111 年 國立成功大學臨床醫學研究所《分子生物學》

本題主要在考驗學生對於量測真核細胞基因表現的常用方法之了解。基因表現的量測通常是透過偵測 mRNA 或蛋白質的量來進行。以下將介紹五種常見的方法：

1. Northern Blotting:

   • 原理: 偵測特定 mRNA 分子的存在與相對豐度。將總 RNA 分開後，轉殖到膜上，再以帶有互補序列的放射性或螢光標記探針進行雜交。
   • 優點: 可以偵測特定大小的 mRNA，並提供相對定量的資訊。
   • 限制: 操作較為繁瑣，需要較大量的 RNA，且靈敏度不如後續發展的方法。

2. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR):

   • 原理: 結合反轉錄酵素 (RT) 將 mRNA 反轉錄成 cDNA，再利用 PCR 技術放大特定 cDNA 片段，進而偵測特定基因的表現量。
   • 變體:
     • Quantitative RT-PCR (qRT-PCR): 透過即時監測 PCR 產物的螢光訊號，精確定量 mRNA 的起始量。
     • Semi-quantitative RT-PCR: 透過比較不同循環數下的 PCR 產物量，進行半定量分析。
   • 優點: 靈敏度高，特異性強，所需樣本量少，qRT-PCR 可進行精確定量。
   • 限制: 容易受到樣本污染的影響，結果可能受 PCR 效率變異影響。

3. Microarrays (基因晶片):

   • 原理: 在一個固體載體（晶片）上固定大量已知的 DNA 探針（代表不同的基因）。將樣品 RNA 反轉錄成標記的 cDNA，然後與晶片上的探針進行雜交。

本題主要在考驗學生對幾種重要的非轉譯 RNA (non-coding RNA, ncRNA) 以及相關酵素的理解。這些 ncRNA 在基因表現調控中扮演著關鍵角色。

(a) miRNA (microRNA)

• 定義: microRNA (miRNA) 是一種長度約 21-23 個核苷酸的小分子 RNA，不具有轉譯編碼功能（非轉譯 RNA）。
• 前驅體: miRNA 最初由 DNA 轉錄為具有髮夾結構的初級轉錄本 (pri-miRNA)，然後被 Drosha 酵素在細胞核內加工成較短的前驅體 (pre-miRNA)。
• 成熟: pre-miRNA 被輸出到細胞質，由 Dicer 酵素進一步切割，形成一個雙股 RNA 分子，其中一條鏈（成熟 miRNA）會與 RISC (RNA-induced silencing complex) 結合。
• 功能: 成熟的 miRNA-RISC 複合物透過與目標 mRNA 的 3' 領導區 (3'-UTR) 上的互補序列結合，通常會導致目標 mRNA 的降解或抑制其轉譯，進而調控基因表現。miRNA 在細胞分化、發育、凋亡、代謝等眾多生物過程中都扮演重要角色。

(b) long non-coding RNA (lncRNA)

• 定義: long non-coding RNA (lncRNA) 是一類長度大於 200 個核苷酸的非轉譯 RNA。
• 多樣性: lncRNA 的結構和功能極為多樣化。它們可以位於細胞核或細胞質，並與 DNA、RNA 或蛋白質相互作用。
• 功能: lncRNA 的功能廣泛，包括：
  • 表觀遺傳調控: 作為支架分子，招募組蛋白修飾酶或 DNA 甲基轉移酶到特定基因座，調控染色質結構和基因表現（例如 XIST 基因調控 X 染色體失活）。
  • 轉錄調控: 影響轉錄因子的結合或 RNA 聚合酶的活性。
  • 轉譯後調控: 作為 microRNA 的海綿 (sponges)，結合並抑制 miRNA 的活性，間接調控基因表現。
  • 結構支架: 參與形成細胞核的小體或核仁等結構。

(c) shRNA (short hairpin RNA)

