109 年 國立成功大學臨床醫學研究所《生物化學》

維生素 E 是一群脂溶性抗氧化劑的總稱，主要指的是生育醇 (tocopherols) 和生育三烯酚 (tocotrienols)。其主要功能在於保護細胞膜免受自由基的氧化損傷。

核心觀念：維生素 E 的抗氧化作用機制。

解題過程：
維生素 E 的主要功能為：

1. 抗氧化劑 (Antioxidant)：維生素 E 存在於細胞膜的脂質雙層中，能有效地清除自由基，特別是過氧脂質自由基 (peroxyl radicals)。它能捐贈一個氫原子給自由基，使其穩定化，從而防止細胞膜的脂質過氧化 (lipid peroxidation)，保護細胞膜的結構和功能。

蛋白質的轉譯後修飾 (Posttranslational Modification, PTM) 是指在核糖體上合成多肽鏈後，所發生的一系列化學變化，這些變化會影響蛋白質的結構、穩定性、活性、定位以及與其他分子的交互作用。

核心觀念：蛋白質合成後的修飾過程及其意義。

解題過程：
蛋白質合成（轉譯）後，新生多肽鏈 (polypeptide chain) 必須經過一系列的加工和修飾，才能成為具有完整生物功能的蛋白質。這些過程統稱為轉譯後修飾。

常見的轉譯後修飾包括：

1. 化學修飾 (Chemical Modifications)：
   • 磷酸化 (Phosphorylation)：在絲胺酸 (Ser), 蘇胺酸 (Thr), 或酪胺酸 (Tyr) 殘基上加入磷酸基團，常作為信號傳導的開關。
   • 乙醯化 (Acetylation)：在胺基酸的胺基上加入乙醯基，常見於組蛋白，影響基因表現。
   • 甲基化 (Methylation)：在胺基酸的側鏈上加入甲基，如組蛋白的甲基化。
   • 醣基化 (Glycosylation)：在蛋白質上加入醣鏈，形成醣蛋白 (glycoproteins)，影響蛋白質的摺疊、穩定性、細胞識別和免疫反應。
   • 泛素化 (Ubiquitination)：將泛素 (ubiquitin) 蛋白質連接到目標蛋白質上，常標記蛋白質進行降解。

核心觀念

RNA 可藉由互補鹼基配對形成局部雙股區域。配對的兩股必須呈反向平行：一股沿 $5' \to 3'$ 方向排列時，另一股須沿 $3' \to 5'$ 方向排列。RNA 單股可折疊成髮夾結構，使同一分子上方向相反的兩段互補序列配對。

解題方法

依圖上的 $5'$、$3'$ 標記判讀配對區兩側的方向。若兩段配對序列方向相同，便不符合反向平行的配對方式；若一段為 $5' \to 3'$、另一段為 $3' \to 5'$，則方向符合 RNA 配對條件。

核醣體 (Ribosome) 是細胞質中負責蛋白質合成的細胞器，由核醣體 RNA (rRNA) 和蛋白質組成，分為兩個亞基：大亞基 (large subunit) 和小亞基 (small subunit)。

核心觀念：核醣體的組成、結構與功能。

解題過程：
核醣體是細胞中製造蛋白質的分子機器。它由兩個大小不同的亞基組成，這兩個亞基在蛋白質合成時會結合在一起。

1. 組成：

   • rRNA：核醣體的大部分質量來自 rRNA。rRNA 不僅提供結構支架，還具有催化肽鍵形成 (peptidyl transferase activity) 的功能，因此核醣體被認為是一種核酶 (ribozyme)。
   • 蛋白質：核醣體蛋白質 (ribosomal proteins) 參與 rRNA 的摺疊、穩定核醣體結構，並協助 mRNA 和 tRNA 與核醣體結合，以及肽鏈的延伸。

2. 結構（以原核和真核生物為例）：

   • 原核生物的核醣體：
     • 總體：70S (Svedberg unit，衡量沉降係數)
     • 小亞基：30S (包含 16S rRNA 和約 21 種蛋白質)
     • 大亞基：50S (包含 23S rRNA, 5S rRNA 和約 34 種蛋白質)
   • 真核生物的核醣體：
     • 總體：80S
     • 小亞基：40S (包含 18S rRNA 和約 33 種蛋白質)

