112 年 國立成功大學臨床醫學研究所《分子生物學》

DNA polymerase 確保 DNA 複製的準確性主要透過以下兩種機制：

1. 校對功能 (Proofreading activity)：大多數 DNA polymerase 具有 3' 到 5' 的外切酶活性 (exonuclease activity)。在 DNA 鏈合成過程中，如果 DNA polymerase 錯誤地加入了一個不匹配的核苷酸，這個錯誤的核苷酸會導致 DNA 雙螺旋結構不穩定，進而改變 DNA polymerase 的構象。這會促使 polymerase 將剛加入的錯誤核苷酸移除，然後再嘗試加入正確的核苷酸。這種校對機制可以糾正約 99% 的錯誤。

「可變剪接」(Alternative splicing) 是真核生物 mRNA 前驅體 (pre-mRNA) 加工 (processing) 的一種重要機制。在基因轉錄後，pre-mRNA 會包含外顯子 (exons) 和內含子 (introns)。內含子是不會被翻譯成蛋白質的序列，必須被移除；外顯子是會被保留並最終組合成成熟 mRNA 的序列。

在典型的剪接過程中，所有的內含子都會被精確地移除，並將相鄰的外顯子連接起來。然而，在可變剪接中，同一個 pre-mRNA 分子可以根據細胞的需要或外界的信號，以不同的方式進行剪接。這意味著：

哺乳動物蛋白質的翻譯總是始於甲硫胺酸 (Methionine)。這背後的原因與起始密碼子 (start codon) 和起始 tRNA (initiator tRNA) 的作用有關。

1. 起始密碼子: mRNA 上的翻譯起始點通常由起始密碼子 AUG 標識。AUG 密碼子在 mRNA 的閱讀框 (reading frame) 中，不僅編碼甲硫胺酸，也是蛋白質合成的起始信號。

2. 起始 tRNA: 在細胞質中，存在一種特殊的 tRNA，稱為起始 tRNA (initiator tRNA)。這種 tRNA 攜帶甲硫胺酸，並且能夠識別起始密碼子 AUG。在哺乳動物中，這種起始 tRNA 的結構和功能與其他攜帶甲硫胺酸的 tRNA 不同，它專門負責啟動蛋白質的合成。

「誘導型表達載體」(Inducible expression vector) 是一種基因工程中使用的載體（如質體），其特點是目標基因的表達（轉錄和翻譯）受到一個外源性誘導劑 (inducer) 的調控。

這種載體通常包含以下關鍵元件：

1. 強啟動子 (Strong promoter)：這個啟動子通常是可誘導的，例如 lac 啟動子 (受 IPTG 誘導) 或 T7 啟動子 (受 IPTG 誘導，但通常需要 T7 RNA polymerase)。
2. 目標基因 (Gene of interest)：需要被表達和生產的重組蛋白質的基因。
3. 調控元件 (Regulatory elements)：例如操縱子 (operator) 或增強子 (enhancer)，這些元件與啟動子協同作用，並對誘導劑作出反應。

使用誘導型表達載體的益處 (Benefits of using inducible expression vector)：

1. 控制蛋白質的表達時機 (Control of expression timing)：在細菌或宿主細胞生長到足夠密度時，才能加入誘導劑來啟動目標基因的

原癌基因 (Proto-oncogenes) 的正常生物學功能：

原癌基因是細胞內正常存在的基因，它們在細胞的正常生長、分化和存活中扮演著關鍵角色。它們的正常功能通常涉及細胞信號傳導通路，調控細胞的增殖、分化、凋亡 (apoptosis) 和細胞週期。這些基因的活性受到嚴格調控，確保細胞在適當的時間和條件下進行分裂。常見的原癌基因產物包括生長因子、生長因子受體、信號轉導蛋白（如酪胺酸激酶）和轉錄因子等。