• 定義: short hairpin RNA (shRNA) 是一種人為設計的雙股 RNA 分子，具有髮夾結構，長度通常約 21-25 個核苷酸。

本題考驗學生對基因轉錄調控機制，特別是增強子 (enhancer) 和轉錄因子 (transcription factor, TF) 如何作用的理解。轉錄因子結合在啟動子 (promoter) 上游的 DNA 區域，即使距離起始位點較遠，也能夠活化轉錄。

核心觀念: 轉錄因子的活化作用並非僅限於直接與 RNA 聚合酶 II (RNA Pol II) 結合，而是透過一系列介導蛋白質的協同作用，將遠端的 DNA 結合訊號傳遞到轉錄起始複合物 (transcription initiation complex, TIC)。

以下提出幾種可能的機制：

1. 增強子 (Enhancer) 的作用:

   • 概念: 位於基因啟動子遠端（上游、下游或基因內）的 DNA 序列，能顯著增強特定基因的轉錄活性。這些序列可以結合特定的轉錄因子，稱為增強子結合蛋白 (enhancer-binding proteins)。
   • 機制: 結合在增強子上的轉錄因子，透過調節染色質結構或招募共活化因子 (co-activators)，使啟動子區域的染色質變得更開放，有利於 RNA Pol II 的結合與起始。
   • DNA 迴路 (DNA Looping): 為了讓遠端的增強子區域能夠與啟動子區域的轉錄起始複合物近距離接觸，DNA 會發生彎曲或迴路形成。這個迴路結構使得結合在增強子上的轉錄因子能夠與啟動子區域的基礎轉錄因子 (basal transcription factors) 和 RNA Pol II 發生物理上的交互作用。

2. 招募共活化因子 (Co-activators) 或 Mediator 複合物:

   • ** Mediator 複合物**: 這是關鍵的介導者。Mediator 是一個大型蛋白質複合物，能夠同時與結合在增強子上的轉錄因子和啟動子區域的 RNA Pol II 及其相關因子形成連接。

本題考驗學生對細胞間分子層級通訊機制的理解。細胞溝通是多細胞生物體維持穩態、協調功能、執行複雜生理活動的基礎。這種溝通主要透過信號分子 (signaling molecules) 的釋放與接收來實現。

以下將從信號分子的類型、傳遞途徑和細胞接收信號的機制來闡述細胞如何溝通：

一、信號分子的類型與釋放方式

信號分子種類繁多，依據其化學性質和作用距離，可分為幾大類：

1. 旁分泌 (Paracrine Signaling):

   • 信號分子: 生長因子 (growth factors)、細胞因子 (cytokines) 等。
   • 傳遞方式: 細胞釋放信號分子到細胞外基質，作用於鄰近的目標細胞。
   • 例子: 神經傳導物質 (neurotransmitters) 在突觸間隙作用於下游神經元。

2. 內分泌 (Endocrine Signaling):

   • 信號分子: 激素 (hormones)，如胰島素 (insulin)、甲狀腺素 (thyroid hormone) 等。
   • 傳遞方式: 內分泌細胞將激素釋放到血液循環中，透過血液運輸到全身，作用於遠處的目標細胞。

3. 接觸依賴性信號傳遞 (Contact-Dependent Signaling):

   • 信號分子: 膜結合分子 (membrane-bound molecules)。
   • 傳遞方式: 一個細胞表面的信號分子與另一個細胞表面的受體直接接觸，進行信號傳遞。
   • 例子: 免疫細胞之間的識別與活化，或細胞發育過程中細胞間的相互作用。

4. 突觸信號傳遞 (Synaptic Signaling):

   • 信號分子: 神經傳導物質 (neurotransmitters)。
   • 傳遞方式: 神經元釋放神經傳導物質到突觸間隙，快速、精確地傳遞信號給下一個神經元、肌肉細胞或腺體細胞。

二、信號接收與轉導 (Signal Reception and Transduction)

