112 年 國立成功大學臨床醫學研究所《生物化學》

脂質雙層膜的不對稱性對於細胞膜的功能至關重要，它確保了細胞膜內外環境的區隔、細胞與外界的互動以及細胞內部的組織化。這種不對稱性主要體現在脂質和蛋白質的組成與分佈上。

核心觀念：細胞膜的結構與功能。

詳解：
脂質雙層膜的不對稱性體現在以下幾個方面：

1. 脂質組成的不對稱性：

   • 磷脂的種類和電荷分佈：外層（質膜外側）富含磷脂醯膽鹼（phosphatidylcholine, PC）和鞘磷脂（sphingomyelin），這些脂質通常是中性或呈正電性。內層（質膜內側）則富含磷脂醯乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）、磷脂醯絲胺酸（phosphatidylserine, PS）和磷脂醯肌醇（phosphatidylinositol, PI）。PS 帶負電，PI 則是重要的信號分子。
   • 功能重要性：
     • 膜的曲率和穩定性：不同種類的磷脂具有不同的頭基大小和鏈長，影響膜的曲率和穩定性。例如，PE 的頭基較小，有助於形成膜的彎曲。
     • 信號傳導：內層的 PS 暴露於細胞質側，其負電荷可以與細胞質中的陽離子結合，並作為某些信號通路（如 PI 3-激酶途徑）的底物。PS 翻轉到外層（細胞凋亡時）是細胞凋亡的標誌之一。
     • 膜的流動性：鞘磷脂在外層有助於形成更緻密的脂筏（lipid rafts），影響膜的流動性和特定蛋白質的聚集。

2. 蛋白質分佈的不對稱性：

   • 整合蛋白（Integral proteins）：整合蛋白的跨膜結構決定了其在膜內部的方向性。例如，受體蛋白的配體結合域通常位於細胞外，而信號傳導域位於細胞內。

RNA interference（RNAi）是一種由雙鏈 RNA（dsRNA）誘導的、在真核生物中普遍存在的基因沉默機制。它通過小 RNA 分子（如 small interfering RNA, siRNA 和 microRNA, miRNA）介導，可以精確地靶向並降解特定的 mRNA，或抑制其翻譯，從而調控基因表達。

核心觀念：基因調控、小 RNA。

詳解：
RNA interference (RNAi) 的機制：

1. dsRNA 的產生：外源性的 dsRNA（如病毒 RNA）或內源性的 dsRNA（如由特定基因轉錄產生）被細胞識別。
2. Dicer 酶的作用：dsRNA 被一種稱為 Dicer 的 RNase III 型核酸酶切割，產生長度約 21-25 個核苷酸的短雙鏈 RNA，稱為 siRNA（small interfering RNA）或 miRNA 前體。
3. RISC 複合物的形成：其中一股 RNA 鏈（稱為引導鏈 guide strand）被整合到 RNA-induced silencing complex (RISC) 中，而另一股鏈（稱為乘客鏈 passenger strand）則被降解。RISC 複合物的核心成分是 Argonaute (Ago) 蛋白。
4. 靶向與基因沉默：RISC 複合物利用引導鏈與靶向的 mRNA 進行鹼基配對。
   • mRNA 降解：如果引導鏈與靶向 mRNA 的配對是完全匹配的，Argonaute 蛋白的核酸酶活性會切割 mRNA，導致其快速降解。
   • 翻譯抑制：如果配對是不完全匹配的（常見於 miRNA），RISC 複合物會抑制 mRNA 的翻譯，阻止蛋白質的合成。

主要功能與例子：

核心觀念

翻譯調控（translational control）是指細胞透過改變 mRNA 被核糖體翻譯成蛋白質的效率，調節蛋白質產量。其特色是作用速度通常比轉錄調控快，因為細胞可直接利用既有的 mRNA，迅速增加或降低蛋白質合成。

翻譯可分為三個主要階段：

1. 起始（initiation）：核糖體辨認 mRNA 並定位起始密碼子。
2. 延長（elongation）：核糖體沿 mRNA 移動，依序加入胺基酸。
3. 終止（termination）：核糖體辨認終止密碼子並釋放多胜肽。

