113 年 國立成功大學臨床醫學研究所《分子生物學》

本題主要考驗考生對 2023 年諾貝爾獎得主的研究貢獻，以及 SARS-CoV-2 的感染機制與檢測方法的理解。

第一部分：mRNA 疫苗與核苷酸鹼基修飾的意義與影響 (10%)

• 核心觀念： mRNA 疫苗的開發與核苷酸鹼基修飾在降低免疫原性、提升轉譯效率方面的關鍵作用。
• 意義與影響：
  • 生物醫學研究的意義： Katalin Karikó 和 Drew Weissman 的研究發現，直接遞送的 mRNA 在體內會引發強烈的免疫反應，導致細胞死亡和低效率的蛋白質表現。他們發現，透過修飾 mRNA 中的核苷酸鹼基（例如將假尿嘧啶核苷，pseudouridine，取代尿嘧啶，uridine），可以顯著降低 mRNA 的免疫原性，使其在體內更穩定，並能更有效地表現出目標蛋白質。這項發現為開發非病毒載體的基因治療和疫苗技術奠定了基礎，開創了新的研究領域。
  • mRNA 疫苗領域的影響： 這一突破是 COVID-19 mRNA 疫苗（如輝瑞/BioNTech 和 Moderna 的疫苗）得以快速開發和廣泛應用的關鍵。核苷酸鹼基修飾使得 mRNA 疫苗能夠在不觸發強烈有害免疫反應的情況下，有效誘導針對 SARS-CoV-2 棘蛋白的免疫保護。這不僅加速了 COVID-19 疫情的控制，也為未來開發針對其他傳染病、癌症甚至遺傳疾病的 mRNA 療法打開了大門。
• 【答案】 Katalin Karikó 和 Drew Weissman 的研究發現，透過修飾 mRNA 中的核苷酸鹼基（如使用假尿嘧啶核苷）可以降低其免疫原性並提高蛋白質表現效率。這項發現對於生物醫學研究意義重大，它克服了直接遞送 mRNA 的主要障礙，為基因治療和疫苗開發提供了新的平台。在 mRNA 疫苗領域，這項技術是 COVID-19 mRNA 疫苗成功的關鍵，使其能夠安全有效地誘導免疫反應，並為開發針對其他疾病的 mRNA 療法鋪平了道路。

第二部分：SARS-CoV-2 的感染機制與檢測方法 (15%)

• 核心觀念： 病毒如何進入細胞、在細胞內複製，以及常用的檢測方法。
• SARS-CoV-2 感染機制：
  1. 進入細胞： SARS-CoV-2 病毒顆粒透過其表面的棘狀蛋白（Spike protein, S protein）與人體細胞表面的血管張力素轉化酶 2（Angiotensin-converting enzyme 2

本題考驗考生對 CRISPR/Cas9 技術的理解及其在分子生物學中的應用。

• 核心觀念： CRISPR/Cas9 是一種基因編輯工具，能夠精確地在 DNA 上進行切割和修飾。
• CRISPR/Cas9 技術描述：
  CRISPR/Cas9 系統最初是細菌和古細菌對抗病毒（噬菌體）的一種免疫機制。在基因編輯技術中，它被改造為一個強大的工具，主要包含兩個關鍵組件：
  1. Cas9 蛋白質： 是一種 DNA 核酸酶（nuclease），能夠切割雙鏈 DNA。
  2. 導向 RNA (guide RNA, gRNA)： 是一個小分子 RNA，由兩部分組成：
     • crRNA (CRISPR RNA)： 包含一段約 20 個核苷酸的序列，可以與目標 DNA 序列互補配對，引導 Cas9 蛋白質到達目標位置。
     • tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)： 負責與 Cas9 蛋白質結合，並與 crRNA 形成一個複合物。
       在基因編輯應用中，這兩部分 RNA 通常被設計成一個單一的嵌合體分子，稱為單導向 RNA (single-guide RNA, sgRNA)。當 sgRNA 與 Cas9 蛋白質結合後，sgRNA 的目標識別序列會尋找並結合到基因組中與之互補的 DNA 序列。一旦結合，Cas9 蛋白質就會在其識別的目標位點附近切割雙鏈 DNA，產生 DNA 斷裂（double-strand break, DSB）。
• 在分子生物學中的應用：
  CRISPR/Cas9 技術具有前所未有的精確性、效率和易用性，在分子生物學研究中應用廣泛，包括：

