109 年 國立成功大學臨床醫學研究所《分子生物學》

本題主要考驗學生對 2018 年諾貝爾生理學或醫學獎得主 James P. Allison 和 Tasuku Honjo 的重要發現及其在癌症治療上的應用與影響的理解。

核心觀念：免疫檢查點抑制劑 (Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs) 在癌症治療中的角色。

詳解：
James P. Allison 和 Tasuku Honjo 分別獨立發現了 T 細胞活化過程中存在的免疫檢查點，以及如何利用抑制這些檢查點的藥物來治療癌症。

1. James P. Allison 的發現：

   • 重要發現：Allison 教授研究 T 細胞的活化機制，他發現 CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 是一種 T 細胞表面的受體，它能夠抑制 T 細胞的活化。CTLA-4 就像是 T 細胞的「煞車」，當它與其配體結合時，會阻止 T 細胞對癌細胞的免疫反應。
   • 意義與影響：Allison 團隊開發了一種抗體，可以阻斷 CTLA-4 和其配體的結合，從而解除 T 細胞的抑制，讓 T 細胞能夠更有效地識別並攻擊癌細胞。這種療法被稱為免疫檢查點阻斷療法 (immune checkpoint blockade therapy)，其代表藥物是 ipilimumab (商品名 Yervoy)。這項發現開創了利用人體自身免疫系統對抗癌症的新紀元，尤其在治療轉移性黑色素瘤等頑固性癌症方面取得了顯著成效。

2. Tasuku Honjo 的發現：

   • 重要發現：Honjo 教授則發現了 PD-1 (Programmed cell death protein 1)，這是另一個重要的免疫檢查點。

本題考驗學生對誘導式多能幹細胞 (induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs) 的定義、特性、應用潛力及限制的理解。

核心觀念：iPSCs 的生成、特性與應用。

詳解：
定義與描述：
誘導式多能幹細胞 (iPSCs) 是指透過體外實驗室技術，將已分化的體細胞（如皮膚細胞、血液細胞）重新程式化，使其恢復到類似胚胎幹細胞 (Embryonic Stem Cells, ESCs) 的多能性狀態。這個過程通常是透過導入特定的轉錄因子（如 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc，即 Yamanaka factors）來實現的。iPSCs 具有兩個關鍵特性：

1. 自我更新能力 (Self-renewal)：能夠無限制地增殖。
2. 多能性 (Pluripotency)：能夠分化成體內所有類型的細胞（如神經細胞、心肌細胞、肝細胞、血細胞等），形成構成身體的各種組織和器官。

潛在應用舉例：
iPSCs 的最大潛力在於「細胞替代療法」(cell replacement therapy) 和「疾病模型研究」。

• 細胞替代療法：對於因細胞損傷或死亡而導致的疾病，例如帕金森氏症（多巴胺能神經元丟失）、糖尿病（胰島 β 細胞功能喪失）、心肌梗塞（心肌細胞壞死）、脊髓損傷（神經元受損）等，可以利用患者自身的體細胞誘導成 iPSCs，然後將這些 iPSCs 分化成目標細胞（如多巴胺能神經元、胰島細胞、心肌細胞、神經細胞），再移植回患者體內，以修復受損組織或器官的功能。
  • 舉例：治療帕金森氏症。

本題考驗學生對 CRISPR-Cas9 基因編輯技術的定義、原理及作用機制的理解。

核心觀念：CRISPR-Cas9 系統的組成、引導 RNA (gRNA) 的作用、Cas9 核酸酶的切割機制，以及 DNA 修復途徑。

詳解：
CRISPR 基因編輯的定義：
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 基因編輯是一種強大、精確且相對容易使用的基因組編輯技術。它最初是細菌和古細菌用來對抗病毒感染的一種適應性免疫系統。科學家們利用其原理，將這個系統改造，使其能夠精確地在目標 DNA 位置進行切割，進而實現基因的插入、刪除、替換或修正。最常用的是 CRISPR-Cas9 系統。

CRISPR-Cas9 的工作原理：
CRISPR-Cas9 系統主要由兩個關鍵組件構成：

1. Cas9 核酸酶 (Cas9 nuclease)：這是一種能夠切割 DNA 的蛋白質，它像一把「分子剪刀」。
2. 導引 RNA (guide RNA, gRNA)：這是一個短的 RNA 分子，由兩部分組成：
   • CRISPR RNA (crRNA)：包含約 20 個鹼基的序列，這個序列與目標 DNA 序列互補，負責將 Cas9 導向基因組中的特定位置。
   • 反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)：它與 crRNA 結合，並幫助 crRNA 和 Cas9 結合，形成一個功能性的 CRISPR-Cas9 複合物。在實驗室中，通常將 crRNA 和 tracrRNA 融合為一個單一的「單一導引 RNA」(single guide RNA, sgRNA)。

工作流程：

1. 目標識別：設計一個與目標 DNA 序列互補的 gRNA。當 gRNA 與 Cas9 蛋白質結合後，這個複合物會在細胞內搜尋與 gRNA 序列匹配的 DNA 目標位點。

本題考驗學生對外泌體 (exosomes) 的定義、功能以及其在醫學上的應用潛力。

核心觀念：外泌體作為細胞間訊息傳遞的載體。

詳解：
外泌體的定義：
外泌體是細胞分泌的一類微小的細胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs)，直徑通常在 30-150 奈米之間。它們起源於細胞內的多泡體 (multivesicular bodies, MVBs)，當 MVBs 與細胞質膜融合時，其內部的囊泡（即外泌體）就被釋放到細胞外。外泌體包裹著來自母細胞的蛋白質、脂質、mRNA 和 microRNA (miRNA) 等生物分子。