其中，翻譯起始通常是最主要、最常被調控的速率限制步驟。翻譯調控可分為全域性調控與特定 mRNA 的選擇性調控。

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解題方法

面對此題，應依照「調控位置」及「調控分子」整理機制：

• 先說明翻譯起始如何被控制；
• 再補充延長與終止階段的調控；
• 接著說明 mRNA 本身的結構、穩定性及 RNA-binding proteins、miRNA 對翻譯的影響；
• 最後以原核生物與真核生物的代表性例子作總結。

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一、翻譯起始的調控

1. 真核生物的起始調控

真核生物 mRNA 通常具有 $5'$ cap、5' untranslated region（5' UTR）、coding region、3' UTR 與 poly(A) tail。起始時，核糖體先由起始因子協助結合 $5'$ cap，再沿 mRNA 掃描至適當的 AUG 起始密碼子。

關鍵起始因子包括：

• eIF4E：結合 $5'$ cap；
• eIF4G：作為支架蛋白，連接 eIF4E、poly(A)-binding protein（PABP）與其他起始因子；
• eIF4A：RNA helicase，解開 5' UTR 的二級結構；
• eIF2：攜帶 initiator Met-tRNA；
• eIF2B：促進 eIF2-GDP 交換成 eIF2-GTP；
• mTORC1：促進細胞生長狀態下的整體翻譯。

eIF2 磷酸化造成整體翻譯抑制

eIF2 在 GTP 狀態下可攜帶起始 tRNA。完成起始後，eIF2-GTP 會水解成 eIF2-GDP，必須經由 eIF2B 將 GDP 置換成 GTP，才能重新參與翻譯起始。

當細胞遭受胺基酸缺乏、病毒感染、內質網壓力或氧化壓力時，特定 kinase 會磷酸化 eIF2 的 $\alpha$ 次單元，使磷酸化 eIF2 與 eIF2B 緊密結合，抑制 GDP-GTP 交換：

$$\text{eIF2-GDP} \xrightarrow[\text{eIF2B}]{\text{正常}} \text{eIF2-GTP}$$

但在 eIF2$\alpha$ 磷酸化後：

$$\text{eIF2}\alpha\text{-P} \longrightarrow \text{抑制 eIF2B} \longrightarrow \downarrow \text{eIF2-GTP}$$

結果是大部分 mRNA 的翻譯起始下降，形成整體翻譯抑制。不過，某些含有 upstream open reading frame（uORF）的 mRNA，例如 ATF4 mRNA，反而能在此情況下增加翻譯，協助細胞啟動壓力反應。

常見的 eIF2$\alpha$ kinase 包括：

• GCN2：胺基酸缺乏時活化；
• PERK：內質網壓力時活化；
• PKR：病毒雙股 RNA 刺激時活化；
• HRI：血基質或氧化壓力相關狀態下活化。

mTORC1 與 4E-BP 調控

在營養充足及生長因子刺激下，mTORC1 會磷酸化 4E-BP。未磷酸化的 4E-BP 會結合 eIF4E，使 eIF4E 無法與 eIF4G 組成起始複合體，因此抑制 cap-dependent translation。

當 mTORC1 活化時：

$$\text{mTORC1} \longrightarrow \text{磷酸化 4E-BP}$$ $$\text{4E-BP 與 eIF4E 分離} \longrightarrow \text{eIF4E-eIF4G 複合體形成} \longrightarrow \uparrow \text{翻譯起始}$$

因此，mTORC1 可整體促進蛋白質合成，特別是與細胞生長、細胞週期及代謝相關的蛋白質。

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2. mRNA 5' UTR 二級結構

若 mRNA 的 5' UTR 形成穩定髮夾結構，核糖體掃描至 AUG 的過程會受到阻礙，翻譯效率下降。

其基本關係為：

$$\text{5' UTR 二級結構增加} \longrightarrow \text{核糖體掃描困難} \longrightarrow \downarrow \text{翻譯起始}$$

eIF4A 等 helicase 可解開部分 RNA 結構，因此細胞可藉由改變起始因子活性，選擇性影響具有複雜 5' UTR 的 mRNA。

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3. upstream open reading frame（uORF）

uORF 是位於主要蛋白質編碼區上游的短開放閱讀框。核糖體若先翻譯 uORF，可能在下游主要起始密碼子前終止，降低主蛋白質的翻譯。

一般狀況下：

$$\text{翻譯 uORF} \longrightarrow \text{核糖體在主要 ORF 前終止} \longrightarrow \downarrow \text{主要蛋白質翻譯}$$

