111 年 國立成功大學臨床醫學研究所《生物化學》

本題主要考查學生對幾個重要的生物化學概念的理解與描述能力。

(1) Ketone bodies (酮體)：
酮體是肝臟在碳水化合物供應不足（如飢餓、糖尿病）或脂肪酸大量分解時，由乙醯輔酶 A (acetyl-CoA) 轉化而來的一組水溶性分子，主要包括乙醯乙酸 (acetoacetate)、β-羥基丁酸 (β-hydroxybutyrate) 和丙酮 (acetone)。它們是身體在特定情況下的替代能量來源，尤其能被腦部利用。
【答案】酮體是由肝臟代謝脂肪酸產生的乙醯輔酶 A 轉化而來，主要有乙醯乙酸、β-羥基丁酸和丙酮。在碳水化合物供應不足時，酮體可作為腦部等組織的能量來源。

(2) Beta oxidation (β-氧化)：
β-氧化是脂肪酸分解代謝的主要途徑，發生在粒線體基質和過氧化物酶體中。在這個過程中，脂肪酸的 β-碳原子被氧化，逐步縮短碳鏈，產生乙醯輔酶 A、NADH 和 FADH2。每經過一個循環，脂肪酸鏈會縮短兩個碳原子，並產生一分子乙醯輔酶 A。
【答案】β-氧化是脂肪酸分解代謝的過程，發生在粒線體基質和過氧化物酶體，透過連續的氧化、水合、氧化和硫解反應，將脂肪酸的碳鏈逐步縮短，每縮短兩個碳原子，產生一分子乙醯輔酶 A、NADH 和 FADH2。

(3) Wobble hypothesis (擺動假說)：
擺動假說由 Francis Crick 提出，解釋了密碼子在轉譯過程中，第三個鹼基（3' 端）與反密碼子（5' 端）之間可以發生不規則的配

本題旨在評估考生對現代生物化學與分子生物學研究中常用實驗技術的理解。

(1) Chromatin immunoprecipitation assay (ChIP, 染色質免疫沉澱法)：
ChIP 是一種用於研究蛋白質與 DNA 相互作用的技術。首先，利用甲醛等交聯劑將活細胞內的蛋白質與 DNA 進行交聯。接著，利用超聲波打斷染色質，然後使用針對特定蛋白質（如轉錄因子）的抗體進行免疫沉澱。最後，通過 PCR 或測序技術檢測與該蛋白質結合的 DNA 片段，從而確定蛋白質與 DNA 的結合位點。
【答案】染色質免疫沉澱法 (ChIP) 是一種用於研究蛋白質-DNA 相互作用的技術，透過交聯、打斷染色質、特定抗體沉澱以及 PCR 或測序分析，來鑑定特定蛋白質結合的 DNA 區域。

(2) Patient-Derived Xenograft (PDX) Models (病人來源異種移植模型)：
PDX 模型是將病人腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內建立的動物模型。這種模型能夠較好地保留原代腫瘤的組織學特徵、基因表達譜以及異質性，因此被廣泛用於腫瘤藥物篩選、藥效評估、以及研究腫瘤的發生發展機制。
【答案】病人來源異種移植模型 (PDX) 是將病人腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內建立的動物模型，其優勢在於能較好地模擬病人腫瘤的特徵，常用於藥物開發和研究。

本題要求比較並描述五組相關但有區別的生物分子或生物過程，旨在考察學生對這些概念的深入理解與辨析能力。

a. Glycoproteins (醣蛋白) vs. Proteoglycans (蛋白聚醣)：

• 相似之處：兩者都是蛋白質與碳水化合物結合形成的複合分子。
• 差異之處：
  • 醣基鏈 (Glycan chain)：醣蛋白的醣基鏈通常較短，結構多樣，連接在蛋白質的特定胺基酸殘基（如天冬醯胺、絲胺酸、蘇胺酸）上，主要影響蛋白質的摺疊、穩定性、細胞識別和免疫反應。
  • 蛋白聚醣：蛋白聚醣的核心是蛋白質，其上共價連接著一條或多條長鏈的糖胺聚醣 (glycosaminoglycans, GAGs)。GAGs 是由重複的二醣單位組成的多醣鏈，通常帶有負電荷。蛋白聚醣在細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 中扮演重要角色，提供結構支撐、調節細胞生長和分化。
• 總結：醣蛋白的醣類部分通常較小且結構複雜，而蛋白聚醣的醣類部分（GAGs）是長鏈、帶負電的多醣。