外泌體的功能：
外泌體的主要功能是作為細胞間訊息傳遞的載體。它們可以被接收細胞攝取，然後將其攜帶的分子傳遞給接收細胞，從而影響接收細胞的生理功能、基因表現或行為。

• 傳遞訊息：外泌體攜帶的分子可以調節接收細胞的蛋白質合成、基因表現、細胞週期、免疫反應等。
• 參與生理過程：它們在組織發育、免疫調節、神經傳導、血管生成等許多生理過程中發揮作用。
• 參與病理過程：在外泌體的功能研究中，也發現它們在疾病發展中扮演角色，例如在癌症的進展、轉移和對治療的抵抗中。

潛在應用舉例：
由於外泌體攜帶的分子訊息能反映其來源細胞的狀態，且其生物相容性高，不易引起免疫反應，它們在診斷和治療方面展現出巨大的潛力。

• 診斷應用：

本題為基本概念題，涵蓋了分子生物學與細胞生物學中的六個重要術語，要求學生簡要描述其定義與基本概念。

核心觀念：細胞治療、細胞自噬、轉譯後修飾、選擇性剪接、RNA 干擾、開放閱讀框。

詳解：
(1) Cell therapy (細胞治療)

• 定義：細胞治療是一種利用活細胞來治療或預防疾病的療法。這些細胞可以是從患者自身、捐贈者，或是實驗室中培養的細胞。
• 基本概念：細胞治療旨在修復、替換或增強受損或功能異常的細胞、組織或器官。常見的應用包括免疫細胞治療（如 CAR-T 細胞療法用於癌症治療）、幹細胞治療（用於再生醫學，修復組織損傷）等。

(2) Autophagy (細胞自噬)

• 定義：細胞自噬是一個細胞內的高度保守的降解過程，透過這個過程，細胞可以將受損的細胞器、蛋白質聚集體或外來入侵物（如病原體）包裹在雙層膜結構的自噬體 (autophagosome) 中，然後自噬體與溶酶體 (lysosome) 融合，將內容物降解並回收利用。
• 基本概念：細胞自噬是維持細胞穩態、清除細胞內有害物質、在營養缺乏時提供能量來源的重要機制。它在細胞存活、發育、免疫和疾病（如癌症、神經退行性疾病）中都扮演著關鍵角色。

(3) Post-translational modification (PTM) (轉譯後修飾)

• 定義：轉譯後修飾是指在蛋白質合成（轉譯）完成後，蛋白質所經歷的化學修飾過程。這些修飾可以改變蛋白質的結構、穩定性、活性、定位或與其他分子的相互作用。
• 基本概念：常見的 PTM 包括磷酸化 (phosphorylation)、醣基化 (glycosylation)、乙醯化 (acetylation)、甲基化 (methylation)、泛素化 (ubiquitination) 等。PTM 對調節細胞信號傳導、蛋白質功能和細胞行為至關重要。

(4) Alternative splicing (選擇性剪接)

• 定義：選擇性剪接是真核生物 mRNA 前體 (pre-mRNA) 加工過程中的一種機制。

本題為基本技術應用題，涵蓋了分子生物學和生物化學中的六種常用實驗方法，要求學生簡要描述其原理與應用。

核心觀念：即時定量 PCR、ELISA、ChIP、次世代定序、Southern blot、TA cloning。

詳解：
(1) Real time PCR (即時定量聚合酶鏈式反應)

• 定義：即時定量 PCR (Real-time PCR)，也稱為定量 PCR (qPCR)，是一種 PCR 技術，它能夠在反應過程中實時監測 PCR 產物的累積，並根據螢光訊號的強度來定量起始的 DNA 或 RNA 模板量。
• 原理與應用：通常使用螢光染料（如 SYBR Green）或螢光標記的探針（如 TaqMan probe）來偵測 PCR 產物。隨著 PCR 循環的進行，螢光訊號增強，透過繪製螢光訊號對循環數的曲線，可以計算出起始模板的量。應用廣泛，包括定量 mRNA 表達量（需先反轉錄為 cDNA）、基因分型、病原體檢測等。

(2) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (酶聯免疫吸附試驗)

• 定義：ELISA 是一種常用的免疫學檢測方法，用於檢測樣品中特定抗原或抗體的含量。
• 原理與應用：通常利用抗體與抗原之間的特異性結合。將抗原或抗體固定在固相載體（如微盤）上，然後加入樣品，再加入帶有酶標記的第二抗體。最後加入底物，酶催化底物反應產生顏色變化，顏色的強度與樣品中目標分子（抗原或抗體）的含量成正比。應用於檢測蛋白質、激素、抗體、病毒等，例如篩檢 HIV 感染、診斷過敏原。

(3) Chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) (染色質免疫沉澱試驗)

• 定義：ChIP 是一種實驗技術，用於研究蛋白質與 DNA 的相互作用。它可以確定特定蛋白質（如轉錄因子、組蛋白修飾酶）在基因組中的結合位點。
• 原理與應用：首先，將細胞內的蛋白質-DNA 複合物進行交聯（如用甲醛），然後裂解細胞，利用特定蛋白質的抗體將該蛋白質及其結合的 DNA 片段沉澱下來。洗去非特異性結合的 DNA 後，釋放出結合的 DNA 片段，再對這些 DNA 片段進行定量（如 qPCR）或定序 (如 ChIP-seq)，以識別蛋白質結合的基因組區域。應用於研究基因調控、染色質結構等。

(4) Next generation sequencing (NGS) (次世代定序)