cell Lysis and DNA Fragmentation)：

   • 細胞裂解：使用細胞裂解緩衝液和物理方法（如超聲波處理或酶解）來破壞細胞膜和細胞核膜，釋放出細胞核內容物。
   • DNA 打斷 (Shearing)：通過超聲波處理（最常用）或酶解，將細胞核內的染色質（DNA 與蛋白質的複合物）打斷成較小的 DNA 片段。這些片段的大小通常在幾百到一千鹼基對 (bp) 之間。這個步驟的目的是使抗體能夠有效接近並結合到目標蛋白質及其結合的 DNA 上。

3. 免疫沉澱 (Immunoprecipitation, IP)：

   • 抗體結合：將打斷後的染色質片段與針對目標蛋白質的特異性抗體在緩衝液中孵育。抗體會結合到樣品中存在的目標蛋白質及其共價連接的 DNA 片段上。
   • 免疫複合物捕獲：然後，加入固相載體（通常是瓊脂糖微珠或磁珠，表面連接有蛋白質 A 或蛋白質 G），這些載體能夠與抗體結合。通過離心或磁力分離，將結合了抗體-蛋白質-DNA 複合物的載體沉澱下來。
   • 洗滌：用不同的緩衝液對沉澱物進行多次洗滌，以去除非特異性結合的 DNA 和蛋白質，從而提高實驗的特異性。

4. DNA 解交聯與純化 (DNA Reversal of Crosslinking and Purification)：

DNA 微陣列 (DNA Microarray)，也稱為 DNA 芯片 (DNA chip) 或基因芯片 (gene chip)，是一種高通量、平行化的分子生物學技術，用於同時檢測樣品中成千上萬個基因的表達水平或基因型的變化。

基本概念：

DNA 微陣列的原理是利用核酸雜交 (nucleic acid hybridization) 的特異性。它包含一個固體基底（如玻璃片、矽片或尼龍膜）上，預先固定了大量已知序列的 DNA 探針（探針通常是單鏈 DNA 或 cDNA 片段）。

主要組成部分與原理：

1. 固體基底 (Solid Support)：

   • 通常是玻璃片，表面經過特殊處理，便於 DNA 探針的固定。
   • 探針可以通過化學鍵（如共價鍵）或物理吸附的方式固定在基底上。

2. DNA 探針 (DNA Probes)：

   • 每個探針都是一個已知的、單鏈的 DNA 或 cDNA 片段，其序列與一個特定的基因或基因區域相匹配。
   • 在一個微陣列上，可以預先固定數萬到數百萬個不同的探針，覆蓋一個基因組或一個表達譜。
   • 這些探針被規則地排列在基底上，形成一個陣列（grid）。

3. 樣品處理與標記 (Sample Preparation and Labeling)：

   • 樣品：通常是來自不同生物樣本（如組織、細胞系、血液等）的 mRNA 或基因組 DNA。
   • 逆轉錄與標記：如果研究的是基因表達，則需要從 mRNA 反轉錄生成 cDNA。然後，將 cDNA 進行標記，通常是通過在逆轉錄過程中加入帶有螢光染料（如 Cy3, Cy5）或放射性同位素的標記物。
   • 樣品比較：在比較表達水平時，通常會準備兩個樣品（例如，疾病組織和正常組織），並分別用不同顏色的螢光染料進行標記。

4. 雜交 (Hybridization)：

   • 將標記好的 cDNA 樣本（或基因組 DNA）與微陣列芯片進行孵育。
   • 由於鹼基互補配對原則，樣品中的 cDNA 會與芯片上序列互補的 DNA 探針發生雜交結合。
   • 未結合的 cDNA 會通過洗滌去除。

Western Blot (蛋白質印跡法) 是一種用於檢測和定量特定蛋白質的實驗技術。它結合了凝膠電泳、蛋白質轉移和免疫學檢測的原理，能夠在複雜的蛋白質混合物中準確地識別和測量目標蛋白質。