【答案】醣蛋白和蛋白聚醣均為蛋白質與碳水化合物的結合物。醣蛋白的醣基鏈通常較短，結構多樣，連接於蛋白質上，影響蛋白質功能；蛋白聚醣則由蛋白質核心連結一條或多條長鏈的帶負電的糖胺聚醣 (GAGs)，主要存在於細胞外基質中，提供結構支撐。

b. Small interfering RNAs (siRNAs, 小分子干擾 RNA) vs. MicroRNAs (miRNAs, 微小 RNA)：

• 相似之處：兩者都是長度約 21-25 個核苷酸的非編碼 RNA 分子，在細胞內參與 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi) 途徑，沉默基因表達。
• 差異之處：
  • 來源與結構：siRNAs 通常來自外源的雙鏈 RNA（如病毒 RNA 或實驗導入的雙鏈 RNA），經過 Dicer 酶切割形成。miRNAs 則由細胞內自身的基因轉錄產生，最初形成較長的 pri-miRNA，再經 Drosha 和 Dicer 酶切割形成。miRNA 前體通常形成髮夾結構。
  • 作用機制：siRNAs 主要通過與 Argonaute (Ago) 蛋白形成 RISC (RNA-induced silencing complex) 後，與目標 mRNA 發生完全或近乎完全的序列互補，導致 mRNA 被切割降解。miRNAs 則通常與 RISC 結合後，與目標 mRNA 的 3' 非轉譯區 (3' UTR) 發生不完全互補，導致 mRNA 翻譯受阻或被降解。
  • 主要功能：siRNAs 主要用於抵抗病毒感染和調控轉座子。miRNAs 則廣泛參與細胞分化、發育、增殖、凋亡等幾乎所有生理過程的調控。
• 總結：siRNAs 主要調控外源 RNA 或轉座子，機制偏向 mRNA 降解；miRNAs 調控內源基因，機制偏向抑制翻譯或 mRNA 降解，參與廣泛的細胞調控。

【答案】siRNAs 和 miRNAs 都是 21-25 nt 的非編碼 RNA，參與 RNA 干擾沉默基因。siRNAs 主要來自外源雙鏈 RNA，與目標 mRNA 完全互補，導致 mRNA 降解；miRNAs 來自內源基因，與目標 mRNA 3' UTR 部分互補，抑制翻譯或降解 mRNA，調控廣泛的細胞生理過程。

c. DNA polymerase (DNA 聚合酶) vs. RNA polymerase (RNA 聚合酶)：

• 相似之處：兩者都是聚合酶，負責合成核酸鏈。兩者都需要模板鏈來指導合成。
• 差異之處：
  • 合成的核酸類型：DNA 聚合酶合成 DNA，RNA 聚合酶合成 RNA。
  • 模板：DNA 聚合酶以 DNA 為模板。RNA 聚合酶主要以 DNA 為模板（轉錄），但某些 RNA 病毒的 RNA 聚合酶可以以 RNA 為模板（RNA 複製）。

核心觀念

真核生物轉錄因子通常具有兩類可分離的功能區：

1. DNA-binding domain（DNA 結合域）：辨認並結合特定啟動子或 enhancer 上的 DNA 序列。
2. Transcription-activation domain（轉錄活化域）：招募 RNA polymerase II、general transcription factors、Mediator 或染色質修飾複合體，以促進轉錄起始。

此題要求各列出三種不同類別，重點在於辨認其結構特徵與胺基酸組成特徵。

解題方法

作答時可將兩類 domain 分開處理：

• DNA 結合域依據「三維結構」分類。
• 轉錄活化域多依據「富含哪些胺基酸」分類。

每一類只要寫出名稱，再補上代表性結構或功能，即可構成完整答案。

DNA 結合域

1. Zinc finger domain（鋅指結構域）

鋅指由鋅離子穩定其立體結構，常見形式是由半胱胺酸與組胺酸配位，例如：

$$\mathrm{Cys_2His_2}$$

鋅指中的 α-helix 可插入 DNA 的 major groove，辨認特定鹼基序列。許多 steroid hormone receptors，例如 glucocorticoid receptor 與 estrogen receptor，都具有此類 DNA 結合域。

2. Homeodomain（同源盒結構域）

Homeodomain 通常含有約 60 個胺基酸，形成三段 α-helix。第三段 α-helix 是主要的 DNA 辨認結構，可插入 DNA 的 major groove。

此結構常見於發育相關轉錄因子，例如 homeobox proteins。部分 homeodomain 轉錄因子會利用額外的輔助結構增加 DNA 序列辨識的專一性。