本題考驗考生對細胞治療的定義，以及其在人類疾病治療中的潛在應用與限制。

• 核心觀念： 細胞治療是利用活細胞來治療疾病的一種方法，具有潛力但也有挑戰。

• 細胞治療定義：
  細胞治療（Cell therapy）是一種利用活細胞來預防、治療或修復疾病的醫學療法。這些細胞可以來自患者自身（自體細胞，autologous），也可以來自捐贈者（異體細胞，allogeneic）。細胞治療的目標是透過引入、替換、修復或增強細胞功能來恢復組織或器官的正常生理狀態，或增強身體對疾病的抵抗能力。

• 潛在應用與限制的兩個例子：

  1. 範例一：CAR-T 細胞療法 (Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy)
     • 潛在應用：
       CAR-T 細胞療法在治療某些血液癌症（如 B 細胞淋巴瘤、急性淋巴性白血病）上取得了顯著成功。此療法透過基因工程改造患者自身的 T 細胞，使其表達嵌合抗原受體（CAR），能夠特異性識別並攻擊癌細胞表面的抗原。對於許多對傳統療法無效的晚期癌症患者，CAR-T 療法提供了新的治癒希望。
     • 限制：
       • 細胞因子風暴 (Cytokine Release Syndrome, CRS)： 這是 CAR-T 療法最嚴重的副作用之一，由大量被激活的 T 細胞釋放細胞因子引起，可能導致發燒、低血壓、器官功能障礙，甚至危及生命。
       • 神經毒性 (Immune Effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome, ICANS)： 另一種嚴重的副作用，表現為意識模糊、癲癇、語言障礙等神經系統症狀。
       • 高昂的成本和複雜的製備過程： CAR-T 細胞的製備需要從患者體內提取 T 細胞，在實驗室進行基因改造，然後擴增，再回輸給患者，過程複雜且成本極高，限制了其廣泛應用。

本題考驗考生對測量細胞增生（cell proliferation）的幾種常用方法的理解，及其在敏感度、再現性及高通量方面的差異。

• 核心觀念： 細胞增生是細胞分裂的過程，有多種方法可以量化細胞分裂的速度和數量。

• 三種不同的細胞增生測量方法：

  1. DNA 合成測量法 (例如：BrdU 摻入法)

     • 原理： 在細胞分裂週期的 S 期（DNA 合成期），細胞會合成新的 DNA。這種方法通過在培養基中加入標記的核苷酸類似物（如溴脫氧尿苷, Bromodeoxyuridine, BrdU），讓正在進行 DNA 合成的細胞將 BrdU 摻入其新合成的 DNA 中。隨後，利用特異性抗體（anti-BrdU antibody）來檢測細胞內或細胞表面的 BrdU 標記，從而定量或定性地指示細胞的增生情況。
     • 優點： 能夠區分處於 S 期的細胞，提供細胞週期資訊；相較於簡單的細胞計數，能更精確地反映細胞的實際分裂活動。
     • 缺點： 需要細胞固定（fixation）和透化（permeabilization）步驟來讓抗體進入細胞；測量的是 DNA 合成，而非細胞分裂完成。
     • 適用性： 常用於研究細胞週期的調控、藥物對細胞增生的影響等。

  2. 細胞計數法 (Cell Counting)

     • 原理： 這是最直接的細胞增生測量方法。通過在不同時間點對細胞進行採樣，然後直接計數細胞的總數。這可以通過手工計數（使用血球計數盤）或自動細胞計數儀來完成。也可以通過測量細胞的總蛋白含量或 DNA 含量來間接估計細胞數。
     • 優點： 操作簡單，直觀，不需要特殊試劑（除非進行間接測量）。
     • 缺點： 難以區分活細胞和死細胞（除非結合染色）；無法提供細胞週期的詳細資訊；對於體積小的細胞，計數精度可能受影響；高通量應用受限。
     • 適用性： 適用於一般性的細胞培養監測，或在其他更精確方法無法進行時作為替代。

本題考驗考生對分子生物學中五個重要概念的掌握程度。

• 核心觀念： 這五個術語代表了細胞內重要的生理過程、細胞間通訊機制、細胞器以及細胞狀態。

  1. 自噬 (Autophagy)