基本概念：

Western Blot 的核心是利用特異性抗體來識別和檢測目標蛋白質。整個過程可以分為以下幾個主要步驟：

1. 蛋白質樣品製備 (Sample Preparation)：

   • 從細胞或組織中提取蛋白質。
   • 樣品通常需要進行裂解，並可能加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白質降解。

2. 蛋白質分離 (Protein Separation)：

   • SDS-PAGE：這是最常用的蛋白質分離方法。樣品在 SDS-PAGE 凝膠中根據分子量大小進行分離。這樣做的目的是將目標蛋白質與其他蛋白質區分開來，並提供一個粗略的分子量估計。

3. 蛋白質轉移 (Protein Transfer/Blotting)：

   • 目的：將在凝膠中分離好的蛋白質轉移到一個固體支持膜上（如硝酸纖維素膜或 PVDF 膜）。這樣做的原因有二：
     • 穩定性：凝膠本身不夠穩定，轉移到膜上可以方便後續的操作。
     • 可及性：膜上的蛋白質更容易被抗體接觸和識別。
   • 方法：通常採用電轉移 (electroblotting) 的方式。將蛋白質凝膠和轉移膜夾在電極之間，在電場作用下，帶負電的蛋白質從凝膠移動到膜上。
   • 轉移類型：根據凝膠孔徑大小和蛋白質分子量，可以選擇濕式轉移、半乾式轉移或乾式轉移。

4. 封閉 (Blocking)：

   • 目的：轉移後的膜上，除了目標蛋白質結合位點外，還有大量未結合的蛋白質結合位點。為了防止後續使用的抗體非特異性地結合到膜上，需要對膜進行封閉處理。
   • 方法：使用含有非特異性蛋白質的封閉液（如脫脂奶粉溶液或 BSA 溶液）來飽和膜上未被蛋白質佔據的位點。

5. 一抗孵育 (Primary Antibody Incubation)：

   • 目的：使用針對目標蛋白質的一抗 (primary antibody) 進行孵育。

RNAi (RNA interference, RNA 干擾) 是一種在真核生物中調控基因表達的自然機制，也是一種廣泛應用於研究基因功能和治療疾病的分子生物學技術。其核心原理是利用雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 來誘導細胞內特定 mRNA 的降解或抑制其翻譯，從而達到「沉默」目標基因表達的目的。

基本概念：

RNAi 過程涉及幾個關鍵的分子和步驟：

1. 雙鏈 RNA (dsRNA) 的來源：

   • 內源性：在細胞內，dsRNA 可以由特定的基因（如 microRNA, miRNA 基因）轉錄產生，或者由病毒感染產生。
   • 外源性：在實驗室中，可以通過化學合成或體外轉錄等方法製備 dsRNA，並將其導入細胞。常用的外源 dsRNA 包括：
     • 小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA)：通常是 20-25 個核苷酸長，與目標 mRNA 序列高度互補。
     • 短髮夾 RNA (short hairpin RNA, shRNA)：在細胞內被處理成 siRNA，然後發揮作用。

2. Dicer 酶的作用：

   • 當 dsRNA 進入細胞後，會被一種稱為 Dicer 的核酸酶切割。
   • Dicer 是一種 RNase III 型內切酶，它能夠將較長的 dsRNA 切割成 20-25 個核苷酸長的小分子 dsRNA，稱為 siRNA。miRNA 也可以通過 Dicer 酶加工成熟。

3. RISC 複合物的形成與作用：

   • 加工後的 siRNA（或成熟的 miRNA）會與一系列蛋白質組合成一個叫做 RNA 誘導的沉默複合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)。
   • RISC 複合物中的一個關鍵組分是 Argonaute (Ago) 蛋白。Ago 蛋白會結合 siRNA 的其中一個股（導鏈，guide strand），而另一股（反導鏈，passenger strand）則被降解。
   • 帶有 siRNA 導鏈的 RISC 複合物尋找細胞內與該 siRNA 導鏈序列互補的 mRNA。

4. 靶向 mRNA 的沉默：

   • mRNA 降解：如果 siRNA 導鏈與目標 mRNA 序列完全互補，則 RISC 複合物中的 Ago 蛋白（具有核酸酶活性）會切割目標