3. Basic leucine zipper，bZIP（鹼性亮胺酸拉鍊結構域）

bZIP 由兩個主要部分組成：

• 鹼性區域：富含 Lys 與 Arg，直接與 DNA 結合。
• Leucine zipper：亮胺酸約每七個胺基酸重複一次，使兩條 α-helix 形成 coiled-coil，促進轉錄因子二聚化。

典型例子包括 AP-1 家族中的 Fos 與 Jun。二聚化後的結構可辨認特定 DNA 序列。

其他可接受的 DNA 結合域還包括 basic helix-loop-helix（bHLH）與 winged helix-turn-helix 等；題目只要求三類，列出上述三類即可。

轉錄活化域

本題主要考查對細胞代謝中兩個重要途徑：糖解作用 (glycolysis) 和戊糖磷酸途徑 (pentose phosphate pathway, PPP) 的理解。

Glycolysis (糖解作用)：
糖解作用是葡萄糖代謝的第一階段，發生在細胞質中。它將一分子的葡萄糖 (6 碳) 分解為兩分子的丙酮酸 (3 碳)，同時淨生成 2 分子 ATP 和 2 分子 NADH。

• 總反應式：
  葡萄糖 + 2NAD$^+$ + 2ADP + 2Pi → 2丙酮酸 + 2NADH + 2H$^+$ + 2ATP + 2H$_2$O
• 主要階段：
  1. 能量投資階段 (Energy investment phase)：需要消耗 2 分子 ATP，將葡萄糖轉化為 2 分子三碳化合物（甘油醛-3-磷酸）。
  2. 能量產生階段 (Energy payoff phase)：這 2 分子三碳化合物進一步轉化，產生 4 分子 ATP 和 2 分子 NADH。
• 重要產物：丙酮酸（可進入檸檬酸循環或發酵）、ATP（能量貨幣）、NADH（可進入電子傳遞鏈產生更多 ATP）。
• 意義：糖解作用是 ATP 的主要來源，尤其在無氧條件下，其產物丙酮酸可通過發酵（如產生乳酸或乙醇）來再生 NAD$^+$，使得糖解得以持續進行。

Pentose Phosphate Pathway (PPP, 戊糖磷酸途徑)：
戊糖磷酸途徑是葡萄糖的另一種代謝途徑，也發生在細胞質中。它主要有兩個分支：氧化分支和非氧化分支。

• 主要功能：
  1. 產生 NADPH：氧化分支將葡萄糖-6-磷酸氧化生成 NADPH。NADPH 在細胞內有多種重要功能，包括作為還原劑參與脂肪酸、類固醇的合成，以及清除活性氧物種 (ROS) 的解毒作用（通過穀胱甘肽還原酶）。

本題要求描述四種常用蛋白質純化技術的原理，即離子交換層析、疏水相互作用層析、凝膠過濾層析和親和層析。

1. Ion exchange chromatography (離子交換層析)：

• 原理：基於蛋白質表面所帶的淨電荷差異進行分離。層析介質帶有固定的離子基團。
  • 陽離子交換劑 (Cation exchanger)：介質帶負電荷（如 -SO$_3^-$），能夠吸附帶正電荷（鹼性）的蛋白質。
  • 陰離子交換劑 (Anion exchanger)：介質帶正電荷（如 -N(CH$_3$)$_3^+$），能夠吸附帶負電荷（酸性）的蛋白質。
• 分離過程：
  1. 樣品溶解在低離子強度緩衝液中，蛋白質與介質結合。
  2. 洗去未結合的雜質。
  3. 通過增加緩衝液中的鹽濃度（如 NaCl）或改變 pH 值，減弱蛋白質與介質之間的靜電相互作用，使蛋白質逐步洗脫下來。鹽離子競爭性地結合介質，pH 值的改變會影響蛋白質的淨電荷。
• 分離依據：蛋白質的淨電荷，這取決於其等電點 (pI) 和緩衝液的 pH 值。

2. Hydrophobic interaction chromatography (HIC, 疏水相互作用層析)：

• 原理：基於蛋白質表面疏水性殘基的差異進行分離。層析介質帶有疏水性基團（如苯基、辛基）。
• 分離過程：
  1. 樣品溶解在高離子強度緩衝液中（例如，高濃度的鹽，如硫酸銨），這會增強蛋白質表面的疏水區域與介質上的疏水基團之間的相互作用，使蛋白質結合到介質上。
  2. 洗去未結合的雜質。
  3. 通過降低緩衝液的鹽濃度，減弱蛋白質與介質之間的疏水相互作用，使蛋白質逐步洗脫下來。
• 分離依據：蛋白質表面的疏水性程度。