原癌基因轉變為癌基因 (Oncogenes) 的遺傳學改變：

當原癌基因發生突變或受到其他遺傳學改變的影響，導致其活性異常增強或持續激活時，它們就變成了癌基因。這些改變包括：

1. 點突變 (Point mutations)：在基因的關鍵區域（如啟動子、編碼區或調控區）發生單個鹼基的改變，可能導致編碼的蛋白質結構改變，使其持續處於激活狀態（例如 KRAS 基因的突變）。
2. 基因擴增 (Gene amplification)：基因拷貝數增加，導致產生過量的蛋白質（例如 MYC 基因的擴增）。
3. 染色體易位 (Chromosomal translocations)：染色體片段的斷裂和重接，可能將原癌基因連接到一個強表達的啟動子附近，導致其過度表達（例如 BCR-ABL 融合基因，由費城染色體易位產生）。也可能產生新的、異常活性的融合蛋白。
4. 插入突變 (Insertional mutagenesis)：病毒或轉座子插入到原癌基因的調控區域，導致其表達失控。

癌基因致癌的例子：

CRISPR/Cas9 技術描述：

CRISPR/Cas9 是一種革命性的基因編輯技術，源自細菌的適應性免疫系統。它由兩部分組成：

1. CRISPR RNA (crRNA)：這是一個短的 RNA 分子，其序列可以設計成與目標 DNA 序列互補。它充當「嚮導」(guide RNA, gRNA)，負責將 Cas9 酶引導到基因組中的特定位置。在實際應用中，通常使用一個稱為單鏈嚮導 RNA (single-guide RNA, sgRNA) 的嵌合分子，它結合了 crRNA 和 tracrRNA 的功能。
2. Cas9 酶 (Cas9 nuclease)：這是一種 DNA 酶，能夠切割雙鏈 DNA。在 sgRNA 的引導下，Cas9 酶會在目標 DNA 序列處產生雙鏈斷裂 (double-strand break, DSB)。

當 sgRNA 與目標 DNA 序列結合後，Cas9 酶就會在其附近（通常是 sgRNA 識別序列下游的特定短序列，稱為 PAM 序列）切割 DNA。細胞在修復這個雙鏈斷裂時，會激活自身的 DNA 修復機制。

• 非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ)：這是一種快速但容易出錯的修復途徑，常常在斷裂點引入小的插入或刪除 (indels)，導致基因失活（基因敲除，gene knockout）。
• 同源定向修復 (Homology-directed repair, HDR)：如果同時提供一個與斷裂位點同源的 DNA 修復模板，細胞就可以利用這個模板來修復斷裂，從而精確地插入新的 DNA 序列、替換現有序列或修復突變。

在分子生物學中的應用：

細胞治療 (Cell therapy) 的定義：

細胞治療是一種利用活細胞來治療疾病的療法。這些細胞可以是從患者自身、捐贈者，甚至是通過體外培養或基因工程改造的細胞。其基本原理是通過引入、替換或修飾細胞來恢復或增強身體的某些功能，或對抗疾病。

潛在應用與限制：

以下是細胞治療的兩個例子及其應用與限制：

1. 幹細胞治療 (Stem cell therapy)

• 潛在應用:
  • 組織修復與再生: 幹細胞，特別是誘導多能幹細胞 (iPSCs) 或成體幹細胞，具有分化成多種細胞類型的能力。它們被用於治療因損傷或疾病導致的組織喪失或功能障礙，例如：
    • 心臟病: 將間充質幹細胞 (MSCs) 或心肌前驅細胞注入受損心臟，以修復心肌組織。
    • 神經退行性疾病: 例如帕金森氏症，通過移植能夠分化成多巴胺能神經元的幹細胞來補充受損的神經元。
    • 糖尿病: 移植能分化成胰島 beta 細胞的幹細胞，以恢復胰島素分泌。
  • 血液疾病: 如通過造血幹細胞移植 (HSCT) 治療白血病、淋巴瘤和某些遺傳性血液病。
• 限制:
  • 腫瘤形成風險: 幹細胞，尤其是多能幹細胞，在體內可能不受控制地增殖，形成腫瘤（畸胎瘤）。
  • 免疫排斥: 如果使用的幹細胞來自非患者自身（異體移植），可能引發嚴重的免疫排斥反應，需要免疫抑制治療。
  • 分化效率與整合: 幹細胞在體內的 الأخيرة分化效率、存活率以及與宿主組織的整合是挑戰。
  • 倫理問題: 使用胚胎幹細胞 (ESCs) 存在倫理爭議。