但在特定壓力狀態下，起始因子濃度下降，核糖體可能跳過某些 uORF，重新在主要 ORF 起始，因而使特定蛋白質增加。ATF4 是典型例子。

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4. 內部核糖體進入位點（IRES）

部分病毒 mRNA 與少數真核細胞 mRNA 含有 internal ribosome entry site（IRES）。IRES 可讓核糖體不依賴正常的 $5'$ cap-dependent initiation，直接在 mRNA 內部募集起始複合體。

在一般 cap-dependent translation 受抑制時：

$$\text{cap-dependent initiation 下降} \quad\text{但}\quad \text{IRES-dependent initiation 可維持}$$

因此，IRES 可使某些病毒蛋白或壓力反應蛋白在細胞整體翻譯降低時仍然合成。

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二、特定 mRNA 的翻譯調控

1. RNA-binding proteins

RNA-binding proteins 可結合 mRNA 的 5' UTR 或 3' UTR，改變核糖體結合、mRNA 穩定性或 mRNA 的細胞內定位。

若 RNA-binding protein 結合 5' UTR 並阻礙核糖體進入，會造成：

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一種體外擴增特定 DNA 片段的強大技術。其核心原理是通過重複的變性、退火和延伸三個步驟，在數小時內將微量的 DNA 樣本指數級地擴增。

核心觀念：DNA 複製、聚合酶、引物。

詳解：
基本原理：PCR 利用 DNA 聚合酶（通常是熱穩定性的 Taq 酶）在引物（primers）的引導下，以目標 DNA 片段為模板，進行鏈式合成。通過變性（高溫使雙鏈 DNA 分開）、退火（低溫使引物與模板 DNA 結合）和延伸（適宜溫度下，聚合酶合成新鏈）三個步驟的循環，每次循環都使目標 DNA 拷貝數翻倍，從而實現指數級的擴增。

簡單繪圖說明：

（請想像以下圖示，或參考教科書上的標準 PCR 圖示）

1. 起始模板 (Template DNA)：一條雙鏈 DNA，其中包含一個特定的目標序列。
2. 引物 (Primers)：兩條短的單鏈 DNA，分別與目標序列的兩端互補結合，方向相反（一個在前向，一個在後向）。
3. 變性 (Denaturation)：加熱到約 $95^\circ C$，破壞 DNA 雙鏈中的氫鍵，使其分離成兩條單鏈。
4. 退火 (Annealing)：將溫度降低到約 $50-65^\circ C$（具體溫度取決於引物的 Tm 值），使引物能夠與各自互補的單鏈 DNA 模板結合。
5. 延伸 (Extension)：將溫度升高到約 $72^\circ C$（Taq 酶的最適溫度），DNA 聚合酶（如 Taq 酶）以引物為起始點，沿著模板鏈合成新的 DNA 鏈。

循環過程：

• 第一輪循環：從一條雙鏈 DNA 開始，經過變性、退火、延伸後，得到兩條新的雙鏈 DNA。其中一條是目標序列，但另一條可能比目標序列長（因為引物結合位點之外的序列也被複製了）。
• 第二輪循環：將第一輪產生的 DNA 作為模板。變性後，引物會結合到目標序列的兩端。延伸時，聚合酶會合成以目標序列為模板的新鏈。

蛋白質在細胞內的運輸，或稱為蛋白質的「交通」，是一個高度組織化且精確的過程，確保蛋白質能夠到達它們在細胞內的正確位置（細胞器）或被分泌到細胞外執行功能。這個過程涉及蛋白質的合成、摺疊、修飾、運輸信號以及運輸機制。

核心觀念：蛋白質定位、膜運輸、分泌途徑。

詳解：
蛋白質交通的「路線圖」可以分為兩大類：

1. 分泌途徑 (Secretory Pathway)：蛋白質首先進入內質網（ER），然後經過高爾基體（Golgi apparatus），最終被運送到溶酶體（lysosome）、細胞膜（plasma membrane）或被分泌到細胞外。
2. 非分泌途徑 (Non-secretory Pathway)：蛋白質被運送到細胞核（nucleus）、粒線體（mitochondria）、過氧化物酶體（peroxisome）或細胞質（cytosol）。