細胞膜中的蛋白質扮演著多樣化的角色，它們嵌入或附著在脂質雙層中，負責實現細胞膜的各種功能。這些蛋白質的位置和功能與它們的結構和與脂質雙層的相互作用方式密切相關。

核心觀念：膜蛋白質的分類、定位與功能。

解題過程：
膜蛋白質可以根據其與脂質雙層的相互作用方式，大致分為兩類：周邊蛋白質 (Peripheral proteins) 和整合蛋白質 (Integral proteins)。

1. 整合蛋白質 (Integral Proteins)：
   • 位置：這些蛋白質的疏水性區域嵌入脂質雙層內部，與脂質的疏水性尾部相互作用。親水性區域則暴露在細胞膜的細胞質面或細胞外環境。它們通常難以從膜中分離出來，需要使用去垢劑 (detergents) 來破壞脂質雙層才能提取。
   • 功能：
     • 通道蛋白質 (Channel proteins)：形成允許特定離子或小分子通過膜的親水性通道。例如，離子通道 (ion channels)。
     • 載體蛋白質 (Carrier proteins)：與特定分子結合，改變構象以將分子跨膜運輸。例如，葡萄糖轉運蛋白 (glucose transporter)。
     • 受體蛋白質 (Receptor proteins)：結合細胞外的信號分子（如激素、神經傳導物質），將信號傳遞到細胞內部，啟動細胞反應。
     • 酶 (Enzymes)：催化膜相關的化學反應。

此題探討肝臟細胞中葡萄糖-6-磷酸酶 (glucose-6-phosphatase) 的重要性。這個酶在肝臟的糖質新生 (gluconeogenesis) 和肝醣分解 (glycogenolysis) 過程中扮演關鍵角色，其作用是釋放葡萄糖進入血液循環，以維持血糖穩定。

核心觀念：葡萄糖-6-磷酸酶在肝臟代謝中的作用。

解題過程：

1. 葡萄糖代謝的特殊性：

   • 葡萄糖是細胞主要的能量來源。當葡萄糖進入細胞後，通常會被磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸 (glucose-6-phosphate, G6P)。
   • 磷酸化反應（由己糖激酶 Hexokinase 或葡萄糖激酶 Glucokinase 催化）是不可逆的，它將葡萄糖「捕獲」在細胞內，並為後續的代謝途徑（如糖解作用 glycolysis、肝醣合成 glycogen synthesis）做準備。

2. 肝臟在血糖調節中的角色：

   • 肝臟是維持血糖穩定的關鍵器官。當血糖濃度下降時（如禁食期間），肝臟通過兩種主要途徑釋放葡萄糖到血液中：
     • 肝醣分解 (Glycogenolysis)：分解儲存在肝臟中的肝醣，產生 G6P。
     • 糖質新生 (Gluconeogenesis)：從非醣類前驅物（如胺基酸、乳酸、甘油）合成葡萄糖，產物也是 G6P。

在無氧條件下，肌肉細胞為了持續提供能量，主要依賴糖解作用 (glycolysis) 來產生 ATP。然而，糖解作用的進行需要 NAD⁺ 作為輔酶，而無氧條件下，通過氧化磷酸化產生 NAD⁺ 的途徑受阻。因此，肌肉細胞發展出特殊的機制來再生 NAD⁺。

核心觀念：無氧糖解作用與乳酸發酵。

解題過程：

1. 糖解作用 (Glycolysis)：

   • 在有氧或無氧條件下，葡萄糖都會通過糖解作用分解為丙酮酸 (pyruvate)。
   • 這個過程產生少量 ATP (淨生成 2 個 ATP/葡萄糖) 和 NADH。
   • 糖解作用的反應式中有一個關鍵步驟：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 催化甘油醛-3-磷酸氧化並將 NAD⁺ 還原為 NADH。
   • 反應：Glyceraldehyde-3-phosphate + NAD⁺ + Pi → 1,3-Bisphosphoglycerate + NADH + H⁺