3. Gel filtration chromatography (GFC, 凝膠過濾層析) / Size exclusion chromatography (SEC, 尺寸排阻層析)：

本題考查對離子泵 (ion pumps) 的理解，特別是 Na$^+$-K$^+$ ATP 酶和 Ca$^{2+}$ ATP 酶為何只能單向運輸離子。

(Na$^+$-K$^+$)-ATPase 和 Ca$^{2+}$ ATP 酶都屬於 P 型 ATP 酶 (P-type ATPases)，它們通過 ATP 水解提供能量來運輸離子，並且運輸方向是單向的，這是由它們的催化機制和構象變化決定的。

核心原理：ATP 水解耦聯的構象變化與離子結合/釋放

這兩種 ATP 酶的運輸機制都涉及一個循環，該循環包含以下關鍵步驟：

1. 離子結合 (Ion binding)：ATP 酶處於一個特定的構象狀態（例如，E1 構象），該構象能夠與細胞內側的特定離子（如 Na$^+$ 或 Ca$^{2+}$）以較高的親和力結合。
2. ATP 結合與磷酸化 (ATP binding and phosphorylation)：ATP 結合到酶的 ATP 結合位點。隨後，ATP 中的磷酸基團被轉移到酶的特定酸性殘基（通常是天冬氨酸）上，形成一個磷酸酶中間體（磷酸化的酶，E1~P）。這個磷酸化步驟是 ATP 水解過程的一部分，為離子運輸提供能量。
3. 構象轉變 (Conformational change)：磷酸化導致酶發生構象變化，從 E1 轉變為另一種構象（例如，E2 構象）。這種構象轉變伴隨著離子結合位點的結構改變，使得酶對細胞內側離子的親和力大大降低，而對細胞外側離子的親和力增加。
4. 離子釋放 (Ion release)：由於親和力的降低，結合在酶上的離子（如 Na$^+$ 或 Ca$^{2+}$）被釋放到細胞外側。
5. 去磷酸化與恢復構象 (Dephosphorylation and recovery of conformation)：在 E2 構象下，磷酸基團被水解（去磷酸化），這使得酶恢復到初始的 E1 構象，同時對細胞外側離子的親和力降低，對細胞內側離子的親和力再次升高，準備結合下一輪的離子。

為何是單向運輸？

• 定向的構象變化：從 E1 到 E2 的構象轉變是高度定向的，並且是由 ATP 的水解（磷酸化）所驅動的。一旦磷酸化發生，酶就「鎖定」在 E2 構象，直到去磷酸化後才能恢復到 E1。

本題考查對真核細胞蛋白質運輸途徑的理解，特別是從內質網 (RER) 到其最終目的地的運輸過程，涉及膜蛋白和分泌蛋白。

核心概念：分泌蛋白與膜蛋白的共同起點——內質網 (RER)

分泌蛋白和大多數膜蛋白在合成過程中，其信號肽會引導核糖體-mRNA-多肽鏈複合物轉運至粗糙內質網 (Rough Endoplasmic Reticulum, RER) 的膜上。蛋白質隨後通過蛋白轉位通道 (translocon) 進入內質網腔 (lumen) 或插入內質網膜。

運輸過程：

1. 內質網 (RER) 中的加工與摺疊：

   • 摺疊：進入內質網腔的分泌蛋白和插入膜的膜蛋白，在這裡會進行正確的摺疊。許多蛋白質的摺疊需要分子伴侶 (chaperones) 的協助，例如 BiP (Binding immunoglobulin protein)。
   • 醣基化 (Glycosylation)：許多分泌蛋白和膜蛋白會在內質網腔內進行 N-連鎖醣基化，即將預先合成的寡醣鏈添加到蛋白質的特定天冬醯胺殘基上。這有助於蛋白質的正確摺疊、穩定性和運輸。
   • 二硫鍵形成 (Disulfide bond formation)：在內質網腔內，蛋白質的半胱氨酸殘基之間可以形成穩定的二硫鍵，這對於許多蛋白質的穩定性至關重要。
   • 品質控制 (Quality control)：內質網具有嚴格的品質控制機制。如果蛋白質未能正確摺疊或組裝，它們會被保留在內質網中，並可能被重新摺疊，或被標記（如通過 N 醣的修飾）後被送往細胞質中的泛素-蛋白酶體系統降解 (ER-associated degradation, ERAD)。

2. 從內質網到高爾基體 (Golgi apparatus) 的運輸：

   • 正確摺疊和修飾的蛋白質通過囊泡運輸 (vesicular transport) 從內質網運輸到高爾基體。