簡單繪圖說明（概念性路線圖）：

（請想像以下示意圖，或參考教科書上的細胞器分佈圖與蛋白質運輸圖。）

圖示元素：

• 細胞核 (Nucleus)
• 核糖體 (Ribosomes)
• 粗糙內質網 (Rough Endoplasmic Reticulum, RER)
• 滑面內質網 (Smooth Endoplasmic Reticulum, SER)
• 高爾基體 (Golgi Apparatus)
• 溶酶體 (Lysosome)
• 細胞膜 (Plasma Membrane)
• 分泌囊泡 (Secretory Vesicles)
• 粒線體 (Mitochondrion)
• 過氧化物酶體 (Peroxisome)
• 細胞質 (Cytosol)

蛋白質合成與運輸的流程：

1. 蛋白質合成的起始：

   • 細胞質合成：大多數細胞內蛋白質（如細胞核、粒線體、過氧化物酶體內的蛋白質）的合成起始於細胞質中的游離核糖體。
   • 粗糙內質網合成：分泌途徑中的蛋白質、膜蛋白、溶酶體蛋白質的合成起始於細胞質中的核糖體，但當信號肽（signal peptide）出現時，核糖體會被引導到粗糙內質網（RER）表面，並在此完成合成。

2. 進入內質網 (ER)：

   • 信號肽識別：對於要進入分泌途徑的蛋白質，其 N-端通常有一個信號肽。信號肽被細胞質中的信號識別顆粒（SRP）識別，SRP 會暫停蛋白質合成，並將核糖體-mRNA-蛋白質複合物導向內質網膜上的 SRP 受體。
   • 轉運：蛋白質通過內質網膜上的轉運通道（translocon）進入內質網腔（ER lumen）或插入內質網膜。在內質網腔內，蛋白質會經歷摺疊（由分子伴侶如 BiP 協助）、糖基化（N-連接糖基化）和二硫鍵形成。

3. 從內質網到高爾基體：

   • 囊泡運輸：摺疊正確的蛋白質通過 COPII 囊泡從內質網運輸到高爾基體。

DNA 損傷是持續不斷發生的，可能由內源性因素（如 DNA 複製錯誤、活性氧物種 ROS）或外源性因素（如紫外線 UV、電離輻射、化學致癌物）引起。細胞擁有一系列複雜而精密的 DNA 修復機制，以維持基因組的穩定性。

核心觀念：DNA 損傷、修復酶、基因組穩定性。

詳解：
DNA 修復機制主要有以下幾類：

1. 直接重返 (Direct Reversal)：

   • 機制：某些特定的酶可以識別 DNA 損傷，並直接逆轉損傷過程，將 DNA 恢復到原始狀態，無需切除損傷片段。
   • 例子：
     • 光復活酶 (Photolyase)：在細菌和某些真核生物中，光復活酶可以識別 UV 誘導的嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體 TT），並在光能的幫助下，直接斷開二聚體之間的共價鍵，恢復為兩個單獨的嘧啶。
     • 烷基化修復酶 (Alkyltransferases)：例如 O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶 (MGMT)，它可以將烷基基團從鳥嘌呤的 O6 位點轉移到自身上，從而使鳥嘌呤恢復正常。這是一種「自殺性」的修復過程，酶本身會被失活。

2. 鹼基切除修復 (Base Excision Repair, BER)：

   • 適用損傷：主要修復由氧化、烷基化、脫氨基等引起的單個受損鹼基。
   • 機制：
     • DNA 糖苷酶 (DNA Glycosylase)：識別並切除受損鹼基與脫氧核糖之間的 N-糖苷鍵，在 DNA 中形成一個無鹼基位點（AP site, apurinic/apyrimidinic site）。
     • AP 核酸內切酶 (AP Endonuclease)：切開無鹼基位點的磷酸二酯鍵，產生一個 3'-OH 末端。
     • DNA 聚合酶 (DNA Polymerase)：在 3'-OH 末端添加新的正確核苷酸，填補空缺。
     • DNA 連接酶 (DNA Ligase)：修補磷酸二酯鍵，完成 DNA 鏈的連接。
   • 短通路與長通路：BER 有短通路（只替換一個核苷酸）和長通路（替換多個核苷酸）之分，後者通常涉及 PCNA 和 RNase H。