2. 無氧條件下的問題：

   • 在無氧條件下，細胞無法通過粒線體內的電子傳遞鏈 (electron transport chain) 和氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation) 來氧化 NADH，將其還原回 NAD⁺。
   • 如果細胞質中的 NAD⁺ 被 NADH 耗盡，糖解作用將無法繼續進行，因為需要 NAD⁺ 作為甘油醛-3-磷酸脫氫酶的輔酶。

膽固醇 (Cholesterol) 的生物合成是一個複雜的多步驟過程，起始於乙醯輔酶 A (acetyl-CoA)。整個過程可以分為五個主要階段。

核心觀念：膽固醇合成途徑的各個階段及其關鍵產物。

解題過程：
膽固醇的生物合成主要發生在肝臟的細胞質和內質網中，涉及約 30 多個步驟。

第一階段：乙醯輔酶 A 轉化為甲羥異戊烯焦磷酸 (mevalonate)

• 起始物：乙醯輔酶 A (acetyl-CoA)。
• 關鍵步驟：
  1. 兩個乙醯輔酶 A 分子縮合形成乙醯乙醯輔酶 A (acetoacetyl-CoA)。
  2. 乙醯乙醯輔酶 A 與第三個乙醯輔酶 A 分子縮合，形成 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A (HMG-CoA)。
  3. HMG-CoA 被還原為甲羥異戊烯焦磷酸 (mevalonate)。這是膽固醇合成的限速步驟 (rate-limiting step)，由 HMG-CoA 還原酶 (HMG-CoA reductase) 催化，該酶是藥物他汀類 (statins) 的作用靶點。
• 產物：Mevalonate (6 碳)。

第二階段：甲羥異戊烯焦磷酸 (mevalonate) 轉化為異戊二烯焦磷酸 (isopentenyl pyrophosphate, IPP) 和二甲基烯丙焦磷酸 (dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)

• 起始物：Mevalonate。
• 關鍵步驟：Mevalonate 經過三次磷酸化，然後脫羧 (decarboxylation)，最終生成 5 碳的異戊烯焦磷酸 (IPP)。IPP 可以異構化為 DMAPP。
• 產物：IPP 和 DMAPP (都是 5 碳單位)。

第三階段：三個異戊二烯焦磷酸 (IPP) 單位縮合形成角鯊烯 (squalene)

• 起始物：IPP 和 DMAPP。
• 關鍵步驟：

此題考驗對限制酶 (restriction enzyme) 的作用機制、DNA 甲基化 (DNA methylation) 的影響以及凝膠電泳 (gel electrophoresis) 結果判讀的理解。限制酶 HpaI 的識別序列是 CCGG，其切割行為受胞嘧啶殘基上的甲基化影響。

核心觀念：限制酶 HpaI 的特異性、DNA 甲基化對限制酶切割的影響、凝膠電泳判讀。

解題過程：

1. 理解限制酶 HpaI 的特性：

   • 識別序列：HpAI 識別 5'-CCGG-3' 序列。
   • 切割條件：它只會切割未被甲基化的 5'-CCGG-3' 序列。如果 5' 或 3' 端任何一個胞嘧啶 (cytosine) 殘基被甲基化（通常是 CpG 區域的胞嘧啶被甲基化，形成 5-methylcytosine），HpAI 則無法切割。

2. 理解 DNA 甲基化：

   • DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的一種形式，在真核生物和原核生物中都存在，但其模式和功能有所不同。
   • 在哺乳動物 (如小鼠 Mouse) 中，胞嘧啶甲基化主要發生在 CpG 二核苷酸上，這與基因調控和染色質結構有關。
   • 在果蠅 (Drosophila) 中，DNA 甲基化相對較少，或以不同的形式存在。
   • 在細菌 (如 E. coli) 中，DNA 甲基化通常是細菌自身的識別修飾系統 (restriction-modification system) 的一部分，用於區分自身 DNA 和外源 DNA，或用於調控基因表達。細菌的甲基化模式通常與真核生物不同。