細胞接收信號主要依賴細胞膜或細胞內的特異性受體 (receptors)。

1. 細胞膜受體 (Cell-Surface Receptors):
   • 適用信號分子: 親水性、大分子信號分子，如胜肽激素 (peptide hormones)、生長因子、神經傳導物質等，因無法穿透細胞膜。
   • 受體類型:
     • 離子通道偶聯受體 (Ion Channel-Coupled Receptors): 如神經傳導物質受體，結合信號分子後，改變離子通道的通透性，引起膜電位的變化。

本題考驗學生對 RNA 剪接 (RNA splicing)，特別是選擇性剪接 (alternative splicing) 機制的理解，以及其對蛋白質結構、功能和生物多樣性的影響。

一、Intron 與 Exon 的角色

• Intron (內含子): 是在真核生物基因的 DNA 序列中，位於編碼區 (coding region) 或非編碼區 (non-coding region) 的 DNA 片段，在轉錄成初級 RNA 轉錄本 (pre-mRNA) 後，會被剪接掉 (spliced out)。Intron 的序列通常不直接編碼蛋白質。
• Exon (外顯子): 是在真核生物基因的 DNA 序列中，位於編碼區或非編碼區的 DNA 片段，在轉錄成 pre-mRNA 後，會被保留下來，並在剪接過程中被連接在一起，形成成熟的 mRNA (mature mRNA)。Exon 的序列（至少部分）最終會被轉譯成蛋白質。

二、選擇性剪接 (Alternative Splicing)

• 定義: 選擇性剪接是指一個基因的 pre-mRNA 可以透過不同的組合方式來剪接其外顯子，從而產生多種不同的成熟 mRNA 分子。
• 機制: 在剪接過程中，剪接體 (spliceosome) 識別 pre-mRNA 上的剪接位點 (splice sites)，即 5' 剪接位點 (donor site) 和 3' 剪接位點 (acceptor site)。對於同一個基因，不同的剪接事件可能包含或排除特定的外顯子，或者在不同的位點進行剪接。
• 調控: 選擇性剪接受到許多調控因子（如剪接因子，splicing factors，包括 RNA 結合蛋白）的影響，這些因子可以促進或抑制特定剪接位點的識別。

三、選擇性剪接對成熟蛋白質及其功能的影響

選擇性剪接是產生蛋白質多樣性的重要機制，尤其在真核生物中：

1. 產生蛋白質異構體 (Protein Isoforms):

   • 透過選擇性地包含或排除某些外顯子，可以改變 mRNA 的編碼序列。
   • 這些不同的 mRNA 在轉譯後會產生具有不同胺基酸序列的蛋白質異構體。
   • 這些異構體可能在結構、亞細胞定位、與其他分子的結合能力、酶活性或穩定性等方面有所不同。

2. 影響蛋白質功能:

   • 改變蛋白質結構域 (Protein Domains): 包含或排除特定外顯子可能導致蛋白質失去或獲得某個功能結構域，從而改變其生物活性。

本題考驗學生對 2018 年諾貝爾生理學或醫學獎得主 James P. Allison 和 Tasuku Honjo 的免疫檢查點抑制療法 (immune checkpoint inhibition therapy) 的理解。

核心觀念: 免疫系統能夠識別並清除癌細胞，但癌細胞會利用免疫檢查點 (immune checkpoints) 來逃避免疫監視。Allison 和 Honjo 的研究揭示了這些檢查點的機制，並開發了阻斷這些檢查點的療法，從而重新啟動免疫系統對抗癌症。

一、James P. Allison 的發現

• 研究對象: T 細胞上的 CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4)。
• 重要發現:
  • Allison 的實驗室發現 CTLA-4 是一種抑制 T 細胞活化的受體。簡單來說，CTLA-4 就像是 T 細胞的「煞車」。
  • 當 T 細胞被抗原活化後，CTLA-4 會被表達出來，並與 APC (Antigen-Presenting Cells) 上的 B7 結合，從而抑制 T 細胞的進一步增殖和活化，防止免疫系統過度反應，避免攻擊自身健康細胞。
• 療法開發:
  • Allison 意識到，如果能夠阻斷 CTLA-4 與 B7 的結合，就可以解除 T 細胞的「煞車」，使其能夠更有效地識別和攻擊癌細胞。
  • 他開發了一種針對 CTLA-4 的單株抗體（如 ipilimumab），這種抗體能夠結合 CTLA-4，阻止其與 B7 結合，從而增強 T 細胞對癌細胞的免疫反應。