2. 免疫細胞治療 (Immune cell therapy)

Western Blotting (WB) 是一種用於檢測特定蛋白質的實驗技術。實驗結果不理想時，需要系統性地分析問題並進行排除。

(a) 無訊號或訊號微弱 (No signal or weak signal)

若 WB 結果沒有看到目標蛋白質的條帶，或條帶非常淡，可能的原因和對應的排除方法如下：

1. 蛋白質樣品問題:

   • 蛋白質含量不足: 樣品中目標蛋白質的濃度太低。
     • 排除: 增加樣品上樣量；優化細胞裂解或組織提取步驟，提高蛋白質回收率；考慮表達外源蛋白質。
   • 蛋白質降解: 目標蛋白質在樣品製備或實驗過程中被蛋白酶降解。
     • 排除: 在裂解緩衝液中加入足夠的蛋白酶抑制劑 (protease inhibitors)；使用新鮮樣品；快速處理樣品並儲存於低溫。
   • 樣品未正確加載: 樣品未進入凝膠或在電泳過程中丟失。
     • 排除: 檢查上樣孔是否堵塞；確保樣品均勻混合；電泳過程中監測樣品條帶（如使用染料）。

2. 轉印問題 (Transfer problem):

   • 轉印效率低: 蛋白質未能有效地從凝膠轉移到膜上。
     • 排除: 檢查轉印緩衝液配方和 pH 值；確保 PVDF 或 NC 膜與凝膠的接觸良好；優化轉印時間和電壓/電流；檢查轉印裝置是否正常工作（例如冷卻系統）。
   • 轉印方向錯誤: 蛋白質轉移到錯誤的一面，或未轉移。
     • 排除: 仔細檢查轉印膜和凝膠在轉印裝置中的放置方向（通常黑色對黑色，紅色對紅色）。

3. 封閉問題 (Blocking problem):

   • 封閉不充分: 膜上的非特異性結合位點未被有效封閉，導致後續抗體結合時背景高。
     • 排除: 延長封閉時間；使用更高濃度的封閉劑（如脫脂奶粉或 BSA）；確保封閉劑與緩衝液兼容。

4. 抗體問題:

   • 一抗識別能力差或失效: 一抗濃度過低、抗體失效（儲存不當）、或者抗體與目標蛋白質不兼容。
     • 排除: 驗證抗體批次信息和推薦稀釋比例；優化一抗稀釋比例和孵育時間/溫度；嘗試不同供應商的抗體；使用陽性對照樣品驗證抗體。
   • 二抗識別能力差或失效: 二抗與一抗不匹配，或二抗本身失效。
     • 排除: 確保二抗能特異性識別一抗的物種來源；驗證二抗稀釋比例和孵育條件；嘗試其他二抗。
   • 抗體稀釋比例不當: 過高或過低的稀釋比例。
     • 排除: 系統性優化一抗和二抗的稀釋比例。

5. 顯影問題 (Detection problem):

   • 顯影劑濃度或孵育時間不當: 顯影劑濃度太低或孵育時間太短，導致訊號產生不足。
     • 排除: 確保顯影劑新鮮並按說明配製；優化顯影劑孵育時間（觀察條帶出現和背景增加的平衡點）。
   • 顯影劑失效: 顯影劑過期或儲存不當。
     • 排除: 使用新鮮的顯影劑。
   • 信號淬滅: 在顯影或成像過程中，訊號因光照或化學反應而減弱。

SARS-CoV-2 是一種引起 COVID-19 的新型冠狀病毒，其感染機制、複製過程及檢測方法如下：

SARS-CoV-2 的感染機制：

1. 進入人體細胞 (Entry into human cells):