3. 分析凝膠電泳結果：

   • 凝膠電泳用於分離不同大小的 DNA 片段。較大的 DNA 片段移動較慢，在凝膠頂部；較小的 DNA 片段移動較快，在凝膠底部。
   • 圖中顯示了三種生物（小鼠 Mouse, 果蠅 Drosophila, 大腸桿菌 E. coli）的基因組 DNA 經過 HpaI 酶切後，在凝膠電泳上的結果。
   • 分子量標記 (> 50 kb, 100 bp) 顯示了 DNA 片段的大小範圍。

4. 解釋各生物的電泳圖譜：

   • 小鼠 (Mouse)：
     • 圖譜顯示，HpaI 處理後，DNA 形成了非常大的片段，大部分集中在 > 50 kb 的區域，幾乎沒有觀察到小片段。
     • 解釋：這表明小鼠的基因組 DNA 中，5'-CCGG-3' 位點大多被甲基化了。因此，HpaI 酶無法有效切割這些位點，大部分 DNA 保持完整的長鏈狀態。這與哺乳動物中 CpG 區域廣泛的 DNA 甲基化情況一致。
   • 果蠅 (Drosophila)：
     • 圖譜顯示，HpaI 處理後，DNA 被切割成多個大小不一的片段，其中有一些明顯小於 50 kb，並有明顯的條帶分佈在 100 bp 附近。這表示 DNA 被切割成了許多中等大小和較小大小的片段。

核心觀念

本題考查兩種蛋白質分析技術的故障判讀：

1. SDS-PAGE：利用 SDS 使蛋白質變性並帶有近似相同比例的負電荷，再依分子量分離；電泳後需以 Coomassie brilliant blue 染色，並以 destaining 去除背景。
2. Western blotting：蛋白質先轉印至 nitrocellulose membrane，再經 blocking、primary antibody、enzyme-conjugated secondary antibody，最後加入 NBT/BCIP 顯色。鹼性磷酸酶會催化 NBT/BCIP 形成不溶性有色沉澱。

判讀故障時，先觀察：

• 只有樣品不見，還是整片膜／膠都變色。
• MW marker 是否可見。
• 預期出現 β-galactosidase 的樣品位置是否正確。

解題方法

SDS-PAGE 部分已知樣品準備與上樣正確，因此問題集中在：

• 染色是否完成。
• 脫色是否完成。
• 電泳或樣品處理是否異常。

Western blotting 部分已知蛋白量相同且轉印成功，因此問題集中在：

• blocking。
• 抗體反應。
• NBT/BCIP 顯色步驟。

β-galactosidase 應在粗萃取液與純化後的相應蛋白分畫中出現；因此預期圖可作為判斷各組樣品帶是否正常的依據。

SDS-PAGE：Group 1

Problem

Coomassie 染色後未充分 destaining，或 destaining 步驟進行錯誤。

Evidence

Group 1 的整片膠呈現非常深的背景，蛋白質條帶與背景對比極低，無法清楚辨認預期的蛋白質分布。

Explanation

Coomassie 會同時染色蛋白質與膠體背景。正確 destaining 可洗去未與蛋白質結合的染劑，使背景變淡，而蛋白質條帶保留較深顏色。因此可重新建立蛋白質條帶與背景之間的對比，得到接近 expected results 的圖形。

SDS-PAGE：Group 2

Problem

忘記加入 Coomassie 染色，或染色步驟完全失敗。

Evidence

只有 MW standards 可見，所有樣品泳道均沒有蛋白質條帶。MW marker 通常為預染 marker，即使未經 Coomassie 染色也能直接顯色。

Explanation

Coomassie 會與蛋白質結合，使樣品中的各種蛋白質形成可見條帶。補做正確染色並充分 destaining 後，CL、CL-S、CL-P、AS-S 與 AS-P 中的蛋白質分布即可顯現。

Western blotting：Group 3

Problem

忘記 blocking，或 blocking 不完全。

Evidence

整片 nitrocellulose membrane 幾乎均勻呈深色，背景非常高，無法區分特異性蛋白質條帶。

Explanation