二、Tasuku Honjo 的發現

• 研究對象: T 細胞上的 PD-1 (Programmed cell Death protein 1)。
• 重要發現:
  • Honjo 的實驗室發現 PD-1 也是一種 T 細胞上的抑制性受體。與 CTLA-4 類似，PD-1 也是免疫檢查點，其功能是抑制 T 細胞的活化，防止對自身組織的攻擊。
  • PD-1 的配體 (ligands) 包括 PD-L1 和 PD-L2。癌細胞常常過度表達 PD-L1，與腫瘤微環境中的 T 細胞上的 PD-1 結合，從而「關閉」T 細胞的殺傷力，幫助癌細胞逃避免疫系統的攻擊。
• 療法開發:

本題考驗學生對「細胞治療」(Cell Therapy) 的定義、應用與局限性的理解。

一、細胞治療的定義

細胞治療是一種利用細胞作為治療媒介的療法。其基本原理是將具有特定功能的細胞（通常是從患者自身、捐贈者，或體外培養、基因改造過的細胞）引入患者體內，以達到預防、治療疾病或修復受損組織的目的。細胞治療可以根據細胞的來源、功能和應用方式進行分類。

二、潛在應用與範例

細胞治療的應用範圍廣泛，涵蓋多種疾病領域。以下為兩個主要範例：

(1) 範例：CAR-T 細胞治療 (Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy)

• 應用領域: 主要用於治療某些類型的血癌，如 B 細胞急性淋巴性白血病 (B-ALL) 和某些淋巴瘤。
• 原理:
  • 從患者體內抽取 T 細胞。
  • 在體外，利用基因工程技術，將一種稱為「嵌合抗原受體」(Chimeric Antigen Receptor, CAR) 的基因導入 T 細胞。CAR 能夠識別癌細胞表面的特定抗原（例如，在 B 細胞白血病中是 CD19 抗原）。
  • 將經過基因改造、能夠識別並攻擊癌細胞的 CAR-T 細胞大量培養後，輸注回患者體內。
  • CAR-T 細胞在患者體內增殖，並精確地尋找並殺死帶有目標抗原的癌細胞。
• 潛在應用:
  • 血癌治療: 對於對傳統化療或幹細胞移植無效的復發性或頑固性 B 細胞白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤等，CAR-T 細胞治療已展現出極高的緩解率，甚至達到臨床治癒。
  • 實體腫瘤的探索: 研究人員正積極探索將 CAR-T 技術應用於實體腫瘤（如腦瘤、胰腺癌、卵巢癌等），但挑戰較大。
• 局限性:
  • 細胞因子風暴 (Cytokine Release Syndrome, CRS): 輸注 CAR-T 細胞後，大量被激活的 T 細胞會釋放大量細胞因子，引起嚴重的全身性發炎反應，可能導致高燒、低血壓、器官功能障礙，甚至危及生命。
  • 神經毒性 (Immune Effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome, ICANS): 部分患者可能出現神經系統副作用，如意識混亂、癲癇、水腫等。
  • 目標抗原脫失 (Antigen Escape): 癌細胞可能透過降低目標抗原的表達，逃避免疫攻擊。
  • 高昂的治療費用: CAR-T 細胞治療的製備過程複雜，成本極高。
  • 僅適用於特定癌種: 目前主要對 B 細胞惡性腫瘤有效。

本題考驗學生對「精準醫學」(Precision Medicine) 的定義、重要性及其在醫學上的應用。

一、精準醫學的定義

精準醫學是一種創新的醫療模式，它強調根據個體的基因組學、蛋白質體學、代謝體學、環境暴露、生活方式等獨特性，來為患者提供「量身訂做」的預防、診斷和治療方案。其核心思想是：「對的治療，在對的時間，給對的病人」。