   • 受體結合: SARS-CoV-2 的刺突蛋白 (Spike protein, S protein) 是其進入細胞的關鍵。S 蛋白的受體結合域 (RBD) 會與人體細胞表面的 ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2) 受體結合。ACE2 受體在人體多種器官的細胞上都有表達，包括肺部（尤其是 II 型肺泡細胞）、心臟、腎臟、腸道等，這解釋了 COVID-19 的多器官損害。
   • 蛋白酶切割: S 蛋白的結合並不足以直接介導細胞進入，還需要宿主細胞的蛋白酶（如 TMPRSS2 - Transmembrane Serine Protease 2）對 S 蛋白進行切割（活化）。TMPRSS2 能夠在細胞膜表面切割 S 蛋白，使其釋放融合肽，從而促進病毒包膜與細胞膜的融合。另一種潛在的進入途徑是通過內吞作用，此過程可能涉及溶酶體蛋白酶（如 Cathepsins）。

2. 病毒複製 (Viral replication):

   • 釋放基因組: 一旦病毒進入細胞，其 RNA 基因組就會被釋放到細胞質中。
   • 基因組翻譯: 病毒 RNA 基因組首先被翻譯成兩條大的多順位 RNA (poly-cistronic RNA)，分別是 ORF1a 和 ORF1b。這些 RNA 被翻譯成包含 16 個非結構蛋白 (non-structural proteins, nsp1-16) 的複合物，這些蛋白隨後會進行自我切割，產生病毒複製所需的關鍵酶，如 RNA 依賴性 RNA polymerase (RdRp)。
   • RNA 複製與轉錄: RdRp 負責複製病毒的 RNA 基因組，並轉錄出多種亞基因組 mRNA (subgenomic mRNAs)。這些亞基因組 mRNA 攜帶病毒結構蛋白（如 S, E, M, N 蛋白）和輔助蛋白的編碼信息。

以下是各名詞的簡要說明：

(1) NETosis (Neutrophil Extracellular Trap formation)

NETosis 是指一種由中性粒細胞 (neutrophil) 啟動的程序性細胞死亡模式。在此過程中，中性粒細胞會釋放出其細胞核中的染色質（DNA）、組蛋白和各種細胞質蛋白（如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶）到細胞外，形成網狀結構，稱為中性粒細胞胞外陷阱 (Neutrophil Extracellular Traps, NETs)。NETs 的主要功能是捕捉和殺滅病原體（如細菌、真菌、病毒），並參與炎症反應和組織修復。

(2) Non-coding RNAs (ncRNAs)

非編碼 RNA (ncRNAs) 是指那些在轉錄後不被翻譯成蛋白質的 RNA 分子。雖然它們不編碼蛋白質，但 ncRNAs 在細胞調控中扮演著至關重要的角色。它們可以根據大小和功能分為兩大類：

• 小非編碼 RNA (Small ncRNAs)：包括微小 RNA (miRNAs)、小干擾 RNA (siRNAs)、小啟動子 RNA (spRNAs) 和 PIWI 相互作用 RNA (piRNAs)。它們通常參與基因表達的調控，如 mRNA 的降解或翻譯抑制（miRNAs, siRNAs），或參與基因沉默（piRNAs）。
• 長非編碼 RNA (Long ncRNAs, lncRNAs)：長度通常超過 200 個核苷酸。lncRNAs 的功能多樣，包括調控染色質結構、轉錄調控、mRNA 穩定性、蛋白質定位等，參與了細胞分化、發育和疾病過程。

(3) Exosome

外泌體 (Exosome) 是一種由細胞分泌的小型囊泡，直徑約為 30-150 納米。它們起源於細胞內的多泡體 (multivesicular bodies, MVBs)，當 MVBs 與細胞質膜融合時，其內含的囊泡就會被釋放到細胞外。外泌體攜帶有來自母細胞的蛋白質、脂質和 RNA (包括 mRNA 和 miRNA)。