3. 核苷酸切除修復 (Nucleotide Excision Repair, NER)：

   • 適用損傷：修復體積較大、結構扭曲 DNA 的損傷，如 UV 誘導的嘧啶二聚體、化學加合物。
   • 機制：
     • 損傷識別：尋找 DNA 結構異常區域。
     • 局部解旋：在損傷區域附近解開 DNA 雙鏈。
     • 切除：使用核酸內切酶在損傷位點的兩側切開磷酸二酯鍵，切除一個較長的、包含損傷的單鏈 DNA 片段（約 12-30 個核苷酸）。
     • DNA 聚合酶：利用另一條鏈作為模板，合成新的 DNA 片段。

好的，這題主要在探討蛋白質在細胞內轉譯（translation）過程中，如何被準確地運送到其最終目的地，以及這兩種不同的運輸機制（共轉譯轉位與轉譯後轉位）的優缺點。

第 7 題詳解

本題要求解釋「共轉譯轉位」（co-translational translocation）與「轉譯後轉位」（post-translational translocation）的定義，並比較兩者在蛋白質運輸過程中的優點或缺陷。這兩種機制是細胞內蛋白質運輸的重要途徑，確保蛋白質能抵達正確的細胞器或分泌到細胞外。

解題過程：

(a) 共轉譯轉位 (Co-translational Translocation)

• 定義： 共轉譯轉位是指蛋白質在核糖體上合成（轉譯）的過程中，其多肽鏈就開始被運輸到目標位置（例如內質網膜、粒線體膜、葉綠體膜或過氧化物酶體膜）的過程。當新生多肽鏈的特定信號序列（signal sequence）出現時，它會被信號識別顆粒（Signal Recognition Particle, SRP）識別，並將核糖體-mRNA-新生多肽鏈複合物導向目標膜上的SRP受體，進而啟動蛋白質的運輸。

• 機制與優點：

  • 效率高： 蛋白質合成與運輸同時進行，節省時間。
  • 避免錯誤摺疊： 蛋白質在合成的同時就被導入膜內或分泌途徑，可以防止其在細胞質中錯誤摺疊，特別是對於那些需要跨膜運輸或在特定膜上發揮功能的蛋白質。
  • 直接進入目標膜： 對於需要整合到內質網膜、粒線體膜等膜上的蛋白質，共轉譯轉位可以直接將其插入膜中。
  • 分泌途徑的起始： 這是分泌蛋白和膜蛋白進入內質網的起始步驟，為後續的加工（如醣基化）和運輸到高基氏體、細胞膜或分泌到細胞外奠定基礎。

• 缺陷：

  • 依賴信號序列： 必須有正確的信號序列才能啟動。
  • 對細胞質環境敏感： 如果SRP或目標膜上的轉運複合物（如Sec61通道）出現問題，可能導致蛋白質合成中斷或運輸失敗。
  • 可能影響轉譯速率： 蛋白質運輸的阻礙可能會影響核糖體的工作效率。

(b) 轉譯後轉位 (Post-translational Translocation)

• 定義： 轉譯後轉位是指蛋白質在核糖體上完全合成後，才被運輸到其最終目的地（例如粒線體、葉綠體、過氧化物酶體或細胞核）的過程。這些蛋白質在細胞質中合成，並通常攜帶有特定的轉運信號（targeting signal），然後被運輸因子識別並導向目標細胞器的膜，再通過膜上的轉運複合物進入細胞器內部或整合到膜上。

• 機制與優點：

  • 靈活性高： 蛋白質可以在細胞質中先進行一些初步的摺疊或修飾，然後再進行運輸。
  • 適用於特定細胞器： 這是進入粒線體、葉綠體、過氧化物酶體和細胞核的主要途徑。
  • 不依賴SRP： 運輸過程不直接依賴SRP，而是由細胞質伴侶蛋白（chaperones）協助蛋白質維持未摺疊或部分摺疊狀態，並由目標細胞器上的轉運受體識別。
  • 可運輸至細胞核： 許多核蛋白在細胞質合成後，通過核孔複合物（Nuclear Pore Complex, NPC）運輸到細胞核。

• 缺陷：

  • 需要伴侶蛋白協助： 蛋白質在細胞質中需要伴侶蛋白（如Hsp70）的協助，以防止其在運輸前錯誤摺疊，這增加了能量消耗（ATP水解）。
  • 運輸效率可能較低： 相較於共轉譯轉位，需要額外的步驟，可能整體效率稍低。