與傳統的「一種藥物適用於所有患者」的模式不同，精準醫學試圖識別哪些患者最有可能從特定的治療中獲益，哪些患者可能面臨較高的副作用風險，從而優化治療效果並減少不必要的醫療支出。

二、精準醫學的重要性

1. 提高治療的有效性: 透過針對個體差異進行治療，可以選擇對特定患者最有效的藥物或療法，從而提高治療的成功率。
2. 降低副作用風險: 預測哪些患者對某些藥物可能產生不良反應，可以提前調整治療方案，避免或減輕副作用。
3. 加速藥物研發: 精準醫學的數據分析有助於識別新的藥物靶點，並加速針對特定基因突變或生物標記的藥物開發。
4. 促進疾病預防: 透過基因檢測等手段，可以預測個體罹患某些疾病的風險，從而採取早期預防措施。
5. 實現個體化醫療: 滿足了現代醫學對「一人一方」的追求，使醫療更加人性化和精確化。
6. 優化醫療資源分配: 將有限的醫療資源更有效地分配給最需要且最能獲益的患者。

三、精準醫學在醫學上的應用

精準醫學的應用已經滲透到醫學的許多領域，其中最為顯著的包括：

1. 腫瘤學 (Oncology):
   • 基因組學導向治療: 透過對腫瘤組織進行基因測序，識別特定的基因突變（如 EGFR, ALK, BRAF, HER2 等），並選擇相應的標靶藥物進行治療。例如，EGFR 突變的肺癌患者對 EGFR 抑制劑反應良好。
   • 免疫治療的選擇: 透過檢測腫瘤的 PD-L1 表達水平或腫瘤突變負荷 (TMB)，預測患者對免疫檢查點抑制劑的反應。

本題考驗學生對 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 技術的理解，包括其在自然界中的功能、作用機制以及在分子生物學中的廣泛應用。

一、CRISPR 在生物體中的功能與機制 (Natural Function and Mechanism)

CRISPR-Cas 系統最初是在細菌和古細菌中發現的一種適應性免疫系統，用於抵抗病毒（噬菌體）和質粒的入侵。

• 功能: 像細菌的「記憶庫」和「警報系統」，能夠識別並降解入侵的外源 DNA。
• 機制:
  1. 適應階段 (Adaptation Phase): 當細菌首次遭遇外源 DNA（如病毒 DNA）時，CRISPR 相關蛋白 (Cas proteins) 會將外源 DNA 的一小段片段（稱為間隔序列，spacer）整合到細菌自身 CRISPR 基因座的重複序列 (repeat sequences) 之間。這樣，細菌就「記住」了這個外源 DNA。
  2. 表達階段 (Expression Phase): 整合了間隔序列的 CRISPR 基因座被轉錄成一個長的 pre-crRNA (precursor CRISPR RNA)。這個 pre-crRNA 會被 Cas 蛋白切割，產生多個短的 crRNA，每個 crRNA 包含一個間隔序列和一部分重複序列。
  3. 干擾階段 (Interference Phase): crRNA 會與特定的 Cas 蛋白（如 Cas9）形成複合物。這個複合物會在細胞內巡邏，尋找與 crRNA 間隔序列互補的外源 DNA（例如，來自之前入侵過的病毒）。一旦識別到互補序列，Cas 蛋白就會利用其核酸酶活性，切割外源 DNA，從而阻止其複製和感染。

二、CRISPR 在分子生物學中的應用 (Application in Molecular Biology)

CRISPR-Cas 系統，特別是 CRISPR-Cas9 系統，因其精確、高效和易於操作的特性，已成為一種革命性的基因編輯工具。

• 基因組編輯 (Genome Editing):
  • 機制: 將 Cas9 核酸酶與一個引導 RNA (guide RNA, gRNA) 結合。gRNA 由兩部分組成：一個是與目標 DNA 序列互補的間隔序列 (spacer sequence)，另一個是與 Cas9 結合的骨架序列。
  • 操作: 將 Cas9 蛋白和人工設計的 gRNA 導入細胞。