     • 定義： 自噬是一種細胞內的自我降解過程，細胞會將受損的細胞器、聚集的蛋白質或其他細胞質成分包裹在雙層膜結構（自噬體，autophagosome）中，然後自噬體與溶酶體（lysosome）融合，將包裹的內容物降解成基本組成單元（如胺基酸、脂肪酸），以便細胞重新利用或排出。
     • 功能： 在細胞維持穩態（homeostasis）、應對營養不良、清除細胞內廢物和病原體、維持細胞健康等方面起著關鍵作用。過度活躍或功能失調的自噬與多種疾病（如神經退化性疾病、癌症、感染性疾病）有關。

  2. 細胞凋亡 (Apoptosis)

     • 定義： 細胞凋亡，又稱程式性細胞死亡（programmed cell death），是一種受嚴格調控的細胞自我毀滅過程。在這個過程中，細胞會經歷一系列形態學和生化學的改變，包括細胞體積縮小、染色質濃縮、DNA 片段化、細胞膜起泡形成凋亡小體（apoptotic bodies），最終被吞噬細胞清除，而不會引起炎症反應。
     • 功能： 對於生物體的發育、組織穩態的維持、清除受損或感染的細胞、防止癌症發生等至關重要。

  3. 外泌體 (Exosome)

     • 定義： 外泌體是細胞分泌的一類微小的脂質雙層囊泡，直徑約 30-150 奈米。它們起源於細胞內體（endosomes）形成的多泡體（multivesicular bodies, MVBs），當多泡體與細胞膜融合時，其中的小囊泡（即外泌體）被釋放到細胞外。
     • 功能： 外泌體攜帶細胞來源的蛋白質、RNA（包括 mRNA 和 microRNA）和 DNA，能夠在細胞之間傳遞訊息，影響接收細胞的生理功能。

本題考驗考生對分子生物學和免疫學中五種常用實驗技術的理解。

• 核心觀念： 這五種技術是現代生物學研究中用於檢測、定量和分析生物分子（蛋白質、核酸）及細胞的重要工具。

  1. 酶聯免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

     • 原理： ELISA 是一種基於抗原-抗體特異性結合的免疫學檢測方法，結合了酶標記的免疫反應和吸附技術。通常，抗體或抗原會被吸附到固相載體（如微量滴定盤）上。然後，通過一系列的抗體孵育和洗滌步驟，利用酶標記的抗體來檢測目標分子（抗原或抗體）的存在與否，以及其含量。最後，加入酶的底物，酶催化底物反應產生可測量的訊號（如顏色變化、螢光或化學發光），訊號強度與目標分子的濃度成正比。
     • 應用： 廣泛用於檢測血清或體液中的抗體或抗原，如診斷傳染病（如 HIV、Hepatitis B）、檢測激素、蛋白質、細胞因子等。

  2. 蛋白質印跡法 (Western blot)

     • 原理： Western blot 是一種用於檢測特定蛋白質在蛋白質混合物中是否存在及其相對數量的技術。其步驟包括：
       1. 蛋白質樣品製備與電泳： 從細胞或組織中提取蛋白質，並通過 SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳）將蛋白質按分子量大小分離。
       2. 轉膜 (Transfer)： 將凝膠中的蛋白質轉移到固相膜（如硝酸纖維素膜或 PVDF 膜）上，以便於後續的抗體結合。
       3. 封阻 (Blocking)： 使用非特異性蛋白質（如脫脂奶粉或 BSA）來封阻膜上未與蛋白質結合的位點，防止抗體與膜發生非特異性結合。
       4. 一抗孵育 (Primary Antibody Incubation)： 加入特異性識別目標蛋白質的一抗。
       5. 二抗孵育 (Secondary Antibody Incubation)： 加入標記有酶（如辣根過氧化物酶 HRP 或鹼性磷酸酶 AP）或螢光基團的二抗，該二抗能識別並結合一抗。
       6. 顯色 (Detection)： 加入酶的底物，產生可見訊號（如顏色或光），訊號的強度反映了目標蛋白質的相對含量。
     • 應用： 確認特定蛋白質的存在、評估蛋白質的相對表達水平、檢測蛋白質的翻譯後修飾（如磷酸化）。

  3. 即時定量 PCR (Real-time PCR, qPCR)

     • 原理： qPCR（也稱為定量 PCR）是一種在 PCR 擴增過程中，通過螢光訊號實時監測 DNA 產物量的技術。螢光訊號的產生有兩種主要方式：